基因芯片法檢測肉及肉制品中常見致病菌（二）

1、基因芯片法檢測肉及肉制品中常見致病菌（二） 1增菌培養(yǎng) (1)增菌以無菌操作，稱取剪碎后的瘦肉樣品25g，置于滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，加入25 ml緩沖陳水增菌液，以800010000r/ruin均質(zhì)1 min，移入盛有200ml緩沖陳水增菌液的500ml廣口瓶內(nèi)，混合勻稱，如ph低于6.6，用滅菌1mol/l氫氧化鈉溶液，調(diào)ph至6.80.2，于37水浴培養(yǎng)4h(以增菌液達(dá)到37時算起)，舉行前增菌；其后，移取10ml轉(zhuǎn)種于盛有100ml煌綠增菌液的250ml玻璃瓶內(nèi)，搖勻，于(421)培養(yǎng)(202)h，舉行挑選性增菌。 (2)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌增菌無菌取樣品25g放入滅菌均質(zhì)杯加225 ml改良

2、緩沖蛋白胨水中，充分均質(zhì)。改良緩沖蛋白胨水225 ml放(301)培養(yǎng)(251)h，吸取1ml，加入10ml增菌培養(yǎng)液(eb)中放(301)二次增菌(251)h。 (3)金黃色葡萄球菌增菌無菌取樣品25g放入滅菌均質(zhì)杯，以8000r/min均質(zhì)1 min,加200ml 10%氯化鈉胰蛋白陳大豆肉湯，(361)培養(yǎng)48h。 (4)空腸彎曲桿菌增菌無菌取樣品25g放入滅菌均質(zhì)杯，加100ml彎曲桿菌增菌肉湯，輕柔振蕩5 min后，靜置5min。取出過濾襯套，濾干內(nèi)容物，濾液放入培養(yǎng)瓶中，放(361)培養(yǎng)4h前增菌，再放(421)培養(yǎng)2448h。 (5)o157:h17增菌無菌取樣品25g放入滅菌均

3、質(zhì)杯，加225 ml m(ec)n增菌湯，(411)培養(yǎng)1824h。 2細(xì)菌dna提取 按試劑盒操作解釋舉行： (1)取上述5種增菌培養(yǎng)液各1 ml至一個10ml無菌離心管中混勻，從中取1ml至一個1.5ml無菌離心管中，2500r/min離心30s。取上清液800 ul到另一新的離心管中，12000r/min離心1 min。棄掉上清液，沉淀中加入180ul緩沖液ga，振蕩至菌體徹底懸浮。37作用13h。加入20ul rnase溶液，振蕩15s，室溫放置5min。 注：余下的混合增菌液應(yīng)放入冰箱，以備后期芯片檢測陽性樣品確實(shí)證明驗(yàn)用。 (2)向管中加入20 ul蛋白酶k溶液，混勻后加入220u

4、l緩沖液gb，振蕩 15s, 70放置2030min。簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。 (3)加220 ul，充分振蕩混勻15s。簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將所有液體轉(zhuǎn)移到吸附柱中。 (4)向吸附柱中加入500 ul去蛋白液gd, 12000r/min離心30s，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。 (5)向吸附柱中加入700 ul漂洗液pw, 12004r/min離心34s。倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。 (6)向吸附柱加入700 ul漂洗液 pw, 12000r/min離心30s，倒掉廢液。 (7)吸附柱放回收集管中，12000r/min離心2min，去除吸附柱中殘余的漂洗液。將吸附柱置于室溫

5、或50溫箱放置23 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 (8)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個整潔的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 ul經(jīng)6570水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液te，室溫放置25min, 12000r/min離心30s。 (9)再次向吸附膜的中間部位懸空滴加50 ul經(jīng)6570水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液te,室溫放置2min, 12000r/min離心2min?；厥盏玫降膁na產(chǎn)物于-20冰箱保存?zhèn)溆谩?(10)dna結(jié)果檢測用0.s的瓊脂糖凝膠電泳檢測dna提取物。細(xì)菌基因組dna通過瓊脂糖凝膠電泳，浮現(xiàn)的電泳條帶位置在10000bp以上，且清楚可見。 3.pcr擴(kuò)增 (1)擴(kuò)增 將提取的

6、細(xì)菌基因組dna同時用兩個pcr反應(yīng)體系舉行擴(kuò)增，電泳檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。pcr反應(yīng)體系如表5-24、表5-25所示。 表5-24 pcr反應(yīng)體系 表5-25 pcr反應(yīng)體系 (2)pcr反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)94預(yù)變性5 min；進(jìn)入循環(huán)，94/30s、56/30s、72/1 min 40s，共40個循環(huán)；最后72延長7min。 (3)pcr擴(kuò)增結(jié)果檢測pcr反應(yīng)結(jié)束后取3 ul擴(kuò)增產(chǎn)物加入3 ul 2pcr載樣液，用1.5的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。若在10001500bp之間浮現(xiàn)顯然的擴(kuò)增條帶，即可舉行芯片雜交試驗(yàn)。 注：假如在此片段范圍內(nèi)無可見擴(kuò)增條帶，同時陽性質(zhì)控也無可見擴(kuò)增條帶，則可能為

7、擴(kuò)增失敗，建議更換另一批次的pcr擴(kuò)增試劑，重新擴(kuò)增。 4芯片雜交 (1)雜交體系配制將雜交液置42水浴預(yù)熱5 min，雜交體系的配制如表5-26所示。 表5-26雜交體系 (2)變性將雜交體系95變性5 min，冰浴5min。 (3)雜交將雜交盒平放在桌面上，在雜交盒的兩邊凹槽內(nèi)加入約80 ul滅菌水，將固定有探針片段的芯片放入雜交盒內(nèi)，芯片標(biāo)簽正面朝上；揭掉芯片蓋片的塑料薄膜，放在芯片的黑色圍欄上，凸塊的一面向著芯片；然后從蓋玻片的小孔緩慢注入15 ul變性后的雜交液。不要振動蓋玻片或芯片以避開破壞液膜。蓋緊雜交盒蓋，放入42恒溫水浴中，靜置，雜交2h以上。 5芯片洗滌 按需要量配制好芯片

8、洗液和洗液，并在42預(yù)熱30min。取出雜交后芯片，將芯片放在預(yù)熱好的洗液i中，42水浴搖床振蕩清洗4 min，再轉(zhuǎn)入預(yù)熱好的洗液中，42水浴搖床振蕩清洗4min。最后用42預(yù)熱好清水中振蕩清洗一次，清洗后的芯片經(jīng)1500r/min離心1 min以去除芯片表面的液體。此芯片可避光保存，在4h內(nèi)掃描結(jié)果。 6芯片掃描及結(jié)果判讀 (1)芯片雜交結(jié)果掃描用法微陣列芯片掃描儀對洗凈雜交后的芯片舉行掃描分析。 (2)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 信號值背景信號平均值4背景信號值標(biāo)準(zhǔn)差，且信號值陰性對比信號平均值+4陰性對比信號值標(biāo)準(zhǔn)差，探針雜交結(jié)果為陽性； 背景信號平均值+2背景信號值標(biāo)準(zhǔn)差信號值背景信號平均值4背景信號值標(biāo)準(zhǔn)差，且陰性對比信號平均值+2陰性對比信號值標(biāo)準(zhǔn)差信號值陰性對比信號平均值4陰性對比信號值標(biāo)準(zhǔn)差，探針雜