志賀菌_沙門菌和霍亂弧菌多重PCR快速檢測體系的建立

1、志賀菌、 沙門菌和霍亂弧菌多重 PCR 快速檢測體系的建立劉家云 龍銦 蘇明權 樊新 張建芳 郝曉柯【 摘要】 目的 建立快速檢測志賀菌、 沙門菌和霍亂弧菌的多重 PCR 方法。 方法 根據(jù)志賀菌 ipa H 基因、 沙門菌 ipaB 基因及 霍亂弧菌 EPSM 基因設計特異性 PCR 引物 , 加熱煮沸法制備 DNA 模板 , 進行 PCR 擴增及瓊脂糖電泳檢測。 結(jié)果 應用所建立的多 重 PCR 方法能分別或同時快速、 特異地檢測出志賀菌 606bp 、 沙門菌 314bp 和霍亂弧菌 482bp 的目的基因。 結(jié)論 初步建立了靈敏、 特異的一步法檢測志賀菌、 沙門菌和霍亂弧菌的多重 PC

2、R 體系 , 可用于高危腹瀉致病菌的早期快速診斷。 【 關鍵詞】 志賀菌 , 福氏 ; 沙門菌 , 鼠傷寒 ; 弧菌 , 霍亂 ; 多重 PCR 【 中國圖書資料分類號】 R37812E stab lishm ent of a system for simu ltaneous d etection of Shigella s pp. , Salmonella s pp. and Vibrio cholerae w ith mu lti 2 plex PCRLiu Jiayun , Long Y in , Su Mingquan , et al 1Department of Clinical ,

3、 X ijing , Fourth Military Medical University , X i an 710032, China【 Abstract 】 Objective T o establish a multiplex polymerase chain (for of S hi gella spp. , S almonella spp. and Vibrio cholerae . M ethods Based antigen H (ipa H in S hi gella spp. , invasion plasmid antigen B (ipaB S protein (EPSM

4、 in V. cholerae , three pairs of primer were the method and multiplex PCR was performed with premix Taq in an ABI 2720The were then analyzed by using agarose gel electrophoresis. R esu lts Under the opti 2 mized conditions , yielded 6062bp product from S hi gella spp. , a 3142bp product from Salmone

5、lla spp. , and a 4822bp product from V. cholerae , respectively. When the DNA extraction of multiple target organisms was included in the same reaction , two or three corresponding amplicons in different size were observed. C onclusions A rapid , specific and sensitive multiplex PCR system for simul

6、tane 2 ous detection of S hi gella spp. , S almonella spp. and V. cholerae has been established. The results suggest that the simultaneous amplifi 2 cation of several genes by multiplex PCR may provide an efficient and rapid diagnostic method for severe diarrhea. 【 K ey w ords 】 S hi gella f lexneri

7、 ; Salmonella ty phimurium ; Vibrio cholerae ; multiplex PCR 志賀菌、 沙門菌和霍亂弧菌是感染性腹瀉常見的 致病菌 , 可導致細菌性痢疾、 食物中毒、 傷寒、 霍亂等腸 道傳染病 1-2。 因此 , 快速檢測樣品中的致病菌對于這 些疾病的預防和治療具有重大意義 , 但常規(guī)的微生物 檢測方法需分離培養(yǎng)、 生化和血清學鑒定等多個步驟 , 操作復雜 , 周期長。 多重 PCR 技術能在同一 PCR 反應 體系內(nèi)實現(xiàn)對多種病原體 DNA 的同步快速擴增 , 為病 原微生物的鑒定提供了快速、 靈敏、 特異的方法。 本研 究根據(jù)三種高危腹瀉致病菌

8、的特異性基因序列設計引 物 , 建立了一步法檢測三種病原體的多重 PCR 方法 , 可用于腹瀉病原菌的快速診斷。1 材料與方法111 材料 痢疾志賀菌福氏 2a (S hi gella f lexneri 2a 、 沙門菌 (S almonella ty phimurium 及霍亂弧菌 (Vibrio cholerae 為本室保存菌株。 Taq DNA 聚合酶、 MgCl 2、 dNTP mixture 、 DNA marker 均為 T a K aRa 公司 產(chǎn)品。112 多重 PCR 特異性引物的設計 根據(jù)志賀菌的侵 襲質(zhì)粒抗原 H (invasion plasmid antigen H

9、,ipa H 基因、 沙門菌的侵襲質(zhì)?？乖?B (invasion plasmid antigen B ,ipaB 基因及霍亂弧菌腸毒素細胞外分泌蛋白 (entero 2 toxin extracellular secretion protein ,EPSM 序列設計各 菌引物 3, 擴增片段長度分別為 606、 314、 482bp (表 1 。 引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。113 模板制備 取斜面菌落于盛有堿變性裂解液的 115ml 離心管中 , 充分懸浮菌體 , 置 100 水中煮沸表 1 用于檢測志賀菌、 沙門菌及霍亂弧菌的多重 PCR 引物 T ab le 1 Multi

10、plex PCR primers used to detect S hi gella spp 1, Salmonella spp 1and V 1cholerae細菌名稱目的基因引物序列產(chǎn)物大 小 (bp 志賀菌 ipaH F:5 2CCTTG ACCG CCTTTCCG AT A 23 606 R:5 2CAG CCACCCTCTG AGGT ACT 23沙門菌 ipaB F:5 2GG ACTTTTT AAAAG CGG CGG 23 314 R:5 2G CCTCTCCCAG AG CCGTCTGG 23霍亂弧菌 EPSM F:5 2G AATT ATTGG CTCCTGTG CAGG

11、CT 23 482【 作者簡介】 劉家云 , 醫(yī)學博士 , 主治醫(yī)師。 主要從事臨床感染性疾病 的實驗室診斷及研究工作。 已發(fā)表論文 15篇 , 參編專著 2部。 E 2mail : jiayun fmmu 1edu 1cn【 作者單位】 710032 陜西 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院檢驗科 (劉家云、 蘇明權、 樊新、 張建芳、 郝曉柯 , 中醫(yī)科 (龍銦 【 通訊作者】 郝曉柯 ,E 2mail :haoxkgfmmu 1edu 1cn 0 9 1 1 10min ,10000r/min 離心 1min 后取上清液作為模板。按上述方法分別制備痢疾志賀菌、 沙門菌及霍亂弧菌 模板 DNA , 將

12、3種模板分別或混合進行 PCR 擴增。114 多重 PCR 體系 PCR 反應總體積為 25l , 其中10×Buffer 215l ,25mmol/L MgCl 2115l ,10mmol/L dN TP 015l , Taq 酶 3U/l , 模板 DNA 3l , 用于擴增目的基因的引物各 1l , 余下體積用無菌雙蒸水補足。 在ABI 2720型 DNA 擴增儀上進行 PCR 反應 , 參數(shù)為 :94 預變性 5min ,94 40s ,62 50s ,72 1min , 共 35個循環(huán) ;72 延伸 7min 。 擴增結(jié)束后取 PCR 產(chǎn)物 (5l 在 15g/L 瓊脂糖凝

13、膠上電泳 , 觀察并記錄結(jié)果。 在上 述 PCR 反應體系中 , 同時加入 2對或 3對 (痢疾志賀 菌、 沙門菌及霍亂弧菌 PCR 引物及相應的模板 DNA , 用上述條件進行擴增及產(chǎn)物檢測。 115 多重 PCR 體系的特異性試驗 以痢疾志賀福氏 2a 菌、 沙門菌、 霍亂弧菌和非目的菌分別制備模板 , 的多重 PCR 體系條件下擴增 , 2 結(jié) 果211 PCR 3對特異性引物按所需擴增濃度混合后 , 加入上述 PCR 擴增體系中進行 PCR 擴 增 , 結(jié)果未出現(xiàn)任何擴增區(qū)帶 , 而陽性對照出現(xiàn) 3條特 異性擴增區(qū)帶 , 表明引物之間不會因相互干擾而出現(xiàn) 假陽性結(jié)果。 212 多重 P

14、CR 擴增結(jié)果 按照優(yōu)化的參數(shù)進行多重 PCR , 擴增的結(jié)果為單一模板出現(xiàn)一條特異性擴增區(qū) 帶 , 混合模板出現(xiàn) 2條或 3條特異性擴增區(qū)帶 (圖 1 , 與預期的擴增結(jié)果一致。圖 1 目的菌株的多重 PCR 擴增結(jié)果M1. DL2000marker ; M2. 100bp marker ; 1. S hi gella f lexneri 2a ;2. Vibrio cholerae ; 3. S almonella ty phimurium ; 4. S hi gellaf lexneri 2a +Vibrio cholerae ; 5. S hi gella f lexneri 2a +

15、S almonella ty phimurium ; 6. Vibrio cholerae +S almonella ty phimurium ; 7. S hi gella f lexneri 2a +Vibrio cholerae +S almonella ty phimuriumFigu re 1 Multiplex PCR amplification of target bacteria3 討 論多重 PCR 技術可在同一 PCR 反應體系內(nèi)加入多對特異性引物一次擴增多個 DNA 片段 , 從而實現(xiàn)多種 病原體 DNA 的同步快速鑒定 4, 但它并非簡單地將多 對特異性引物混合在同一

16、PCR 反應體系內(nèi)就可進行 PCR 擴增 , 因反應體系中含有多對特異性寡聚核苷酸 引物 , 對引物的設計和選擇比常規(guī) PCR 反應更為嚴 格 , 必須充分考慮到各引物間的相關性和合理性。 ipa H 基因是志賀菌屬的特異性毒力基因 , 是侵襲力的 特異性標志 , 沙門菌的 ipaB 基因編碼吸附和侵襲上皮 細胞的表面抗原 , 霍亂弧菌 EPSM 編碼腸毒素細胞外 分泌蛋白 , 均是保守的基因 5-7。 因此 , 本研究分別選 用志賀菌 ipa H 、 沙門菌 ipaB 、 霍亂弧菌 EPSM 為目的基 因以特異地檢測目的致病菌。 引物設計時已排除 PCR 擴增產(chǎn)物間可能發(fā)生的錯配 , , 比

17、 例、 , 引 在 PCR 模板制備 , 100 加熱煮沸 30min 破細胞 , 離 心取上清為模板 , 較常規(guī)的細菌基因組 DNA 提取方法 簡便、 快速。本研究初步建立了快速檢測志賀菌、 沙門菌和霍 亂弧菌的多重 PCR 體系 , 實現(xiàn)了對多種病原體 DNA 的同步快速擴增 , 為病原微生物的鑒定提供了快速、 靈 敏、 特異的檢測方法?！緟⒖嘉墨I】1G ascon J 1E pidem iology , etiology and pathophysiology of traveler s diarrhea 1Digestion , 2006,73(Sup :1022G adewar S

18、, Fasano A 1Current concepts in the evaluation , diagnosis and management of acute infectious diarrhea 1Curr Opin Pharmacol , 2005,5(6 :5593K ong RY, Lee SK, Law TW , et al 1Rapid detection of six types of bacterial pathogens in marine waters by multiplex PCR 1Water Res , 2002, 36(11 :28024E lnifro EM , Ashshi AM , C ooper R J , et al 1Multiplex PCR :ptim i 2zation and application in diagnostic virology 1C lin Microbiol Rev , 2000,13(4 :5595Li Y, Mustapha A 1S i