青霉素生產(chǎn)工藝過程

1、青霉素生產(chǎn)工藝過程一、青霉素的發(fā)酵工藝過程1、工藝流程（1）絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程 冷凍管（25C，抱子培養(yǎng)，7天）一一斜面母瓶（25C，抱子培養(yǎng)，7天）一一 大米抱子（26C，種子培養(yǎng)56h,1:1.5vvm ）一級種子培養(yǎng)液（27C,種子 培養(yǎng)，24h,1:1.5vvm）二級種子培養(yǎng)液（2726C ,發(fā)酵,7 天,1:0.95vvm ） 發(fā)酵液。（ 2）球狀菌二級發(fā)酵工藝流程冷凍管（25 T，抱子培養(yǎng)，68天）一一親米（25 E，抱子培養(yǎng)，810天）一一 生產(chǎn)米（28C，抱子培養(yǎng)，5660h,1:1.5vvm ） 種子培養(yǎng)液（2625-24°C, 發(fā)酵，7天，1: 0.8vvm）

2、發(fā)酵液。2、工藝控制（ 1 ）影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素基質(zhì)濃度： 在分批發(fā)酵中， 常常因為前期基質(zhì)量濃度過高， 對生物合成酶系 產(chǎn)生阻遏（或抑制）或?qū)z生長產(chǎn)生抑制（如葡萄糖和錢的阻遏或抑制，苯乙 酸的生長抑制） ，而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成， 為了避免這一 現(xiàn)象，在青霉素發(fā)酵中通常采用補料分批操作法， 即對容易產(chǎn)生阻遏、 抑制和限 制作用的基質(zhì)進行緩慢流加以維持一定的最適濃度。 這里必須特別注意的是葡萄 糖的流加， 因為即使是超出最適濃度范圍較小的波動， 都將引起嚴重的阻遏或限 制，使生物合成速度減慢或停止。目前 , 糖濃度的檢測尚難在線進行 , 故葡萄糖 的流加不是依據(jù)糖濃度控制

3、，而是間接根據(jù)pH值、溶氧或CQ釋放率予以調(diào)節(jié)。（2）溫度： 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別，但一般 認為應(yīng)在25C左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率，同時增加葡萄糖的維持消 耗，降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。 對菌絲生長和青霉素合成來說， 最適溫度不 是一樣的 , 一般前者略高于后者 , 故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的 溫度，以縮短生長時間 , 到達生產(chǎn)階段后便適當降低溫度， 以利于青霉素的合成。（3）pH值：青霉素發(fā)酵的最適pH值一般認為在6.5左右,有時也可以略高或略低一些，但應(yīng)盡量避免pH值超過7.0,因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定,容 易加速其水解。在緩沖能力較弱

4、的培養(yǎng)基中 , pH 值的變化是葡萄糖流加速度高 低的反映。過高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使pH值降低；過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起pH值上升。（4）溶氧： 對于好氧的青霉素發(fā)酵來說，溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重 要因素。當溶氧濃度降到 30%飽和度以下時 , 青霉素產(chǎn)率急劇下降 , 低于 10%飽 和度時 , 則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高，說明菌絲生長不良或加糖率過低， 造成呼吸強度下降 , 同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。 溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一 個動態(tài)平衡點 , 而氧消耗與碳能源消耗成正比 , 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流

5、 加控制的一個參考指標。（ 5）菌絲濃度： 發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度 , 從而使氧 傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達到平衡。 青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度 隨菌株的呼吸強度 （取決于維持因數(shù)的大小 , 維持因數(shù)越大 , 呼吸強度越高 ） ，發(fā) 酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學性質(zhì)而異。 呼吸強度低的菌株降低發(fā)酵中氧的 消耗速率，而通氣與攪拌能力強的發(fā)酵罐及黏度低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率 上升 , 從而提高臨界菌體濃度。（ 6）菌絲生長速度： 用恒化器進行的發(fā)酵試驗證明，在葡萄糖限制生長的條件 下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關(guān)系。 當比生長速 率低于

6、 0.015h-1 時，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比 , 當比生長速率高于 O.015h-1 時, 比生產(chǎn)速率與比生長速率無關(guān)。因此，要在發(fā)酵過程中達到并維 持最大比生產(chǎn)速率 , 必須使比生長速率不低 0.015h-1 。這一比生長速率稱為臨 界比生長速率。對于分批補料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來說 , 維持 0.015h-1 的臨界比生 長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍 , 這在實際工業(yè)生產(chǎn)中 是很難實現(xiàn)的。 事實上，青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理 論臨界值低得多 , 卻仍然能達到很高的比生產(chǎn)速率。 這是由于工業(yè)上采用的補料 分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶 , 抵

7、消了一部分生長 , 故雖然表觀比生長速 率低 , 但真比生長速率卻要高一些。（ 7）菌絲形態(tài)： 在長期的菌株改良中，青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要 呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。 前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基 質(zhì)及氧接觸 , 故一般比生產(chǎn)速率較高； 后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低 , 使氣 - 液兩相間氧的傳遞速率大大提高 , 從而允許更多的菌絲生長 （ 即臨界菌體濃度 較高 ）, 發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。在絲狀菌發(fā)酵中， 控制菌絲形態(tài)使其保持適當?shù)姆种Ш烷L度 , 并避免結(jié)球， 是 獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中 , 使菌絲球保持適當大小和松緊， 并盡量減少游離菌絲

8、的含量 , 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。 這種形態(tài) 的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強度及比生長速率密切相關(guān)。3、工藝控制要點（ 1）種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、 葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上，25 C培養(yǎng)7天，真空干燥并以這種 形式保存?zhèn)溆谩?生產(chǎn)時它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、 玉米漿、 尿素為主 的種子罐內(nèi),26 C培養(yǎng)56h左右,菌絲濃度達6%-8%,菌絲形態(tài)正常,按10%-15%勺接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級種子罐內(nèi) ，27 C培養(yǎng) 24h,菌絲體積10%-12%,形態(tài)正常,效價在700D/ml左右便可作

9、為發(fā)酵種子。球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子孢子經(jīng)混有 O. 5% -1. 0 % 玉米漿的三角瓶培 養(yǎng)原始親米孢子 ， 然后再移人羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米抱子 （ 又稱生產(chǎn)米 ）， 親米和 生產(chǎn)米均為25 C靜置培養(yǎng),需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 3-4天,大米 表面長出明顯小集落時要振搖均勻 ， 使菌絲在大米表面能均勻生長 ， 待 10 天 左右形成綠色孢子即可收獲。 親米成熟接人生產(chǎn)米后也要經(jīng)過激烈振蕩才可放置 恒溫培養(yǎng) ， 生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米 300萬只以上。 親米、生產(chǎn)米子孢子都需 保存在5 C冰箱內(nèi)。工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米 （ 指收獲后的孢瓶在 10天以內(nèi)使用） 接人含有花生餅 粉、

10、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi) ，28 C 培養(yǎng) 50-60h 當 pH 值由6. 0-6. 5 下降至5.5-5. 0,菌絲呈菊花團狀，平均直徑在100- 130卩m,每毫升的球數(shù)為 6 萬 -8 萬只， 沉降率在 85% 以上， 即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在 8000-11000只/ml范圍的要求，計算移種體積，然后接入發(fā)酵罐，多余的種子 液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳 , 其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子， 能使青霉素 發(fā)酵單位的罐批差異減少。（2）培養(yǎng)基成分的控制a. 碳源 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、 蕉糖、葡萄糖等。 目前生產(chǎn)上普遍 采用的是淀粉水解糖、糖化液 （DE 值 50%

11、以上） 進行流加。b. 氮源 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補加無機氮源（硫酸氨、 氨水或尿素）。c. 前體 生物合成含有芐基基團的青霉素 G， 需在發(fā)酵液中加人前體。 前體可用 苯乙酸、苯乙酰胺 ， 一次加入量不大于 0.1%， 并采用多次加入 ， 以防止前體對 青霉素的毒害。d. 無機鹽加人的無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等 ， 且用量要適度。另外 ， 由 于鐵離子對青霉菌有毒害作用 ， 必須嚴格控制鐵離子的濃度 ， 一般控制在 30卩 g/ml o（3）發(fā)酵培養(yǎng)的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH 值確定 ， 最好是 根據(jù)排氣中 CO2 量及 O2

12、量來控制， 一般在殘?zhí)墙抵?0.6% 左右， pH 值上升時 開始加糖。b. 補氮及加前體 補氮是指加硫酸銨、氨水或尿素 ， 使發(fā)酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%，補前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 0.05%-0.08% 。 -c. pH 值控制 對 pH 值的要求視不同菌種而異 ， 一般為 pH 6.4-6.8， 可以補加葡萄糖來控制。目前一般采用加酸或加堿控制 pH值。d.溫度控制 前期2 5- 2 6 C,后期23 C ,以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。e.溶解氧的 控制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的 30% 。通風比一般為 1 : 0. 8L/(L ? mi

13、n), 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。f. 泡沫的控制 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫 , 可以用天然油脂 , 如豆油、玉米油 等或用化學合成消泡劑 " 泡敵 " 來消泡 , 應(yīng)當控制其用量并要少量多次加入 , 尤其在發(fā)酵前期不宜多用 , 否則會影響菌體的呼吸代謝g. 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣 , 用顯微鏡觀察菌絲形 態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱 " 鏡檢 ", 根據(jù)" 鏡檢 " 中菌絲形變化和代謝變 化的其他指標調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度 , 通過追加糖或補加前體等各種措施來延長發(fā)酵時 間, 以獲得最多青霉素。 當菌絲中空泡擴大、增多及延伸 , 并出現(xiàn)個別自溶