菌株篩選方法

1、第二章餐廚垃圾堆肥產(chǎn)酶菌株篩選2材料與方法2.1材料2.1.1實(shí)驗(yàn)材料1） 篩選材料：HM菌劑（河南恒隆態(tài)生物工程股份有限公司）；EM菌劑（江西天 意集團(tuán)）；金寶貝菌劑（北京華夏康源科技有限公司）；群林發(fā)酵劑（廣西北海群 林生物工程有限公司）。2） 發(fā)酵材料：餐廚垃圾（購自貴州大學(xué)南校區(qū)學(xué)生食堂）；稻草（購自銅仁市， 曬干后粉碎至5mm左右）。2.1.2主要藥品及試劑2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器電子分析天平（EL-2005） 高速臺式離心機(jī)（TGL-161） 冷凍離心機(jī)（2-16k）標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺低溫冰箱BCD-108E） 超低溫冰箱（Forma-6C ULT） 調(diào)溫調(diào)濕箱（WS/08-01） 干燥箱

2、（101-2）自動三重水蒸餾器（SZ-97）高壓滅菌鍋（GMSX-280）循環(huán)水浴鍋（RET7）電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH3600）西特傳感技術(shù)有限公司Thermo公司德國eppendof公司上海錦星科學(xué)儀器有限公司風(fēng)華電器廠Thermo公司重慶試驗(yàn)設(shè)備廠上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠上海亞榮生化儀器廠英國阿斯太歐（Astell）公司Thermo公司天津泰斯特儀器有限公司恒溫?fù)u床（SKY-2102C）高速組織搗碎機(jī)（DS-1）磁力雙向攪拌器（90-1）pH計ACS交直流兩用電子計價秤 雙金屬溫度計（WSS-411） 秸稈揉絲飼料粉碎多用機(jī)（9R-30）紫外分光光度計上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司上海標(biāo)本模型廠上海亞榮生化儀

3、器廠昆明金瑞克電子衡器有限公司 天津市新華熱工儀表有限公司 河北鐵獅磨漿機(jī)械有限公司2.1.6培養(yǎng)基1）初篩培養(yǎng)基（1）細(xì)菌培養(yǎng)基（）:牛肉膏0.3;蛋白胨1.0；氯化鈉0.5;瓊脂粉2.0; pH7.2（2）霉菌培養(yǎng)基（%）：磷酸二氫鉀0.1； 七水硫酸鎂0.05；蛋白胨0.5；葡萄糖1.0;瓊脂粉2.0；孟加拉紅0.03; pH自然；鏈霉素30卩g/m（3）乳酸菌培養(yǎng)基（%）:蛋白胨1;牛肉膏1;酵母膏0.5;檸檬酸二銨0.2; 葡萄糖2.0;吐溫80 0.1;乙酸鈉0.5;三水磷酸氫二鉀0.2; 七水硫酸鎂0.058; 七水硫酸錳0.025;瓊脂粉2.0; pH6.2（4）放線菌培養(yǎng)基（

4、%）:可溶性淀粉2;氯化鈉0.05;硝酸鉀0.1;磷酸氫二鉀0.05;七水硫酸鎂0.05;七水硫酸亞鐵0.001;重鉻酸鉀0.015;瓊脂粉2.0; pH7.4; 青霉素3卩g/ml2）復(fù)篩培養(yǎng)基（1）產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基（%）:可溶性淀粉0.2;蛋白胨1.0;酵母膏0.5;磷酸氫二鉀0.3; 七水硫酸亞鐵微量；七水硫酸鎂微量；瓊脂粉2.0; pH7.0【陳秋紅,孫梅,施大林，等.益生菌酪酸菌CB-7發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究.科學(xué)試驗(yàn)與研究J.2009,4:7-10,21】（2）產(chǎn)脂肪酶篩選培養(yǎng)基（%）:硫酸銨0.1;磷酸氫二鉀0.1;氯化鉀0.05; 七 水硫酸鎂0.01;橄欖油1.0;聚乙

5、烯醇0.1;瓊脂粉2.0; PH8.5【劉敏，曹志軍,焦艷芬，等.UHT乳中產(chǎn)耐高溫脂肪酶嗜冷菌的研究J.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2008,29（1）:230-233（3） 產(chǎn)纖維素酶篩選培養(yǎng)基（%）:七水硫酸鎂0.01;羧甲基纖維素鈉1.5;氯 化鈣0.01;磷酸二氫鉀0.05;硫酸銨0.2;磷酸氫二鉀0.2; pH自然【劉勝貴，嚴(yán)明,鄒娟，等.纖維素降解真菌的篩選及其產(chǎn)酶條件J.中國農(nóng)學(xué)通報,2011,27（7）:102-1063）產(chǎn)酶發(fā)酵液（1）產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵液（%）：可溶性淀粉0.5;蛋白胨0.5；酵母膏0.5;氯化 鈉0.1;七水硫酸亞鐵微量；七水硫酸鎂微量；pH7.0（ 48h培養(yǎng)）【陳

6、秋紅，孫梅，施大林,等益生菌酪酸菌CB-7發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究科學(xué)試驗(yàn)與研究J.2009,4:7-10,21 】（2）產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵液（%）：蛋白胨2.0;葡萄糖0.58;橄欖油乳化液4;硫酸銨0.1; 七水硫酸鎂0.05;磷酸氫二鉀0.1; pH自然（72h培養(yǎng)）【胡朝陽,韋晗寧，李春苑,等.產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及酶學(xué)特性研究J.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2006,25（3）:261-268（3） 產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵液：A液：葡萄糖0.4g;七水硫酸鎂0.25g; CMC-Na 0.5g; 水89mL; B液：磷酸氫二鈉6.0g；氯化鈉0.5g；磷酸二氫鉀3.0g；氯化銨1.0g; 水 100mL;

7、C 液：氯化鈣 0.11g；水 100mL滅菌后10mLB液+1mLC液+89mLA液即為發(fā)酵液【雷正玉,何力,王朝元，等.草魚體內(nèi)產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究J.微生物學(xué)雜志,2007,27（4）:54-574）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（%）:蛋白胨1.0;酵母膏0.5;氯化鈉1.0;瓊脂粉2.0; pH7.02.1.7溶液配制0.5%淀粉溶液配制：0.5g可溶性淀粉加入10mL水混合成糊狀，加入95mL沸水，微沸幾分鐘。 靜置、冷卻，取上清即得。0.1mol/L H2SO4 溶液配制：取10.9mL濃硫酸定容至 100mL，即為1mol/LH 2SO4溶液。取 10mL， 1mol/LH2SO溶

8、液定容至100mL，即為0.1mol/L的H2SO4溶液。碘液的配制：稱取2.0g碘化鉀溶于10mL蒸餾水中，加入1.0g碘，迅速攪拌使其溶解后 加水定容至300mL。即0.1mol/L的盧卡氏碘液；取 0.4mL 0.1mol/L碘液定容至100mL 即得 0.4mmol/L 碘液。4%聚乙烯醇溶液配制：稱取40g聚乙烯醇(PVA)加蒸餾水約800mL，在沸水浴中不斷攪拌使其完 全溶解，冷卻后定溶至1000mL,再經(jīng)紗布過濾后備用。橄欖油乳化液的配制：取4%聚乙烯醇溶液150mL,加50mL橄欖油，高速組織攪動機(jī)攪動6min(分 2次攪動，每次3min，中間休息5min中)，即制成乳白色的橄

9、欖油乳化液。磷酸鹽緩沖液配制：0.025mol/L, pH 值 7.5。甲液：稱取 17.01gKH2PO4，加水定容至 500mL; 乙液：稱取44.77gNa2HPO4 -12H2O,加水定容至500mL;吸取13mL甲液與100mL 乙液混勻即成0.25mol/L磷酸緩沖液，使用時用水稀釋 10倍，即成0.025mol/L 磷酸鹽緩沖液。0.05mol/L Na OH 溶液配制：取4.58g固體Na OH溶于1L水中，用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定，使用時稀釋10 倍。酚酞溶液配制：取1g酚酞溶于100mL 95%的乙醇中即得10g/L的酚酞溶液；取0.5g酚酞溶 于100mL 95%的乙醇中即得

10、5g/L的酚酞溶液【GB/T 603-2002化 學(xué) 試 劑試驗(yàn) 方法中所用制劑及制品的制備】Na2CO3-NaHCO 3緩沖液配制：0.1mol/L，pH10。0.1mol/LNa2CO3溶液：稱取 28.62g NazCO3 - 10H2O 溶解、 定容至 1L，即為 0.1mol/LNa2CO3 溶液；0.1mol/LNaHCO3 溶液：稱取 8.40gNaHCO3 溶解、定容至1L,即為0.1mol/LNaHCO3溶液。使用時將Na2CO3溶液與NaHCOs 溶液1:1混合即得0.1mol/L, pH10的Na2CO3-NaHCO3緩沖液。1%CMC-Na溶液配制：稱取1gCMC-Na

11、溶解定容至100mL即得。DNS試劑配制：稱取酒石酸鉀鈉182.0 g,于500 mL蒸餾水中，加熱攪拌，依次加入 3,5- 二硝基水楊酸6.3 g, Na OH 21.0 g，苯酚5.0 g,攪拌至完全溶解，冷卻后用蒸 餾水定容至1 000 mL,棕色瓶中室溫暗處放置一周后使用?！緩堼埾?，張庭芳，李令媛生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)M.北京:人民教育出版社，1982:9-11】2.2方法2.2.1樣品組成菌株的分離純化1. 各稱取商品菌劑（HM菌劑、金寶貝菌劑、群林菌劑、EM菌劑）10g（或10mL） 置于盛有90mL無菌生理鹽水，含玻璃珠的三角瓶中，37C, 180r/min震蕩60min, 將菌劑打

12、碎。取上清作為10-1，依次稀釋至10-2,10-3,10-4,10-5。2. 吸取100卩L稀釋好的菌液涂布初篩培養(yǎng)基平板，三組平行實(shí)驗(yàn)。3. 將涂布好的平板及其平行組分別置于28C, 45C, 55C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細(xì)菌、乳酸菌培養(yǎng)2d;霉菌培養(yǎng)3-5d;放線菌培養(yǎng)7d）。4. 用接種環(huán)挑取分離出的單菌落在相應(yīng)的分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，并置于 分離溫度下培養(yǎng)至長出單菌落。5. 挑取4中的單菌落在相應(yīng)的分離培養(yǎng)基斜面上劃線，分離溫度下培養(yǎng)，4C保存。2.2.2產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選2.221初篩水解圈的測定1. 將保種菌株平板劃線活化后，挑取單菌落在產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基平板上點(diǎn)種，分 離溫度下培

13、養(yǎng)1-2d o2. 培養(yǎng)結(jié)束后在平板上滴加1-2mL 0.1mol/L的碘液，（盡量避免滴加到菌落上） 顯色后測量菌落直徑（d）與水解圈直徑（D），并計算D/d的比值以此判斷待測 菌株對淀粉的分解能力。3. 選出D/d比值較高的菌株，重新編號。2.2.2.2復(fù)篩酶活的測定葉應(yīng)嫵，2006【葉應(yīng)嫵,王毓三.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程M 第3版.南京市:東南大學(xué)出版社,2006】1. 用牙簽挑取初篩菌株保種斜面上的菌落，置于分離培養(yǎng)基液體試管中， 180r/min，分離溫度下培養(yǎng)活化。2. 吸取1mL OD620值在0.6左右的菌液，置于含100mL產(chǎn)酶培養(yǎng)液的三角瓶中，180r/min, 50C 震蕩

14、培養(yǎng) 2d。3. 培養(yǎng)后的產(chǎn)酶發(fā)酵液4C, 7000r/min，離心取上清作為酶液。4. 取5mL, 0.5%的可溶性淀粉溶液加入到試管中，40C水浴預(yù)熱10min。5. 加入5ml酶液，反應(yīng)5min后用5mL0.1mol/L H 2SO4終止反應(yīng)。5. 取 5mL 反應(yīng)液與 5mL0.4mmol/L I2-KI 溶液顯色，620nm 測 OD 值。（以 0.5ml 水代替0.5mL反應(yīng)液為空白，以同批配置的淀粉酶空白發(fā)酵液離心上清為對照）。6. 將OD620值代入以下公式計算酶活力：酶活力（U/mL）二 R0 一 R 50 DRoR0：對照的碘液光吸收值；D:酶稀釋倍數(shù)；R:反應(yīng)液的光吸收值

15、（調(diào)整 D使R0 -RR在0.2-0.7之間，確定40C, 5min內(nèi)水解1mg淀粉的酶量為一個活力單位）。7. 依據(jù)水解圈比值D/d，及體外酶活測定值，選出3株酶活較高且穩(wěn)定性較好的 菌株作為后期研究菌株。2.2.3產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選223.1初篩水解圈的測定1. 將保種菌株平板劃線活化后，挑取單菌落在產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基平板上點(diǎn)種，分 離溫度下培養(yǎng)3d。2. 培養(yǎng)結(jié)束后直接測量菌落直徑（d）與水解圈直徑（D），并計算D/d的比值， 以此判斷待測菌株對淀粉的分解能力。3. 選出D/d比值較高的菌株，重新編號。2.2.2.2復(fù)篩酶活的測定QB/T 1803.93【QB/T 1803.93,工業(yè)酶制劑

16、通用試驗(yàn)方法S】1. 同 2.2.1.2 中 1。2. 吸取1mL OD620值在0.6左右的菌液，置于含100mL產(chǎn)酶培養(yǎng)液的三角瓶中， 180r/min, 50C震蕩培養(yǎng) 3d。3. 同 2.2.1.2 中 3。4. 取兩個100mL三角瓶，分別于空白瓶（A）和樣品瓶（B）中，各加底物溶液（橄欖 油乳化液）4.00mL和磷酸緩沖液5.00mL，A瓶中加人95%醇15.0mL。5. 兩瓶置于40C 2C水浴預(yù)熱5 min,后在兩瓶中各加待測酶液1.00mL混勻、 計時，在40C 2C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15 min在B瓶中立即補(bǔ)加95%L醇15.0mL 終止反應(yīng)，取出。6. 于空白和樣品溶液中各加

17、酚酞指示液 2滴，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 滴定直至微紅色并保持30s不褪為其終點(diǎn)，記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶 液的體積。7將滴定值代入以下公式中計算脂肪酶酶活：X=200/3 X （B-A） X c X n（X樣品的酶活力，U/g; B滴定樣品時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL A滴定空白時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL; c氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L ; 0.05氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù);n稀釋 倍 數(shù)）8. 依據(jù)水解圈比值D/d ,及體外酶活測定值，選出3株酶活較高且穩(wěn)定性較好的 菌株作為后期研究菌株。2.2.4產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選224.1初篩水解

18、圈的測定1. 將保種菌株平板劃線活化后，挑取單菌落在產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基平板上點(diǎn)種，分 離溫度下培養(yǎng)3-5d o2. 培養(yǎng)結(jié)束后在平板上滴加1-2mL 1mg/mol的剛果紅染液染色30min（盡量避免 滴加到菌落上），用1mol/L的NaCI溶液脫色30min后，測量菌落直徑（d）與 水解圈直徑（D）,并計算D/d的比值，以此判斷待測菌株對淀粉的分解能力。3. 選出D/d比值較高的菌株，重新編號。2.2.4.2 復(fù)篩酶活的測定Horikoshi, 1984【Horikoshi K, Nakao M, Kurono Y, et al. Cellulases of an alkalophilic Bacillus strain isolatedfrom soilJ. Can J Micriobiol,1984,30:774-779】1. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制張樹政，1984【張樹政，等.酶制劑工業(yè)M.北京:科學(xué)出版社，1984,595-62311）將葡萄糖放在110C