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文檔簡介

1、附件6 RT-PCR檢測漢坦病毒基因及分型材料：（1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分離的漢坦病毒（2）引物：引物序列（53）位置片段（bp）逆轉(zhuǎn)錄引物TAGTAGTAGACTCC114LMS通用外引物AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG19101939M(+)GTACAICCTGTRCCIACCCC23732354M(-)型特異性引物漢灘病毒GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC19581984M(+)GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC23182340M()漢城病毒GTGGACTCTTCTTCTCATTATT19361957M(+)TGGGCAA

2、TCTGGGGGGTTGCATG23312353M()S片段引物ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG12001220S(+)GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA16701696S(-)方法：（1）病毒RNA的提取：采用TRIzol按說明提取，制備模板RNA；（2）逆轉(zhuǎn)錄、合成cDNA：采用SuperScripTMII或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，按說明書進行；（3）PCR擴增：反應條件為95預變性10分鐘，9460秒、5560秒、7245秒、擴增3035個循環(huán)，72延伸12分鐘。（4）擴增產(chǎn)物用12瓊脂糖凝膠電泳鑒定。若條帶的分子量與預期片段大小相同，則表明為特異性擴增產(chǎn)物。必要時，可進行：（5）PCR片段的回收和核苷酸序列測定：切下特異分子量條帶，用QIAquick凝膠回收試劑盒回收（按其說明書進行），自動測序儀測序。意義：擴增到特異性條帶可

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