利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備抗甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白Fab小分子抗體

1、    利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備抗甲狀旁腺激素 相關(guān)蛋白 Fab 小分子抗體        【摘要】目的利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備抗甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)Fab 抗體。方法從經(jīng)PTHrP免疫的Balb/C小鼠脾細(xì)胞提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增一組g輕鏈和重鏈Fab段基因，插入噬菌體載體pComb3，構(gòu)建了抗PTHrP Fab抗體基因庫。用合成短肽和重組PTHrP對(duì)抗體庫進(jìn)行了富集篩選，獲得鼠源抗PTHrP F

2、ab 段基因后，進(jìn)一步在大腸埃希菌表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的特異性作了鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建了抗PTHrP抗體基因庫，且篩選到PTHrP特異的鼠源單抗Fab段基因。結(jié)論所獲得的Fab抗體能特異性地識(shí)別PTHrP抗原?！局黝}詞】甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白；表達(dá)；大腸埃希菌；噬菌體呈示；Fab段 Generation of monoclonal antibody Fab fragments to parathyroid hormone related protein by phage display technologyDOU Liqiang LIANG MifangAN Nailiet al（Institute

3、 of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052,China）【Abstract】ObjectiveTo develop monoclonal antibody Fab fragments using display technique.Methods The mouse IgG Fab genes of heavy and light chains were amplified from spleen cells of a parathyroid hormone-relaed protein(PTHrP)

4、 immunized mouse.The combinatorial phage antibody library was prepared by inserting both heavy and light chain Fab genes into phagemid vector pComb3 and followed by infection of helper phage. The library was selected by purified recombinant PTHrP.ResultsThe combinatorial phage antibody library was c

5、onstructed successfully and the specific mouse Fabs to PTHrP were delected and expressed in E.coli.ConclusionThe selected specific mouse Fabs can recognize PTHrP with high specificity.【Key words】Parathyroid hormone-related protein;Expression;E.coli.;Phage display;Fab fragment惡性高鈣血癥是腫瘤病人常伴有的癥狀，甲狀旁腺激素

6、相關(guān)蛋白(Parathyroid hormone related protein, PTHrP)是引起這一現(xiàn)象的原因1。近年來發(fā)現(xiàn)PTHrP的過量表達(dá)與腫瘤骨轉(zhuǎn)移的病理過程有關(guān)，如PTHrP在乳腺癌細(xì)胞株MDA-231中的高表達(dá)可以增加乳癌溶骨性破壞的發(fā)生，而應(yīng)用抗-PTHrP的單克隆抗體可明顯地減少動(dòng)物模型中腫瘤溶骨性骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生2，3，可見用單克隆抗體阻抑PTHrP的活性對(duì)治療惡性腫瘤的骨轉(zhuǎn)移很有希望。但是，用常規(guī)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得的單抗穩(wěn)定性差，長期傳代后基因易丟失，制備成本亦較高。運(yùn)用噬茵體表面呈現(xiàn)技術(shù)(Phage dispiay)構(gòu)建噬菌體抗體庫直接獲得鼠源基因工程單克隆抗體，耗時(shí)短

7、，耗費(fèi)小，從建立的抗體庫中可以獲得任意目的單抗，容易獲得高親和力的中和單抗，能在基因水平改進(jìn)抗體的特異性和親和力，并能控制抗體的表達(dá)水平4。我們利用噬菌體抗體庫技術(shù)獲得了抗-PTHrP鼠源Fab抗體基因，并在大腸埃希菌中得到表達(dá)。1材料和方法1.1質(zhì)粒和菌株大腸埃希菌XLI-Blue購自美國Stratagene，載體pComb3由美國Scripps研究所惠贈(zèng)。1.2抗原的制備及免疫根椐氨基酸序列資料5合成了PTHrP與受體結(jié)合功能區(qū)PTHrP(14-36)。重組PTHrP表達(dá)菌株pET-3a/PTHrP由病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建6，表達(dá)產(chǎn)物形成包涵體。將包涵體純化后溶于樣品緩沖液，上樣到

8、制備型SDS-PAGE(15%)。電泳結(jié)束后把凝膠浸泡在預(yù)冷的0.1 mol/L KCl中染色35 min后，切下所需片段，放入透析袋，電洗脫過夜，經(jīng)透析濃縮每次50 g腹腔注射Balb/C小鼠兩次，取脾前3 d用同樣劑量的抗原尾靜脈注射作加強(qiáng)免疫。1.3鼠IgG Fab基因的擴(kuò)增采用TRIZOL試劑盒提取脾細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo dT 為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用一組小鼠IgG Fab 重鏈和輕鏈的引物7，PCR擴(kuò)增小鼠IgG輕鏈和重鏈Fab段基因。反應(yīng)條件為：94 1 min,52 1 min,722 min,共35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10 min。1.4噬菌體抗體庫的建立將不同引

9、物合成的PCR產(chǎn)物按重鏈和輕鏈分別混合，然后將重鏈基因插入質(zhì)粒pComb3的Spe 和Xho 酶切位點(diǎn)之間，將輕鏈基因插入Xba 和Sac 位點(diǎn)之間，電轉(zhuǎn)XLI-Blue菌。加入2 ml SOC培養(yǎng)液，37振蕩培養(yǎng)1 h.然后轉(zhuǎn)入三角瓶，加入10 ml SB-A+(含有20 g/ml氨芐青霉素)，37培養(yǎng)1 h。再加入100 ml新鮮SB-A+，371 h后，加入1012PFU的輔助噬菌體VSC M13，繼續(xù)在37培養(yǎng)過夜，收集上述細(xì)菌培養(yǎng)上清，用4%PEG(相對(duì)分子量 8 000)和3%NaCl沉淀噬菌體，重懸于PBS(pH7.2)，分裝小管存放于-20。1.5噬菌體抗體庫的富集篩選將重組P

10、THrP抗原或合成的短肽用0.1 mol/L pH8.6碳酸氫鈉稀釋后包被96孔板(25 g/ml),用5%脫脂奶-PBS封閉。每孔加入50 l噬菌體抗體庫，37孵育2 h，用TBS洗20次。最后每孔加入50 l甘氨酸-鹽酸(pH2.2)洗脫。感染2 ml新鮮制備的XLI-Blue菌，經(jīng)輔助噬菌體VCS M13感染后進(jìn)行下一輪篩選。如此重復(fù)5輪篩選后，隨機(jī)挑選10個(gè)克隆鑒定插入效率。1.6Fab抗體在原核細(xì)胞中的可溶性表達(dá)選擇陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA。取 1 g質(zhì)粒用Spe 和Nhe 酶切消化去除基因g ，再將質(zhì)粒自身連接，轉(zhuǎn)化XLI-Blue。取上述菌種接種4 ml SB-A+培養(yǎng)液，37過

11、夜培養(yǎng)后，150轉(zhuǎn)種50 ml SB培養(yǎng)液，37培養(yǎng)至吸光度A值(600 nm)為0.2時(shí)加入1 mmol/L IPTG,30培養(yǎng)約1012 h，離心后用1/10體積PBS(pH7.4)重懸細(xì)菌沉淀，反復(fù)凍融3次。離心的上清即含有表達(dá)的可溶性Fab抗體。1.7抗PTHrP Fab抗體體外生物學(xué)活性的鑒定。1.7.1ELISA用抗 PTHrP單抗0.1 g包被96孔板，加入0.5 g電泳純化的PTHrP蛋白，再依次加入重組鼠Fab抗體和HRP標(biāo)記的抗鼠Fab抗體。顯色底物為OPD，在490 nm檢測(cè)每孔A值。1.7.2Western blot在Bio-Rab電轉(zhuǎn)儀上將SDS-PAGE分離的PTH

12、rP蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜，10%脫脂奶4封閉過夜后，加重 組鼠Fab抗體，室溫1.5 h后，加酶標(biāo)記的羊抗鼠Fab，最后加底物避光顯色。1.7.3生物學(xué)活性檢測(cè)ROS17/2.8細(xì)胞消化后種入24孔板培養(yǎng)板，37孵育24 h后換成含2%FCS的F12培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組均加入20 ng/ml的 PTHrP純品，同時(shí)按以下濃度加入重組Fab單克隆抗體：20，10，5，2，0 g/ml，對(duì)照組不加PTHrP和抗體，繼續(xù)培養(yǎng)30 h后。加入H3-TdR l Ci/孔，作用6 h終止反應(yīng)，微孔濾膜(0.45 m)收集細(xì)胞，置液閃瓶計(jì)數(shù)。2結(jié)果2.1鼠源抗PTHrP抗體基因床的建立從PTHrP

13、蛋白免疫的Balb/C小鼠脾臟分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用一組鼠IgG Fab基因的引物，擴(kuò)增了鼠IgG重鏈Fd和輕鏈基因。1顯示經(jīng)純化后的不同輕、重鏈PCR產(chǎn)物，約700 bp左右。分別將輕鏈和鏈PCR產(chǎn)物，重鏈PCR產(chǎn)物混合后，分別在Xba /Sac 或 Xho /Spe 位點(diǎn)克隆入噬菌體載體pComb3，加輔助噬菌體VCSMl3感染后噬菌體抗體基因庫。重組質(zhì)粒的構(gòu)建見2。     1PCR擴(kuò)增鼠源IgG Fab輕、重鏈基因Fig.1PCR amplification of the light and heavy chainFa

14、b genes of mouse IgG1:Mixed light chains.2-6:Mixed heavy chains IgG 1.7-8:Mixed heavy chains IgG2a/2b2.2鼠源抗PTHrP抗體基因庫的富集篩選采用純化重組PTHrP蛋白和合成的PTHrP功能區(qū)短肽，對(duì)上述建立的鼠源抗PTHrP抗體基因庫進(jìn)行了五輪富集篩選。每輪隨機(jī)取30個(gè)克隆作ELISA分析，特異性抗PTHrP的陽性克隆比例逐輪增加。至第五輪陽性率達(dá)72%。我們對(duì)第五輪隨機(jī)篩選的10個(gè)克隆進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切鑒定分析，用Xba/Xho 酶切后，有9個(gè)克隆顯示有重鏈和輕鏈基因的插入(可切下約2.2

15、kb的片段)(3)。     2Fab基因在噬菌體質(zhì)粒pComb3的插入位點(diǎn)Fig.2Insertion site of Fab genes on pComb3 phagemid     M: DNA/Hind ;110:隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆3富集篩選抗體庫中隨機(jī)挑選克隆的內(nèi)切酶分析Fig.3Restriction enzyme analysis of the clones randomly selected from the antibody library after panningM:DNA/Hind mar

16、ker.1-10:Randomly selected clones2.3鼠源抗PTHrP IgG Fab抗體的可溶性表達(dá)及鑒定從陽性克隆中選出1個(gè)克隆作進(jìn)一步研究。首先如方法中所述去除載體中的噬菌體外殼蛋白的基因g，變?nèi)诤系鞍诪楠?dú)立表達(dá)的可溶性Fab蛋白。然后對(duì)陽性克隆感染細(xì)胞的裂解上清進(jìn)行特異性的鑒定。ELISA結(jié)果表明所獲得的表達(dá)產(chǎn)物能與PTHrP抗原特異結(jié)合，并可被抗 鼠IgG Fab抗體所識(shí)別。Western blot 結(jié)果也同樣證明了這一點(diǎn)(4)。用H3摻入法在ROS17/2.8細(xì)胞測(cè)定生物學(xué)活性的結(jié)果見5。一定濃度的Fab抗體可顯著抑制cAMP水平升高，并呈較好的劑量依賴關(guān)系，當(dāng)F

17、ab的濃度達(dá)50 g時(shí)，ROS17/2.8細(xì)胞H3的摻入量與對(duì)照組接近，表明它完全中和了PTHrP的活性，說明我們研制的重組Fab抗體可在體外阻斷PTHrP的活性。3討論P(yáng)THrP在介導(dǎo)腫瘤骨轉(zhuǎn)移中充當(dāng)十分重要的角色。這主要體現(xiàn)在介導(dǎo)腫瘤至少是乳腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展；調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長；充當(dāng)腫瘤細(xì)胞的生長因子。在人類幾種常見的腫瘤中尤其以乳癌、前列腺癌和肺癌發(fā)生率較高，有統(tǒng)計(jì)在乳癌，大約70%的病人伴隨著骨轉(zhuǎn)移，且該類骨轉(zhuǎn)移的主要病理特征為溶骨性破壞8，所以，研究PTHrP與腫瘤骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系主要集中在乳癌。近年來，運(yùn)用免疫化、原位雜交和 RT-PCR 方法皆證明了發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的乳癌標(biāo)本中

18、PTHrP的表達(dá)量比無轉(zhuǎn)移的病人明顯增高，意味著PTHrP在乳癌骨轉(zhuǎn)移中具有重要的作用9-11。有研究表明在一些乳癌細(xì)胞株中存在著PTHrP受體的表達(dá)。用抗PTHrP的單克隆抗體可明顯減少裸鼠骨轉(zhuǎn)移模型中溶骨性骨轉(zhuǎn)移發(fā)生12，說明利用單克隆抗體治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移是可行的。     4Western blot檢測(cè)鼠Fab抗體對(duì)重組PTHrP的特異性結(jié)合Fig.4Specific antigen binding activity to expressedFab antibody detected by Western blotA：Negative control

19、.B:Recombinant PTHrP     5用3H摻入法檢測(cè)鼠Fab抗體中和重組PTHrP的能力Fig.5Neutralization of PTHrP bioligocalactivity by recombinant mouse Fab antibody噬菌體表面表達(dá)技術(shù)始于1985年，近年來發(fā)展日趨成熟，已在各個(gè)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。其特點(diǎn)是通過特異性富集篩選，可以從基因庫中擴(kuò)增出本來為數(shù)稀少的特異性基因。pComb3表達(dá)篩選系統(tǒng)是一個(gè)用于篩選高親和力抗體的系統(tǒng)4。本文獲得的抗PTHrP抗體Fab段基因，在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物Fab抗體對(duì)

20、PTHrP有較強(qiáng)的特異性和中和活性。由于我們已經(jīng)獲得這株鼠中和單抗的基因，可以在基因水平進(jìn)一步改進(jìn)，從而獲得更高親和力的抗體。本文獲863高技術(shù)課題資助(102-08-01-03)作者單位：鈄理強(qiáng)（北京，北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科研究所100034）郭應(yīng)祿（北京，北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科研究所100034）梁米芳（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所）安乃莉（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所）姚立紅（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所）張智清（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所）參考文獻(xiàn)1，Philbrick WM, Wysolmerski JJ, Galbraith S, et al. Definin

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