蛋白質(zhì)組學(xué)生物信息學(xué)分析介紹

1、生物信息學(xué)分析 FAQCHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION 3什么是 GO？ 3GO 和 KEGG 注釋之前，為什么要先進行序列比對（ BLAST ）？ 3.GO 注釋的意義？ 3GO 和 GOslim 的區(qū)別 4為什么有些蛋白沒有 GO 注釋信息？ 4為什么 GO Level 2 的統(tǒng)計餅圖里蛋白數(shù)目和差異蛋白總數(shù)不一致？ 4.什么是差異蛋白的功能富集分析 &WHY ？ 4GO 注釋結(jié)果文件解析 5Sheet TopBlastHits 5Sheet protein2GO/protein2GOslim 5Sheet BP/MF/CC 6S

2、heet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC 6CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION 7WHY KEGG pathway annotation? 7KEGG 通路注釋的方法 & 流程？ 7KEGG 通路注釋的意義？ 7為什么有些蛋白沒有 KEGG 通路注釋信息？ 8什么是差異蛋白的通路富集分析 &WHY ？ 8KEGG 注釋結(jié)果文件解析 8Sheet query2map 8Sheet map2query 9Sheet TopMapStat 9CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECT

3、ION & CLUSTERING 10WHY Feature Selection? 10聚類分析(Clustering ) 10聚類結(jié)果文件解析10CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK12蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的意義 12蛋白質(zhì)相互作用 VS生物學(xué)通路？ 12蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果文件解析 122CHAPTER ONE about gene ontology annotation什么是GO ?隨著多種生物基因組的相繼解碼，同時大量ESTs以及gene expression profile date的積累，使得a

4、nnotation 的工作量和復(fù)雜度大大增加。然而另一方面，大多數(shù)基因在不同真核生物中擁有共同的主要生物功能，通過在某些物種中獲得的基因或者蛋白質(zhì)(shared protein )的生物學(xué)信息，可以用以解釋其他物種中對應(yīng)的基因或蛋白(especially incomparative genomics )。由于這些繁復(fù)的功能信息主要是包含在積累的文獻(xiàn)之中，如何有效的提取和綜合這些信息 就是我們面臨的核心困難，這也是 GO所要著力解決的問題。通過建立一套具有動態(tài)形式的控制字集(controlledvocabulary )，來解釋真核基因及蛋白在細(xì)胞內(nèi)所扮演的角色，并隨著生命科學(xué)研究的進步，不斷積累

5、和更新。一個 ontology 會被一個控制字集來描述并給予一定的名稱，通過制定"本體”并運用統(tǒng)計學(xué)方法及自然語言處理技術(shù)，可以實現(xiàn)知識管理的專家系統(tǒng)控制。到目前為止，Gene Ontology (GO)數(shù)據(jù)庫中有 3大獨立的 ontology : biological process 生物過程，molecular function 分子功能，cellular component細(xì)胞組分。而這三個 ontology下面又可以獨立出不同的亞層次，層層向下構(gòu)成一個ontologies 的樹型分支結(jié)構(gòu)?？梢哉f， GO是生物學(xué)的統(tǒng)一化工具。由于GO是一種整合性的分類系統(tǒng)，其下的 3類主ont

6、ology雖然說是獨立的，但是無論是GOC原初的設(shè)計還是我們的使用中其實都還是存在一定的流程關(guān)系。一個基因/蛋白質(zhì)或者一個ontology在注解的過程中，首先是考慮涉及在構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)的組分和元件(cellular component )，其次就是此組分/元件在分子水平上所行使的功能(molecularfunction )，最后能夠呈現(xiàn)出該分子功能所直接參與的生物過程( biological process )。由于這是一種存在反饋機制 的注釋過程，并且整個系統(tǒng)是動態(tài)開放實時更新的，因此在某種程度上說它具有糾錯的能力。GO和KEGG注釋之前，為什么要先進行序列比對( BLAST )？在進行功能注釋

7、和通路注釋之前，我們會先將差異蛋白與合適的數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進行比對。目的一：很多物種目前 研究的程度還很有限，關(guān)于這些物種的蛋白注釋信息還很不完善。根據(jù)相似性原理，具有相似序列的蛋白可能也具有相 似的功能，因此，我們可以將BLAST所得的同源蛋白的注釋信息轉(zhuǎn)嫁到我們關(guān)注的差異蛋白上，來完成對于差異蛋白尤其是研究程度不足的物種的差異蛋白的注釋。目的二：我們在查庫過程中，為了得到更多的蛋白質(zhì)鑒定信息，我們大 多使用UniProt數(shù)據(jù)庫(含 SwissProt和TrEmbl : SwissProt中的蛋白均經(jīng)過人工校驗，數(shù)據(jù)可靠性高，注釋完整； TrEmbl由基因組序列翻譯而來，未經(jīng)人工校驗，注釋

8、信息不全)或NCBI Protein數(shù)據(jù)庫(用戶可任意提交序列，有冗余，信息不完善，質(zhì)量很難保證)，BLAST 一方面可以幫我們提高后續(xù)的注釋效率，另一方面也可以幫助客戶大致了解所鑒定的蛋白可能的名稱和功能(尤其對于uncharacterized protein ，predicted protein ， putative protein等)。GO注釋的意義？對鑒定到的蛋白或者差異蛋白進行GO注釋，其宗旨是為了幫助我們了解這些蛋白?？赡艿膽?yīng)用包括： 一，例如，某客戶對某差異蛋白 A 非常感興趣，通過在 GO 注釋的結(jié)果中( protein2GO 表單)查詢蛋白 A 的注釋信 息，即可得知蛋白 A

9、 可能具有的功能、可能參與的生物學(xué)過程，以及該蛋白所在的亞細(xì)胞定位。二，根據(jù)課題的設(shè)計和先驗知識，客戶可能對某個生物學(xué)過程(例如：離子運輸)非常感興趣，可以通過在結(jié)果中( BP 表單)查詢 ion transport 這個 GO term 下包含哪些蛋白，并對這些蛋白進行深入研究。 三，客戶拿到質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果后，可能對于后續(xù)的分析沒有方向，這種情況下可以通過在注釋結(jié)果中查詢哪些功能類 別包含的蛋白數(shù)目較多，可以從這些功能類別和蛋白入手進行重點研究。四， GO 注釋可以為課題的設(shè)計和實驗結(jié)果的合理性提供證據(jù)。GO 和 GOslim 的區(qū)別GOslim 是簡化的 GO 子集，是經(jīng)過科學(xué)家人工篩選

10、的一部分 GO term 。簡單的說， GOslim 去除了一些比較細(xì)枝末節(jié) 的 GO term ，更著重研究 level 更高、相互關(guān)聯(lián)的 GO term ，以及與物種更為相關(guān)的 GO term ( Plant ， Candida albicans ，Schizosaccharomycespombe ， Yeast ， Aspergillus ，Metagenomics )。 GOslim 對于大規(guī)模組學(xué)的研究很有意義(比如全基因組、全蛋白組)，不至于相關(guān)的功能類別太多反而忽略了重點。通常情況下，我們的分析只針 對幾十個到幾百個差異蛋白進行重點注釋，GO 和 GOslim 的結(jié)果差別不大。為

11、什么有些蛋白沒有 GO 注釋信息？ 目前對于蛋白質(zhì)的功能研究還有限，尤其是非模式生物。為了提高注釋率，根據(jù)序列相似的蛋白可能具有相似的功能的 原則，我們已經(jīng)在注釋前對目標(biāo)蛋白序列進行了 blast ，并利用足夠相似的比對序列的注釋信息對目標(biāo)序列進行注釋。 此外，我們還采用了查找 InterPro 數(shù)據(jù)庫中的保守 motif 的方法對難以注釋的蛋白進行注釋。但是仍然有少數(shù)蛋白， 對于該蛋白，或者同物種中也之相似的蛋白，或者其他物種中的同源蛋白的研究依然十分不足，所以以目前的研究水平 難以獲得注釋信息。為什么 GO Level 2 的統(tǒng)計餅圖里蛋白數(shù)目和差異蛋白總數(shù)不一致？一個蛋白可能參與多個生物

12、過程( biological process )，具有多種分子功能( molecular function )，甚至存在于多 個細(xì)胞組分( cellular component )，因此 GO Level 2 的統(tǒng)計餅圖里多個類別的蛋白數(shù)相加通常是大于差異蛋白數(shù)目 的。此外，少數(shù)蛋白由于無法獲得注釋信息，不參與統(tǒng)計，也是造成統(tǒng)計數(shù)目和差異蛋白總數(shù)不一致的一個原因。什么是差異蛋白的功能富集分析 &WHY ？ 差異蛋白的功能富集分析是將差異蛋白列表中的蛋白與參考物種的全部蛋白列表或?qū)嶒炶b定到的所有蛋白列表根據(jù) GO 功能的注釋結(jié)果進行對照比較，通過 Fisher 精確檢驗 (Fisher

13、's Exact Test) ，得出兩者差異的顯著性，從而找到這個差 異蛋白列表中富集的功能類別條目，找到一個蛋白列表的功能特性。不同于蛋白功能注釋以蛋白為單位進行注釋，差異 蛋白的功能富集分析以 GO 功能條目為單位，結(jié)果可以直接揭示整個差異蛋白列表中蛋白的整體功能富集特征。GO注釋結(jié)果文件解析GO注釋的結(jié)果文件包括 GO.xlsx和GOslim.xIsx 兩個EXCEL表格，共計15個表單。GO.xlsx :包含 TopBlastHits , protein2GO , BP, MF , CC, Level2_BP , Level2_MF , Level2_CC 等 8 個表單GOs

14、lim.xIsx :包含 protein2GOslim , BP, MF , CC, Level2_BP , Level2_MF , Level2_CC 等 7 個表單Sheet TopBlastHitsLizfri l_hu.TTfln|irll »i-a=1訕帥1 p3D P&MJRi n-103V*JMZVlZBT1iOWI»；“rii w :J直!冃滬+n347) 3PMN-4I.IMMr 悄* rv】 *i浮 1 弼強中IW13nrui'nSr-alBi： h dd b'df1S4 卻問:S& 3山玨 H JWi HAIX ddt1

15、.B3E-1J3.JM3221E4&vin«i_h 亠Bhori口 Mpi-*ii r-artaJ |£i?l ap- 'ft"n«inaliltirOl?右卄Iaownsvinr-ii_hMin$*w|infS!ritmpivh%iT傅仙 wthh .iir>_iiL*iAwyfirxina科阿師7=55i3tHlS_S«*V"a ine- bgfjjt inS4E5 SpIHESJSrTHffi 籾1»6汕4也*丹啊|雖呂甜03Mdl5iiS1ik -a . jiL u t zir u* ri 1

16、曲!ye丄d 曲 畑*1曲i.mMi血AHA同miai_huM|nB. iiA'MlipDlH-r-iaapiarai jtiap 兇FETAjfWwMTiEkREiAiri PCSJTtw<51切衛(wèi)R 即53_卜°1'尸|1-3«<"*葉13 典巧4|1斤 I EITt2J1* 3D 3333 “e刃 iJMAMTw-smTnUrnnmEML<3QCZ3*15+細(xì)f# |理斛耳腫Til S& *W：J1!fi1 *1： 1cIMSW5?TISTMce壬I FllCii a hit . F!.r Q L) J|iil &#

17、39;l> J|-O'j.'p -ur j ”匚G>_.卿MA5#Sequenee name :目標(biāo)蛋白 IDSequenee dese.:根據(jù)blast結(jié)果，目標(biāo)蛋白可能的名稱和描述Sequenee length :目標(biāo)蛋白序列長度Hit dese.:比對序列的蛋白名稱和描述Hit ACC :比對序列的蛋白ID號E-Value : S值可靠性的評價，表明在隨機的情況下，其它序列與目標(biāo)序列相似度大于S值的可能性，越低越好Similarity : Positives/AlignmentSeore :表示兩序列的同源性，分值越高表明它們之間相似的程度越大Alignmen

18、t :比對上的蛋白序列部分的長度Positives :相同或理化性質(zhì)相似的氨基酸數(shù)目Sheet protein2GO/protein2GOslim1Hk QmkZciam*ieftIe r sa*1Cl鬧nC1L7A&small suiDuniT ribosciiiAl pfDU： n驚心苗maf! Eii3uriiltiba«EnH! prslv r aSte6C1LP*ritHWi*! iraiCH iTt7C：LF=H匸命iibhai'raj f' a ic > J?a2£14PM*ri|MMni«l |raita n 127.

19、-QCURBribcsamji p-<Ftr n 3CSLVl4 Ib4d.i.ifti-!- £rw 1,. .td r jJiUuFHf-pni 爭iiMO Hp NfA. wsGl3-lDTan*p儼UIT "Irr fiQweetOr >Ikh9m faioivnia -G<3ini9B*3 r jind n; 00 W£ MHit#禪帕 11SeqName :目標(biāo)蛋白IDHit-Dese :比對序列的蛋白名稱和描述GO-Group :所注釋 GO term 的類別(P： Biologieal Proeess , F： Moleeular

20、 Funetion , C: Cellular Component )GO-ID :所注釋 GO term 的 IDTerm :所注釋GO term 的名稱Sheet BP/MF/CCLevel: GO term 在ontologies 的樹型分支結(jié)構(gòu)中所處的層次，BP、MF、CC最高（Level 1 ）GO-ID :所注釋 GO term 的 IDTerm :所注釋GO term 的名稱Type : GO term 所屬類別（BP、MF、CC）#Seqs :屬于該GO term 的蛋白數(shù)目Seqs:屬于該 GO term 的蛋白IDSheet Level2 BP/Level2 MF/Leve

21、l2 CCBiological Processlocalization, 7icellular process, 37biological regulation, 8metabolic process, 38cellular component organization orsignaling, 2response stimulus, 4single-organismprocess, 16 developmen multicellular process, 3 -organismal process,3enzymeregulatoractivity, 4Molecular Functionpr

22、oteinbindingtranscription factorCellular Componentextracellular region,binding, 40kactivity, 1 catalytic activity, 25organelle,28cell, 37structural molecule activity, 8macromolecularcomplex,25membranemembrane,8transporte r activity, 1-enclosed extracellullumen, 4ar matrix,1Data labels : GO term (Lev

23、el 2), 屬于該 GO term 的蛋白數(shù)目CHAPTER TWO about kegg pathway annotationWHY KEGG pathway ann otatio n?在生物體中，蛋白質(zhì)并不獨立行使其功能，而是不同蛋白質(zhì)相互協(xié)調(diào)完成一系列生化反應(yīng)以行使其生物學(xué)功能。因此, 通路分析有助于更系統(tǒng)、全面地了解細(xì)胞的生物學(xué)過程、性狀或疾病的發(fā)生機理、藥物作用機制，等等。KEGG通路注釋的方法&流程？Cm off byT?L-JirCLtLll：hLl hit :丑忙firnjupiuij K(.)KO groupsScoring by ptrobibilLty and

24、heuriiiL.&Ranking of KOIn the KEGG database, by adopting a web-based server called KAAS (KEGG Automatic Annotation Server: http:/www.genome.jp/kegg/kaas/), the studied proteins are annotated with the KEGG orthology (KO)identifiers, or the K numbers, based on the best hit information using Smith-

25、Waterman scores as well as bythe manual curation. Each K number represents an ortholog group of genes, and it is directly linked to an object in the KEGG pathway map or the BRITE functional hierarchy. The method is based on sequence similarities, bi-directional best hit information and some heuristi

26、cs, and has achieved a high degree of accuracy when compared with the manually curated KEGG GENES database.KEGG通路注釋的意義？對鑒定到的蛋白或者差異蛋白進行KEGG通路注釋，其宗旨是為了幫助我們了解這些蛋白可能參與的代謝或信號通路，從而顯示蛋白質(zhì)從細(xì)胞表面到細(xì)胞核的一系列變化過程，揭示參與該過程的一系列生物學(xué)事件和作用因子，提示某一過程的中斷或變化可能導(dǎo)致的生物學(xué)后果等。對蛋白質(zhì)進行通路注釋可能的應(yīng)用包括：一，例如，某客戶對某差異蛋白A非常感興趣，通過在 KEGG注釋的結(jié)果中（que

27、ry2map 表單）查詢蛋白 A的注釋信息，即可得知蛋白 A可能參與的代謝或信號通路。二，根據(jù)課題的設(shè)計和先驗知識，客戶可能對某條通路（例如：EGFR signaling pathway ）非常感興趣，可以通過在結(jié)果中（map2query 表單）查詢EGFR signaling pathway這條通路下包含哪些蛋白，并對這些蛋白進行深入研究。三，客戶拿到質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果后，可能對于后續(xù)的分析沒有方向，這種情況下可以通過在注釋結(jié)果中查詢哪些通路包 含的蛋白數(shù)目較多，可以從這些通路和蛋白入手進行重點研究。四，KEGG通路注釋可以為課題的設(shè)計和實驗結(jié)果的合理性提供證據(jù)。為什么有些蛋白沒有 KEGG通

28、路注釋信息？目前對于通路的研究還有限，尤其是信號通路。為了提高注釋率，我們已經(jīng)在注釋前對目標(biāo)蛋白序列進行了blast，并利用同源蛋白的參與的通路信息對目標(biāo)序列進行注釋。但是仍然有部分蛋白，對于該蛋白，或者同物種中也之相似的蛋 白，或者其他物種中的同源蛋白的研究依然十分不足，所以以目前的研究水平難以獲得注釋信息。什么是差異蛋白的通路富集分析&WHY ？差異蛋白的通路富集分析是將差異蛋白列表中的蛋白與參考物種的全部蛋白列表或?qū)嶒炶b定到的所有蛋白列表根據(jù)KEGG通路的注釋結(jié)果進行對照比較，通過Fisher精確檢驗（Fisher 'Exact Test），得出兩者差異的顯著性，從而找到

29、這個差異蛋白列表中富集的通路。不同于蛋白通路注釋以蛋白為單位進行注釋，差異蛋白的通路富集分析以KEGG通路為單位，結(jié)果可以直接揭示整個差異蛋白列表中蛋白的整體通路富集特征。KEGG注釋結(jié)果文件解析KEGG注釋的結(jié)果文件包括 KEGG.xlsx表格和map文件夾。KEGG.xlsx :包含 query2map ， map2query ， TopMapStat 等 3 張表單Map文件夾：包含所有和目標(biāo)蛋白相關(guān)的KEGG通路圖，目標(biāo)蛋白以綠色標(biāo)識Sheet query2mapProtein ID :目標(biāo)蛋白IDKO: KEGG orthology identifier/K numberMap ID

30、 :目標(biāo)蛋白可能參與的通路IDMap Name :目標(biāo)蛋白可能參與的通路名稱9URL：可直接鏈接到KEGG數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)蛋白可能參與的通路圖，目標(biāo)蛋白以紅色標(biāo)識Sheet map2queryMap ID :目標(biāo)蛋白可能參與的通路 ID10#6543210£Map Name :目標(biāo)蛋白可能參與的通路名稱Seqs :參與該通路的目標(biāo)蛋白ID#Seqs :參與該通路的目標(biāo)蛋白數(shù)目URL：可直接鏈接到 KEGG數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)蛋白可能參與的通路圖，參與該通路的所有目標(biāo)蛋白以紅色標(biāo)識Sheet TopMapStat .XXJ I I I I I IfTl I I I I I I |FT11 tmmu

31、mX Axis :目標(biāo)蛋白可能參與的通路名稱Y Axis :參與該通路的目標(biāo)蛋白數(shù)目CHAPTER THREE about feature selection & clusteringWHY Feature Selectio n?檢驗?zāi)撤N生物處理是否有效果的常規(guī)試驗，通常的做法就是做兩組數(shù)據(jù)，一組處理樣本，一組陰性對照，然后用t檢驗,看看p-value是否小于0.05。但是由于蛋白組學(xué)實驗的樣本量通常都比較小(一般不多于3組生物學(xué)重復(fù))，那么您的“顯著”究竟是確實反映了處理效果，還是本來處理沒什么效果，您只是這次“運氣好”而僥幸碰到一組產(chǎn)生顯著的數(shù)據(jù)？如果生物處理確實有很強的效用，即便

32、在每組只有三個樣本的情況下，達(dá)到顯著的可能性當(dāng)然很大，如80 %,那么這種通過是意料之中的。反之，如果其實處理幾乎沒有效果，同樣每組三個樣本，但是這種情況下依然有可能達(dá)到 p-value 小于0.05，只是可能性相當(dāng)小，女口5 %，那么這個顯著一般認(rèn)為“只是運氣好”而已。具體可參考。所以，在樣本量有限這一事實無法改變的情況下，為了避免“運氣好”的質(zhì)疑，我們需要其他的統(tǒng)計學(xué)算法或模型幫助 我們篩選有意義的關(guān)鍵marker。在統(tǒng)計學(xué)中，特征選取(Feature Selection)是從所有特征中選取可有效區(qū)分樣本的一小部分特征的過程，即利用統(tǒng)計學(xué)模型從所有鑒定到的蛋白質(zhì)中選取可區(qū)分生物學(xué)樣本的蛋白

33、質(zhì)集合的過程。我們利 用 WEKA 軟件包中的 information gain attribute evaluator和 correlation-based feature selection (CFS)算法，并結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)倍數(shù)比來篩選特征差異表達(dá)蛋白質(zhì)。聚類分析(Clustering)用來檢驗所選取的差異蛋白或經(jīng)Feature Selection篩選的特征差異蛋白的合理性和準(zhǔn)確性，即所挑選的蛋白是否可以代表不同樣本之間的差異，或者說利用這些蛋白是否可以準(zhǔn)確將不同組樣本進行分類。一般不建議用Fold Change/Pvalue篩選的差異蛋白直接做聚類，分類的準(zhǔn)確率不高。聚類結(jié)果文件解析層

34、次聚類結(jié)果以樹型熱圖表示，紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)橫坐標(biāo)：樣本，縱坐標(biāo)：差異蛋白以M為參考線，樣本被分為兩類：C1-C3為一類m1，T1-T3為一類m2，分類準(zhǔn)確率100%，表示挑選的差異蛋白可以有效區(qū)分樣本，即挑選的差異蛋白合理、準(zhǔn)確以N為參考線，蛋白被分為兩類：Q4G0N4-Q99584 為一類n1，A8K2W3-B4DMR3 為一類n2。通過查詢原始數(shù)據(jù)可知，n1組蛋白在 m1 ( C)組樣本中下調(diào)，在m2 (T)組樣本中上調(diào)；n2組蛋白在 m1 ( C)組樣本中上調(diào)，在 m2 (T)組樣本中下調(diào)-挑選的差異蛋白在兩組樣本中的表達(dá)模式，也可說明挑選的差異蛋 白具有合理性。樹叉的長度表示樣本或蛋白之間的親緣關(guān)系，即差異，長度越長兩者差異越大。例如，距離a表示樣本T1和T3之間的差異，距離 b表示C組樣本和T組樣本之間的差異。親緣關(guān)系較近的樣本或蛋白較為相似，如C1-C3相似，T1-T3相似，C和T有明顯差異；又例如白在兩組樣本中表達(dá)模式相似，而與n2組蛋白的表達(dá)模式截然不同。此外，在同一蛋白組內(nèi)，如n1組內(nèi)蛋n2，同一n1n2mlm2t z n LJ LJ LJ300629D9297354DK5B 機皈 P05737 revzv?9BS40P09936m 如 乂5£2ST457P62330S3V3T3K7EHT6 399534 k8K