液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的原理

1、 匯報人：匯報人：XXX2015-12-18液相色譜液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)簡簡 介介 液質(zhì)聯(lián)用（液質(zhì)聯(lián)用（LC-MSLC-MS）又叫液相色譜）又叫液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。LC-MSLC-MS除了可以分析氣相色譜除了可以分析氣相色譜- -質(zhì)譜（質(zhì)譜（GC-MSGC-MS）所不能）所不能

2、分析的強極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具分析的強極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個方面的優(yōu)點：分析范圍廣、分離能力強、有以下幾個方面的優(yōu)點：分析范圍廣、分離能力強、 定定性分析結(jié)果可靠、檢測限低、分析時間快、自動化程度高性分析結(jié)果可靠、檢測限低、分析時間快、自動化程度高液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別: : 氣質(zhì)聯(lián)用儀氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EIEI）得到）得到的

3、譜圖，可與標準譜庫對比。的譜圖，可與標準譜庫對比。 液質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。 LC-MSLC-MS由以下幾部分組成由以下幾部分組成 數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng) 液相色譜 接

4、口 質(zhì)量分析器 檢測接收器 （離子源 ） 真空系統(tǒng) 真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)5質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過系統(tǒng)必須處于質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過系統(tǒng)必須處于高真空狀態(tài)高真空狀態(tài)。若。若真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、圖真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、圖譜復(fù)雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問題。譜復(fù)雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問題。一般質(zhì)譜儀都采用一般質(zhì)譜儀都采用機械泵機械泵預(yù)抽真空后，再用高效率預(yù)抽真空后，再用高效率擴散擴散泵泵連續(xù)地運行以保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采用連續(xù)地運行以保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采用分子泵分子泵可獲可獲得更高的真空度。得更高的真空度。離子源6 離子源的作用

5、是將欲分析樣品離子源的作用是將欲分析樣品電離電離，得到帶有樣品，得到帶有樣品信息的信息的離子離子。1.質(zhì)譜檢測的是離子質(zhì)譜檢測的是離子2.離子源離子源=接口接口7ESI是近年來出現(xiàn)的一種新的電離方式。它主要應(yīng)用于是近年來出現(xiàn)的一種新的電離方式。它主要應(yīng)用于液相色譜液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)用儀。流。流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；從而霧化、蒸發(fā)溶劑、阻止中性溶劑分子進入后端檢測。從而霧化、蒸發(fā)溶劑、阻止中性溶劑分子進入后端檢測。電噴霧電離（ESI）8 ESI是一種是一種軟電離方式軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化，

6、即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解，它適合于分析合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解，它適合于分析極性極性強強的有機化合物。的有機化合物。 ESI的最大特點是的最大特點是容易形成多電荷離子容易形成多電荷離子。目前采用電噴霧。目前采用電噴霧電離，可以測量大分子量的蛋白質(zhì)。電離，可以測量大分子量的蛋白質(zhì)。大氣壓化學(xué)電離源(APCI) 9 APCI噴嘴的下游放置一個噴嘴的下游放置一個針狀放電電極針狀放電電極，通過放電電，通過放電電極的高壓放電，使空氣中某極的高壓放電，使空氣中某些些中性分子電離中性分子電離，產(chǎn)生，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+ 和和O+ 等離等離子，溶劑分子也會被

7、電離，子，溶劑分子也會被電離，這些離子與分析物分子進行這些離子與分析物分子進行離子離子-分子反應(yīng)分子反應(yīng)，使分析物使分析物分子離子化分子離子化。Corona Nebulizer APCIHPLCinlet+10 APCI主要用來分析主要用來分析中等極性中等極性的化合物。有些分的化合物。有些分析物由于結(jié)構(gòu)和極性方面的原因，用析物由于結(jié)構(gòu)和極性方面的原因，用ESI不能產(chǎn)生不能產(chǎn)生足夠強的離子，可以采用足夠強的離子，可以采用APCI方式增加離子產(chǎn)率，方式增加離子產(chǎn)率，可以認為可以認為APCI是是ESI的補充。的補充。APCI主要產(chǎn)生的是主要產(chǎn)生的是單電荷離子單電荷離子，很少有碎片離子，很少有碎片離子

8、，主要是主要是準分子離子準分子離子。電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較電離機理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成MH+或M-H-離子。樣品流速：APCI源可從0.2到2 mlmin；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1 mlmin.斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.靈敏度：通常認為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器 12 質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核

9、心核心, 質(zhì)量分析器的作用質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并排列。順序分開并排列。 不同類型的質(zhì)量分析器構(gòu)成不同類型的質(zhì)譜儀。不同類型的質(zhì)量分析器構(gòu)成不同類型的質(zhì)譜儀。 不同類型的質(zhì)譜儀其功能，應(yīng)用范圍，原理，不同類型的質(zhì)譜儀其功能，應(yīng)用范圍，原理， 實驗方法均有所不同。實驗方法均有所不同。 單聚焦磁場分析器13在一定的B、V下，不同m/z 的離子其R不同，由離子源產(chǎn)生的離子，經(jīng)過分析器后可實現(xiàn)質(zhì)量分離。 離子進入分析器后，由于磁場的作用，其運動軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運動。離子進入分析器后，由于磁場的作用，其運動軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運動。其運動軌道半徑其

10、運動軌道半徑R可由下式表示：可由下式表示： 上式中， m -離子質(zhì)量 Z -離子電荷量 V -離子加速電壓 B -磁感應(yīng)強度14單雙聚焦質(zhì)譜儀體積大；單雙聚焦質(zhì)譜儀體積大；色譜色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的發(fā)展及儀器小型化（臺式）需要質(zhì)譜聯(lián)用儀器的發(fā)展及儀器小型化（臺式）需要體積小的質(zhì)量分析器：體積小的質(zhì)量分析器：四極桿質(zhì)量分析器四極桿質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器體積小，操作簡單；體積小，操作簡單；分辨率中等；分辨率中等；15四極桿質(zhì)量分析器 四極桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡單，價廉，體積小，易操作，掃描速度快，適合于GC-MS, LC-MS。 +Electron Be

11、amABCSample inIon Beam16飛行時間質(zhì)譜儀（Time of Flight MS, TOF-MS） TOF-MS的核心部分是一個無場的離子漂移管的核心部分是一個無場的離子漂移管； 加速后的離子具有相同的動能 zVmv 2212/1)2(mzVv m/z小的離子，漂移運動的速度快，最先通過漂移管; m/z大的離子，漂移運動的速度慢，最后通過漂移管。 適合于生物大分子，靈敏度高，掃描速度快，結(jié)構(gòu)簡單，分辨率隨m/z的增大而降低。 17 FT-MS的核心為分析室，分析室由三對平行的極板構(gòu)成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋運動垂直于z軸，在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸

12、方向垂直的兩極板上檢測信號。 (Fourier Transform ion cyclotron resonance Mass Spectrometer, FTICR-MS) 傅立葉變換傅立葉變換離子回旋共振離子回旋共振質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀離子阱質(zhì)量分析器18 特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達檢測器；19檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 質(zhì)量分析器分離并加以聚焦的離子束，質(zhì)量分析器分離并加以聚焦的離子束，按按m/zm/z的大小依次通過狹縫，到達收集器的大小依次通過狹縫，到達收集器, ,經(jīng)接收放大后被記錄。經(jīng)接收放大后被記錄。20 質(zhì)譜儀的檢測主要使用質(zhì)譜儀的檢測主要使用電

13、子倍增器電子倍增器，也有的使用，也有的使用光光電倍增管電倍增管。由倍增器出來的電信號被送入計算機儲存，。由倍增器出來的電信號被送入計算機儲存，這些信號經(jīng)計算機處理后可以得到色譜圖，質(zhì)譜圖及其這些信號經(jīng)計算機處理后可以得到色譜圖，質(zhì)譜圖及其它各種信息。它各種信息。 LC-MSLC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化分析條件的選擇和優(yōu)化1.接口的選擇： ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)） APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。2.正、負離子模式的選擇：選擇的一般原則為：正離子模式：正

14、離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負離子模式：負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。3.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。LCMS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含

15、三乙胺l。含醋酸銨10一5 mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。4.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lmlmin，建議使用200400ulminAPCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。5.輔助氣體流量和溫度的選擇 霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20 左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流