生化教學(xué)實驗：脫輔基血紅蛋白的制備和重組

1、 實驗七 脫輔基血紅蛋白的制備和重組一、實驗?zāi)康?. 了解生物化學(xué)中典型的血紅蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)以及結(jié)合在蛋白上的輔基的作用。2. 學(xué)習一種生物無機生化科研中常用的為金屬酶和蛋白質(zhì)代換金屬離子的方法。3. 學(xué)習快速掃描分光光度計的使用及紫外可見吸收光譜的應(yīng)用。4. 學(xué)習柱層析和透析袋脫鹽的方法。二、實驗原理 血紅蛋白(Hemoglobin)是由二價鐵Fe()血紅素作為輔基與多肽鏈結(jié)合組成的一種結(jié)合蛋白，它是由四個亞基組成的四聚體，分子量大約為65000。四個亞基中，兩個亞基具有相同的氨基酸序列，稱為亞基，每條鏈含141個氨基酸，另外兩個氨基酸序列相同的亞基，稱為亞基，各含146個氨基酸。兩種亞基

2、有其各自的二級、三級空間結(jié)構(gòu)，亞基之間以非共價鍵結(jié)合在一起。每個亞基中均含有一個血紅素輔基，血紅素是一個鐵原卟啉，它處于一個疏水環(huán)境，此疏水環(huán)境對血紅蛋白的可逆載氧功能起著非常重要的作用。Fe()在血紅蛋白中始終是以+2價還原態(tài)存在的，若被氧化成Fe()，則稱為高鐵血紅蛋白，它就失去了可逆載氧功能。 血紅素輔基與血紅蛋白均以非共價鍵相連，其中包括 Fe()與近端組氨酸(F8His)上的N上的配位鍵；卟啉環(huán)側(cè)鏈丙酸陰離子與蛋白氨基酸側(cè)鏈之間的鹽橋；以及卟啉環(huán)中乙烯基與蛋白的疏水相互作用。在酸性條件下，由于蛋白的變性而使這些作用變得很弱，以至于高鐵血紅素可以從血紅蛋白的疏水區(qū)中游離出來。利用高鐵血

3、紅素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性質(zhì)，用多次丁酮萃取的方法將血紅素與蛋白分離。分離得到的脫輔基血紅蛋白(ApoHb)可以用金屬卟啉化合物(例如高鐵血紅素、鈷卟啉、銅卟啉等)進行重組，生成各種不同金屬卟啉的血紅蛋白。 由于高鐵血紅蛋白的紫外可見吸收光譜中，在405nm處有很強的特征吸收峰，而脫輔基血紅蛋白只在280nm處有蛋白的特征吸收峰，當將高鐵血紅素加入ApoHb溶液中后，重組成功的高鐵血紅蛋白又會在405nm處出現(xiàn)它的特征吸收峰，因而血紅蛋白的脫輔基與重組試驗均可用紫外可見分光光度計進行檢測。三、實驗方法 1. 氧合血紅蛋白的制備(供全班學(xué)生使用) 在市血站購買一袋人血，

4、用高速冷凍離心機4000r/min離心10min，取下層血球加四倍體積的0.9% NaCl洗血球，再用4000r/min離心10min，如此重復(fù)23次，取下層血球，按11(v/v)體積比加甲苯，振蕩2分鐘以上，使血球破膜，8000r/min離心20min，棄去上層甲苯和中層脂肪，取下層血球沉淀，加10分之一沉淀體積的9% NaCl，激烈振蕩混合，4000r/min離心10min，棄沉淀，取上層紅黑色血紅蛋白溶液，再用8000r/min離心10min，棄上層，取下層血紅蛋白溶液用濾紙過濾，因過濾很慢，可放4冰箱內(nèi)過濾過夜，然后裝透析袋，4對H2O透析除NaCl和甲苯，換23次予冷的H2O，由透析

5、袋內(nèi)取出血紅蛋白溶液置入一錐形瓶，取樣分析血紅蛋白(Hb)的濃度：取5ml Hb，加3.0ml H2O(稀釋601倍)，用分光光度計作250nm700nm的掃描，并檢測Hb在415nm、541nm和576nm處的三個特征峰值：A415、A541和A576，已知這三個特征峰的吸光系數(shù)值為： e415 =125 l/mmol、e541 =13.5 l/mmol、e576 =14.6 l/mmol。由公式： 濃度C=(A×稀釋倍數(shù))/ e，即可計算出制備的氧合血紅蛋白Hb的濃度CHb。 2. 氧合血紅蛋白(Hb)氧化成高鐵血紅蛋白取已知濃度(約36 mmol/L)的氧合血紅蛋白2 ml，置

6、于5 ml小燒杯或10 ml試管內(nèi)放入冰浴，用下式計算需加入過量1.3倍的K3Fe(CN)6 的量 (10mg/ml)(Mw=329.26)： 用移液管吸取所需加入的K3Fe(CN)6，在緩慢攪拌下滴入Hb內(nèi)，直到血紅蛋白的顏色從鮮紅色變成棕黑色。裝一根1.8cm×22cm的Sephadex G-25凝膠脫鹽柱，用10mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液平衡脫鹽柱，將制成的高鐵血紅蛋白溶液全部上柱，用4H2O洗脫，用量筒收集高鐵血紅蛋白，再用H2O將其稀釋至1.01.5mmol/L (因為過濃不利于脫輔基，太稀又會脫不完全)，記錄總體積，取樣稀釋200300倍，作250700nm的

7、掃描，得重組前高鐵血紅蛋白的紫外可見吸收光譜圖，檢測峰值A(chǔ)405。 3.脫輔基 (以下步驟均在冰浴或4下進行)高鐵血紅蛋白用1.0mol/L HCl粗調(diào)，再用0.1mol/L HCl細調(diào)溶液pH=1.82.0 (這一步是關(guān)鍵，pH太高，脫輔基不完全，pH過低蛋白會變性)，將溶液置入具塞試管內(nèi)，加入等體積予冷丁酮，手搖振蕩萃取，靜止分層，棄上層丁酮，取下層溶液，如此反復(fù)萃取幾次，直至上層丁酮無色為止。取下層淺綠色脫輔基后蛋白溶液裝透析袋，4對 1L 5 mmol/L NaHCO3透析0.51 h，以除HCl，再對H2O(4)透析兩次，以除丁酮，再對4 200 ml 0.1mol/L pH7.0磷

8、酸鹽緩沖液透析1 h，中間取出透析袋倒置二次（此時會出現(xiàn)少量白色變性蛋白沉淀）。取出袋內(nèi)溶液，用8000r/min離心10 min(4)，取上層清液，測體積(脫輔基血紅蛋白ApoHb)，立即存于冰浴。取樣稀釋1020倍，作250nm-700nm掃描，作峰檢測得A278蛋白吸收峰值，(以0.1mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液作參比)。計算脫輔基血紅蛋白(ApoHb)的濃度CApoHb： （ApoHb的 e278=13.1 L/mmol） 4. 重組高鐵血紅蛋白取3.0ml ApoHb，用0.01mol/L NaOH配制5mg/ml的高鐵血紅素(Hemin，Mw=651.5) ，計算Hemin的加入量(過量1.5倍)： 緩慢攪拌下，用1015min滴加所需體積的Hemin到3.0ml ApoHb中，并在冰浴中再放置1 h，用1mol/L NaOH粗調(diào)和0.1mol/L NaOH細調(diào)溶液pH=910，溶液顏色變?yōu)樽睾谏?。再用G-25脫鹽柱脫去過量的Hemi