紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程

1、陜西香菊藥業(yè)集團有限公司GMP管理文件題 目紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程編 碼：XJWS/QC20403共7頁第1頁制 定審 核批 準制定日期審核日期批準日期頒發(fā)部門GMP辦頒發(fā)數(shù)量2份生效日期分發(fā)單位質(zhì)量技術(shù)部、綜合部版 本 號A/01. 目的：建立用紫外分光光度法檢測藥品質(zhì)量的標準操作規(guī)程，保證標準操作。 2. 引用標準：中華人民共和國藥典（2015年版四部）通則。3. 范圍：本標準適用于用紫外分光光度法進行的檢測。 4. 責任人： QC檢驗員對本標準的實施負責，QC主管負責檢查監(jiān)督。5. 內(nèi)容：5.1定義：紫外分光光度法是通過被測物質(zhì)在紫外光區(qū)的特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對

2、該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法，本法在藥品檢驗中主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測定。 5.1.1. 定量分析通常選擇在物質(zhì)的最大吸收波長處測出吸收度，然后用對照品或百分吸收系數(shù)計算出被測物質(zhì)的含量，多用于制劑的含量測定。 5.1.2. 對已知物質(zhì)定性可用吸收峰波長或吸光度比值作為鑒別方法；若化合物本身在紫外光區(qū)無吸收，而雜質(zhì)在紫外光區(qū)有相當強度的吸收，或在雜質(zhì)的吸收峰處該化合物無吸收，則可用本法作雜質(zhì)檢查。5.2 原理：物質(zhì)對紫外輻射的吸收，是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生的，因此，紫外吸收主要決定于分子的電子結(jié)構(gòu)，故紫外光譜又稱電子光譜。有機化合物分子結(jié)構(gòu)中如含有共軛體系、芳香環(huán)或發(fā)色基

3、團，均可在近紫外區(qū)（200400nm）或可見光區(qū)（400760nm）產(chǎn)生吸收。通常使用的紫外分光光度計的工作波長范圍為190900nm，因此又稱紫外-可見分光光度計。紫外吸收光譜為物質(zhì)對紫外區(qū)輻射的能量吸收圖。朗伯·比耳（lambert-Beer）定律為光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依據(jù)，其數(shù)學表達式為： A=lg1=ECLT題 目紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁 第2頁式中：A 為吸光度 T 為透光率 E 為吸收系數(shù) C 為溶液濃度 L 為光路長度若溶液的濃度（C）為1%（g/ml），光路長度（L）為1cm，相應(yīng)的吸收系數(shù)為百分吸收系數(shù)

4、，以E表示。若溶液的濃度（C）為摩爾濃度（mol/L），光路長度為1cm時，則相應(yīng)吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以來表示。5.3. 儀器： 5.3.1. 紫外分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。5.3.2. 為了滿足紫外可見光區(qū)全波長范圍的測定，儀器備有二種光源，即氘燈和碘鎢燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見光區(qū)。5.3.3. 單色器通常由進光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件、聚焦透鏡或反射鏡等組成，色散元件有棱鏡和光柵二種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對200400nm波長光的色散能力很強，對600nm以上波長的光色散能力較差，棱鏡色散所得

5、的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達到色散作用，故常稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長作線性排列，故為勻排光譜，雙光束儀器多用光柵為色散元件。5.3.4. 檢測器有光電管和光電倍增管二種。5.3.5. 紫外分光光度計依據(jù)其結(jié)構(gòu)和測量操作方式的不同，可分為單光束和雙光束分光光度計二類。單光束分光光度計有些仍為手工操作，即固定在某一波長，分別測量比較空白、樣品或參比的透光率或吸收度，操作比較費時，用于繪制吸收光譜圖時很不方便，但適用于單波長的含量測定。雙光束分光光度計藉扇形鏡交替切換光路，使光分成樣品（S）和參比（R）兩光束，并先后到達檢測器，檢測器信號經(jīng)調(diào)制分離成兩光路對應(yīng)信號，信號的

6、比值直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計操作簡單，測量快速，自動化程度高，但作含量測定時，為求準確起見，仍宜用固定波長測量方式。5.4. 紫外分光光度計的檢定：題 目紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁 第3頁5.4.1.1. 波長準確度的允差范圍：雙光束光柵型紫外-可見分光光度計波長準確度允許誤差為±0.5nm。單光束棱鏡型350nm處±0.7nm，500nm處±2.0nm，700nm處±4.8nm。5.4.1.2. 波長準確度檢定方法： 5.4.1.2.1. 用低壓汞燈檢定，關(guān)閉光源，將汞燈（用筆式汞燈最方便）直接對準進光

7、狹縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測定方式，采用波長掃描方式，掃描速度“慢”（如15nm/min），響應(yīng)“快”，最小狹縫寬度（如0.1nm）量程0-100%，在200800nm范圍內(nèi)單方向重復掃描3次，由儀器識別記錄各峰值（若儀器無“峰檢測”功能，必要時可對指定波長進行“單峰”掃描）。單光束儀器以751G型為例，可將選擇開關(guān)放在×0.1位置，透光率讀數(shù)放在100（或選擇開關(guān)放在×1，透光率放在10），關(guān)小狹縫，打開光閘門，緩緩轉(zhuǎn)動波長盤，尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長讀數(shù)不符，應(yīng)調(diào)節(jié)儀器左側(cè)準直鏡的波長調(diào)整螺絲。如波長向短波長方向移動，應(yīng)順時針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)

8、整螺絲，如向長波長方向移動，則應(yīng)反時針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲，調(diào)整好后，再按汞燈的下列譜線測試，記錄每條譜線與儀器波長讀數(shù)的誤差。用于檢定紫外-可見分光光度計的汞燈譜線波長：237.83、253.65、275.28、296.73、302.15、313.16、334.15、365.02、365.48、366.33 、404.66 （紫色）、435.83（藍色）、546.07（綠色）、 576.96（黃色）、579.07nm。5.4.1.2.2用儀器固有的氘燈檢定：本法主要用于日常工作中波長準確度的核對，取單光束能量測定方式，測量條件同上述低壓汞燈的方法，對486.02及656.10nm二單峰進行單

9、方向重復掃描3次。5.4.1.2.3用氧化鈥玻璃檢定：將氧化鈥玻璃放入樣品光路，參比光路為空氣，按測定吸收光譜圖方法測定。校正自動記錄儀器時，應(yīng)考慮記錄儀的時間常數(shù)，測定樣品與校正時取同一掃描速度。氧化鈥玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2、637.5nm波長處有尖銳的吸收峰，可供波長檢定用。氧化鈥玻璃因制造的原因，每片氧化鈥的吸收峰波長有差異，應(yīng)使用經(jīng)計量部門校驗過的。5.4.1.2.4用高氯酸鈥溶液檢定：本法可供沒有單光束測定功能的雙光束紫外分光光度計波長準確度檢定用。高氯酸鈥溶液的配制方法：取10%高氯酸為溶劑，加入氧化題

10、目紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁 第4頁鈥（HO2O3），配成4%溶液即得。高氯酸鈥溶液較強的吸收峰波長為241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。 如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的，記錄的波長可能因記錄筆滯后而非真實波長，為了準確測定，建議采用定點檢定而不用掃描方式。 5.4.2. 吸光度準確度：精密稱取在120干燥至恒重的基準重鉻酸鉀約60mg，置1000ml量瓶中，用硫酸液（0.005mol/L）溶解并稀釋至1000ml，用配對的

11、1cm石英池，以硫酸液（0.005mol/L）為空白，在235、257、313、350nm分別測定吸光度，然后換算成E，測得值應(yīng)符合下表中規(guī)定的允差范圍（±1%）。 分光光度法允差范圍波長（nm）吸收度強度吸收系數(shù)（E）允差范圍235257313350最小最大最小最大124.5144.048.6106.6123.0126.0142.8146.247.050.3105.5108.5 分辨率、雜散光、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項檢定，按中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程JJG682-90雙光束紫外可見分光光度計檢定規(guī)程執(zhí)行，并符合有關(guān)項下的規(guī)定。日常常規(guī)測定主要是對以上兩項時常檢查。 5

12、.5. 樣品測定操作方法：5.5.1. 吸收系數(shù)測定（性狀項下）：按各該品種項下規(guī)定的方法，配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測吸收度，并計算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。5.5.2. 鑒別及檢查：按各該品種項下規(guī)定的方法，測定供試品溶液在有關(guān)波長處的最大及最小吸收，有的并須測定其各最大吸收峰值，或最大吸收與最小吸收的比值，均應(yīng)符合規(guī)定。 5.5.3. 含量測定：5.5.3.1. 對照品比較法：按各該品種項下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的（100±10）%以內(nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光

13、度。題 目紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁 第5頁5.5.3.2. 吸收系數(shù)法：按各該品種項下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長及該波長±1nm處測定其吸收度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計算含量。采用吸收系數(shù)法，應(yīng)對儀器進行校正后測定，如測定新品種的吸收系數(shù)，需按“吸收系數(shù)測定法”的規(guī)定進行。5.5.3.3. 計算分光光度法：采用該法的品種，應(yīng)嚴格按該品種項下規(guī)定的方法進行，用本法時應(yīng)注意：有一些吸收度是在供試品或其成分吸收曲線的上升或下降陡坡部測定，影響精度的因素較多，故應(yīng)仔細操作，盡量使測定供試品和對照品的條件一致；若該品種不用對照品，則應(yīng)在

14、測定前對儀器作仔細的校正和檢定。5.6. 注意事項：5.6.1. 試驗中所用的量瓶、移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。5.6.2. 使用的石英吸收池必須潔凈。用于盛裝樣品、參比及空白溶液的吸收池，當裝入同一溶劑時，在規(guī)定波長處測定吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配對使用，否則必須加以校正。取吸收池時，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝盛樣品溶液，以池體積的4/5為度，測定揮發(fā)性溶液時應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面，可先用醮有空白溶劑的擦鏡紙擦拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時應(yīng)注意每次放入方向相同。5.6.3使用

15、后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存。吸收池如污染不易洗凈時，可用硫酸，發(fā)煙硝酸（3：1V/V）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時，吸收池不宜在清潔液中長時間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會損壞吸收池的光學表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。5.6.4. 測定前應(yīng)先檢查所用的溶劑在測定供試品所用的波長附近是否符合要求，可用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白，測定其吸收度，應(yīng)符合下表規(guī)定。以空氣為空白測定溶劑在不同波長處的吸收度的規(guī)定 波長范圍（nm） 220240 241250 251300 300以上 吸收度 <0.4 <0.2 <0.1 &

16、lt;0.05每次測定時應(yīng)采用同一廠牌批號，混合均勻的一批溶劑。題 目紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁 第6頁5.6.5. 稱量應(yīng)按藥典規(guī)定要求。配制測定溶液時，稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少；轉(zhuǎn)移稀釋時，所取容積一般應(yīng)不少于5ml。含量測定供試品應(yīng)取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應(yīng)稱取2份。吸收系數(shù)檢查也應(yīng)稱取供試品2份，平行操作，每份結(jié)果對平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。5.6.6. 供試品測試液的濃度，除各該品種項下已有注明外，供試品溶液的吸收度以在0.30.7之間為宜，吸收度在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸收度線性

17、范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。5.6.7. 選用儀器的狹縫寬度應(yīng)小于供試品的吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度會偏低，狹縫寬度的選擇應(yīng)以減小狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準，對于中國藥典紫外測定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但對某些品種如青霉素鉀及鈉的吸收度檢查則用1nm縫寬或更窄，否則其264nm的吸收度會偏低。5.6.8. 測定時除另有規(guī)定外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰±2nm處，再測幾點的吸收度，以核對供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸收度最大的波長作為測定波長。除另有規(guī)定外吸收度最大波長應(yīng)在該品種項下規(guī)定的波長±1nm以內(nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長的準確度。

18、5.7. 結(jié)果計算：5.7.1. 對照品比較法：可根據(jù)供試品溶液及對照品溶液的吸收度與對照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計算含量。 A樣：A對=C樣：C對 C樣=A樣/A對×C對 式中：A為吸收度值；C為測試液濃度（以mg/ml計）。 5.7.2. 吸收系數(shù)法：中國藥典規(guī)定的吸收系數(shù)，系指E，即在指定波長時，光路長度為1cm，試樣濃度換算為1%（g/ml）時的吸收度值，故應(yīng)先求出被測樣品的E值比較，可計算出供試樣品的含量。 A E（樣品）= C·L 式中：A為供試品溶液測得的吸收度值；題 目紫外分光光度法檢測標準操作規(guī)程編碼： XJWS/QC20403共7頁 第7頁 C為供試品溶液的百分濃度，即100ml中所含溶質(zhì)的克數(shù)；L為吸收池的光路長度（cm）； 供試品的含量%=E（樣品）×100%E（標準） 式中：E（樣品）為根據(jù)前式計算出的供試品的百分吸收系數(shù)； E（標準）為藥典或標準中規(guī)定的百分吸收系數(shù)。 5.8. 吸收系數(shù)測定法：本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測定。5.8.1. 測定方法