基因克隆步驟完整版

1、1 總 RNA 提取(1) 液氮研磨或冰上勻漿實(shí)驗(yàn)材料；先將1mlTrizol加到離心管中待用(2) 將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5min；打開離心機(jī)預(yù)冷(3)加200ilL氯仿，振蕩15sec,室溫放置3min,分層；(4) 4oC，12,000g，離心15min；(5)取上清，加500異丙醇，混勻，室溫放置10min；(6) 4oC，12,000g，離心10min；(7) 棄上清，加1mL75%乙醇，漂浮洗滌沉淀，振蕩充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，離心5min；(9)棄上清，離心，用槍吸取多余液體，放在超凈臺(tái)里十燥后，加50nLDEPC水，80oC保存

2、。此操作中所用到的器皿均需經(jīng)過DEPC滅活RNA酶處理。提取的總RNA需經(jīng)RNA電泳檢測質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測定濃度。OD260值為核酸的吸收值，OD280值為蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0間一般說明該核酸蛋白含量在允許的范圍內(nèi)，可正常使用；此外還有OD230值為多糖和酚類的吸收值，比較干凈的核酸OD260/230值能達(dá)到2.2左右。RNA濃度計(jì)算公式：總RNA濃度(g/mL)=A260X稀釋倍數(shù)X40。4 基因克隆及測序2反轉(zhuǎn)錄/cDNA第一鏈的合成純化RNA以去除基因組DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentwithgDNAErase

3、r(PerfectRealTime)說明書進(jìn)行。其體系為：TotalRNA1 W L補(bǔ)齊至10 ii L5xgDNAEraserBuffergDNAEraserRNaseFreedHO2條件為：42oC，2min；RNA純化后，即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。其體系為：5xPrimeScriptBuffer2(forRealTime)PrimeScriptRTenzymemixIRT Primer Mix上一步的反應(yīng)液RNase Free dH2O操作條件為：(1) 37oC 放置 15 min ； (2) 85oC，1 W L10|iL補(bǔ)齊至 i L205 sec ； (3) 4oC 保存。3PCR按TaK

4、aRa公司的PremixTaqVersion2.0操作，PCR反應(yīng)體系如下：PremixTaq25L模板51iL引物1(10川1|iL引物2(10wM)1|iLddH2O18PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min；94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)36次；72°C延伸10min。PCR反應(yīng)完畢，取5wL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（若割膠回收則用10wL反應(yīng)產(chǎn)物）4.1PCR產(chǎn)物切膠回收將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察并切下預(yù)期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的UniversalDN

5、APurificationKit割膠回收試劑盒進(jìn)行純化，步驟如下：(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500平衡液BL,13,400Xg離心1min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(2)按100mgagarose膠加入100L溶液PC,置于50oC中10min左右，中途混勻幾次，至膠完全融化；(3)將樣品倒入一個(gè)吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室溫下13,400Xg離心1min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600wL漂洗液PW(加乙醇)，室溫下13,400Xg離心1min，倒掉收集管中的廢液，吸附

6、柱CB2重新套回收集管中；(5)重復(fù)上一步驟；(6)將吸附柱CB2放入收集管中，室溫下13,400Xg離心2min,盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7)將柱子套入一新的滅菌1.5mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50wL洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,400xg室溫離心2min,收集到的洗脫液即為回收的DNA純化液；(8)取5ML的純化液體進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測量溶液中DNA含量。4.2 目的片段與載體連接(1) 膠回收產(chǎn)物與T載體連接體系，參考Takara公司pMD18-T載體的試劑盒說明書。在滅菌的0.5mL離心管中配制如下溶液(10wL):

7、回收DNA41LLLigationSolutionpMD18-TVector(2) 16oC反應(yīng)30分鐘，所得產(chǎn)物保存于4oC冰箱備用。4.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5民(1)將51iL連接產(chǎn)物加入到100wLE.coliDH5風(fēng)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管混勻內(nèi)容物，冰上靜置30min；o(2) 42C水浴熱激轉(zhuǎn)化90sec，立即放回冰上，放置3min；(3)每管加入500wLLB培養(yǎng)基(室溫放置)，37oC160-180rpm振蕩培養(yǎng)45-60min，使菌體復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因；(4)在含有Amp(100wg/mL)的選擇性平板上加入60-100L菌液，用無菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用Parafilm膜封好；(5)將培養(yǎng)皿正放，37oC約50min，待液體全部吸收后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)10-16h。4.4轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定(1)用無菌槍頭挑取LB平板上3-5個(gè)單菌落，分別接種到3.5mLLB液體培養(yǎng)基中(含100wg/mLAmp),37°C