細(xì)胞免疫熒光步驟

1、GB8878185555334563BT9125XW創(chuàng)作編號(hào)上創(chuàng)作者：鳳嗚大王*方法一：1 .首先需要把細(xì)胞養(yǎng)在玻璃片上（懸浮細(xì)胞需要用多聚賴氨酸包被過(guò)的玻璃片）2 .然后在4%PFA里面室溫下固定30分鐘,PBS洗兩次,0.1% TX-100室溫下作用1 -2分鐘使細(xì)胞膜通透。3 .接下來(lái)進(jìn)行熒光標(biāo)記，需要在一個(gè)大的容器（面積大，扁平狀的，比如大的培養(yǎng)皿） 里面，放一張用水打濕的濾紙，以保持濕度。4 .剪一片合適大小的parafilm ,在上面滴上稀釋在1%BSA/TBS中的一抗（稀釋倍數(shù) 依具體抗體而定），每個(gè)玻璃片30ul足夠，把玻璃片蓋在上面（細(xì)胞面朝下）,室 溫下孵育30分鐘，然后在

2、PBS里洗三次。5 .接下來(lái)二抗孵育步噱同上。6 .最后，在載玻片加上mounting medium （大約每個(gè)玻璃片加10ul）,把玻璃片放上 去（細(xì)胞面朝下），37度30分鐘，然后就可以在熒光顯微鏡下觀察了。7 .抗體很重要，不能有非特異性結(jié)合。你可以先做WB檢測(cè)一下你的抗體，看看有沒(méi) 有雜帶。8 .雙標(biāo)的話，可以把兩個(gè)一抗一起加或者分別標(biāo)記兩次（可以都試一下看看那種方法 合適如果一個(gè)抗體需要二抗，一個(gè)是直接熒光標(biāo)記的，可以把熒光標(biāo)記的那個(gè) 和另外一個(gè)的二抗一起加。方法二：1 .選取一抗時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物,我用的是來(lái)源于rabbit和rat的抗體，二抗則 是不同熒光信號(hào)標(biāo)記 的，我用

3、的是donkey anti-rabbit-FITC （綠）和donkey anti-rat-Tex-Red （紅 2 .我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育?？贵w濃度、孵育時(shí)間要仔 細(xì)摸索，我感覺(jué)一抗4度孵育過(guò)夜比較好，背景比較清晰。3 .我的陽(yáng)性對(duì)照用的是陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG,熒光標(biāo) 記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。4 .封閉血清與二抗來(lái)源動(dòng)物一致，我用的是10%的正常donkey血清。5 .其余步驟同一般免疫靈光單標(biāo)操作。方法三：1 .片子的制作：可以做細(xì)胞爬片，細(xì)胞甩片，還有直接在24well/12well/96well中直接 染色2 .細(xì)胞爬片的制

4、作：直接購(gòu)買公司的已經(jīng)處理過(guò)的細(xì)胞爬片,要是自己制作的話,就 用無(wú)菌的蓋玻片用多聚賴氨酸處理后讓細(xì)胞自己爬片3 .細(xì)胞甩片：需要甩片機(jī)將細(xì)胞懸液均勻甩到玻片上。4 .其實(shí)小的well的話，可以直接拿來(lái)染色，沒(méi)問(wèn)題的。5 .固定：用PBS洗去培養(yǎng)液，用固定液（如甲篇口丙酮；4%多聚甲醛；酒精。）固 定細(xì)胞。6 .內(nèi)源性過(guò)氧化物酶處理，3%過(guò)氧化氫處理細(xì)胞（選作，二抗連HRP得必做，其他 的如做免疫熒光染色不用做7 .通透（胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白需要做；細(xì)胞膜蛋白不需要做），一般選用Triton-X100 來(lái)做細(xì)胞通透，濃度和時(shí)間需要摸索,一般是0.1-5% ,處理時(shí)間為1-30分鐘，級(jí) 個(gè)別需要到

5、1-2小時(shí)。8 .封閉：洗去通透液，用二抗同源的血清約10%的濃度in PBS中封閉半小時(shí)，也可以 選用5-10%脫脂奶粉。封閉結(jié)束后千萬(wàn)不要洗，直接上一抗。9 .一抗：具體你想做什么樣的蛋白，咨詢抗體公司如santa cruze.Abcam,sign】a.。選取 具體的抗體，但是一抗的稀釋濃度也是要摸索，抗體稀釋液可以購(gòu)買抗體公司現(xiàn) 成的，對(duì)于新手還是挺好的。時(shí)間一般是4度過(guò)夜或者37度1小時(shí)。一抗最好還 是選用外國(guó)抗體公司的抗體。10 .洗去一抗。11 .上二抗，二抗一般抗體公司會(huì)給你推薦的，你在其中選上一個(gè)就行了，自己選國(guó) 產(chǎn)的也行，就是選在哪個(gè)動(dòng)物體內(nèi)做的一抗，二抗就選抗那個(gè)動(dòng)物的就行

6、了。二 抗的濃度也是需要摸索的，抗體稀釋液和一抗相同就行了。二抗的時(shí)間一般是37 度半小時(shí)。12 .底物顯色（選作，二抗連得是酶的必做，按試劑盒的說(shuō)明書添加就行了，顯色時(shí) 間可能需要摸索，以免顯色過(guò)度引起假陽(yáng)性；二抗連得是熒光報(bào)告的不用做）13 .洗去二抗，染核14 . DAPI 或者 Hoechst 染核15 .洗去染核液，加PBS ,上鏡觀察。方法四：(1)細(xì)胞準(zhǔn)備。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋 玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì) 胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌(lOOOrpm , 5min)2次，用細(xì)胞離心甩

7、片機(jī)制 備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。(2)固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的 PBS中4C保存3個(gè)月。PBS洗滌3x5min。(3)通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì) 胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白 的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min0通透后用PBS洗滌3x5 min0(4)封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30mino一抗結(jié)合。室溫孵育lh或者4過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。(6)二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育lh。PBST漂洗3次

8、，每次 沖洗5min后，再用蒸儲(chǔ)水漂洗一次。(7)封片及檢測(cè)。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。方法五：1 .漂洗血清蛋白PH7.2-7.4 , 37度PBS 2小時(shí).2 -20度甲醇固定20分鐘后，自然、干燥10分鐘3 . PBS 洗凈：3min * 34 . 1 %Triton : 25min-30min.酉己成 50ultriton+5nilpBS5 . PBS 洗凈：2 * 5min6 .羊血清封閉：37度，20分鐘7 .一抗，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度1-2小時(shí)8 . 4 度 PBS 洗:爭(zhēng)，3 min * 5 次9 .二抗37度小于一小時(shí)10 .37 度 PBS 洗

9、凈，3*3min11 .涼干封片(封閉液PH8.5 )細(xì)胞免疫熒光步驟:1.細(xì)胞爬片；首先是玻片的處理，普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊， 先用洗衣粉洗干凈，用水沖靜烤干，然后泡酸過(guò)夜，撈酸后流水洗凈，烤干，置于器 皿中高壓滅菌，然后再烤箱中大約8小時(shí)烤干備用。創(chuàng)作編號(hào)工GB8878185555334563BT9125XW創(chuàng)作者：鳳嗚大王*爬片可以在培養(yǎng)皿六孔板或24孑飯中都可，我選擇在培養(yǎng)皿中爬。一為節(jié)約經(jīng)費(fèi)（培 養(yǎng)皿可以重復(fù)利用）二來(lái)覺(jué)得培養(yǎng)皿口大，操作比較方便。培養(yǎng)皿消毒同上，消毒時(shí) 記得消兩把銀子具體操作是：用胰酶消化好細(xì)胞，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液（注意：這一點(diǎn)很重 要，

10、關(guān)系到將來(lái)爬出來(lái)片子的質(zhì)量）取出消毒的培養(yǎng)皿，可以先加少量培養(yǎng)基（以使玻片與培養(yǎng)皿緊密接觸），將玻片小 心放入擺放其中，然后將單細(xì)胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養(yǎng)皿置于37 度5%CO2的暖箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間適時(shí)取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然后在4%多聚甲醛中固定15分鐘， 然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時(shí)操 作過(guò)程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。 將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹 膠徹底干了之后才能做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，要不然玻片會(huì)掉下來(lái)的，就又是

11、前功盡棄了做好 的細(xì)胞爬片可以放在-20保存?zhèn)溆?，具體能保存多長(zhǎng)時(shí)間不太清楚,當(dāng)然盡量早用。2.4%多聚甲醛固定固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇十30%丙酮）；3.PBS 漂洗 5min ；4.0.5% Triton穿孔15inin（丙酶固定法不用透化處理）；5.PBS漂洗2次,每次5min ；6.1%BSA 封閉 30min ；7加入1%BSA稀釋的一抗，于37雜交2h ；8.PBS漂洗2次，每次5min ；9加入1%BSA稀釋的二抗，于37雜交lh ；10.PBS漂洗2次，每次5min ；11.5ug/ml DAPI 染色 2min ；12.抗淬滅封片劑封片。抗淬滅封片劑：2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞爬片!4%多聚甲醛固定lOmin（固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮）PBS 漂洗 5min0.5% Triton 穿孔 15mo（丙酮固定法不用透化處理）PBS漂洗2次，每次5min1%BSA 封閉 30min加入1%BSA稀釋的一抗，于37雜交2h3PBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀釋的二抗，于37雜交lhPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI 染色 2min創(chuàng)作編號(hào)士GB887818555