淋巴細(xì)胞的分離計數(shù)

1、淋巴細(xì)胞的分離、計數(shù) 實驗?zāi)康暮鸵?掌握 外周血單個核細(xì)胞分離的方法外周血單個核細(xì)胞分離的方法 掌握 細(xì)胞計數(shù)的方法細(xì)胞計數(shù)的方法 實驗原理 外周血中細(xì)胞種類 細(xì)胞密度 紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞 1.092 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（PBMC） 1.075-1.092 血小板 1.030-1.035 葡聚糖泛影葡胺密度梯度離心法： 根據(jù)外周血中各種血細(xì)胞比重不同使不同密度的 細(xì)胞呈梯度分布，從而分離出PBMC。 實驗材料1. 肝素抗凝血肝素抗凝血2. Hanks液液3. 淋巴細(xì)胞分離液（淋巴細(xì)胞分離液（F-H)4. 水平離心機(jī)，加樣槍水平離心機(jī)，加樣槍5. 顯微鏡，吸管顯微鏡，吸管6

2、. 細(xì)胞計數(shù)板，臺盼藍(lán)計數(shù)液細(xì)胞計數(shù)板，臺盼藍(lán)計數(shù)液 實驗方案抽取外周血抽取外周血分離分離單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）（和單核細(xì)胞）（PBMC） 細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù) 實驗步驟實驗步驟肝素抗凝靜脈血1.5ml加加1.5ml Hanks液稀釋液稀釋置于2ml淋巴細(xì)胞分離液上( (交界液面：一定交界液面：一定不要打亂不要打亂) )稀釋后的稀釋后的抗凝血抗凝血淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液分離液注意注意：稀釋的肝素抗凝血，：稀釋的肝素抗凝血，沿管壁輕沿管壁輕輕疊加于輕疊加于分離液上，使兩者形成一個分離液上，使兩者形成一個清晰地界面。清晰地界面。用Hanks液洗、離心(1000rpm，5m

3、in)重復(fù)2次血漿血漿分層液分層液紅細(xì)胞紅細(xì)胞粒細(xì)胞粒細(xì)胞離心（2000rpm，25min）淋巴細(xì)胞與淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞層單核細(xì)胞層注意注意：細(xì)胞經(jīng)離心分層：細(xì)胞經(jīng)離心分層后，緩慢小心吸取，后，緩慢小心吸取，勿勿打破形成的細(xì)胞層打破形成的細(xì)胞層。 用Hanks液重懸細(xì)胞取10ul細(xì)胞懸液與90ul白細(xì)胞計數(shù)液或臺盼蘭計數(shù)液混合 取10ul于細(xì)胞計數(shù)板上 細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù)板細(xì)胞計數(shù) 原則：原則： 數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右長1mm寬1mm 結(jié)果計算22個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)單個核細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml)10104 410= =(稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)）活細(xì)胞百分率= =活細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)1

4、00%細(xì)胞活力檢測：（死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色） 細(xì)胞數(shù)量： 方法評價u 純度在90%以上u 淋巴細(xì)胞約占90-95%u 細(xì)胞收獲率可達(dá)80-90%u 活細(xì)胞百分率在95%以上密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞： 細(xì)胞計數(shù)的儀器血細(xì)胞分析儀，臨床常用血細(xì)胞分析儀，臨床常用裝有自動顯微鏡觀察系統(tǒng)裝有自動顯微鏡觀察系統(tǒng)自動細(xì)胞計數(shù)儀自動細(xì)胞計數(shù)儀 注意事項 請將請將帶血帶血的試管，吸管收集放置于實驗室后的的試管，吸管收集放置于實驗室后的紅色消毒盆紅色消毒盆中。中。 值日生負(fù)責(zé)收集加樣槍，計數(shù)板，洗耳球，臺盼藍(lán)計數(shù)液，值日生負(fù)責(zé)收集加樣槍，計數(shù)板，洗耳球，臺盼藍(lán)計數(shù)液，Hanks液。打掃實驗室衛(wèi)生。液。打掃實驗室衛(wèi)生。 實驗材料1. 肝素抗凝血肝素抗凝血2. Hanks液液3. 淋巴細(xì)胞分離液（淋巴細(xì)胞分離液（F-H)4. 水平離心機(jī)，加樣槍水平離心機(jī)，加樣槍5. 顯微鏡，吸管顯微鏡，吸管6. 細(xì)胞計數(shù)板，臺盼藍(lán)計數(shù)液細(xì)胞計數(shù)板，臺盼藍(lán)