高效液相色譜儀

1、高效液相色譜儀 任何一種高效液相色譜儀都有7個重要的組成部分，即高壓輸液泵、梯度洗脫裝置、進樣裝置、色譜柱、檢測器、微機處理機、記錄器或色譜數據處理機。 高效液相色譜儀裝置暗示圖7-2所示。 圖7-2高效液相色譜儀裝置暗示圖 1.高壓輸液泵 由于在高效液相色譜法中用法了顆粒直徑很小的色譜柱填充劑，要使流淌相以一定的流速流過色譜柱，就必需用高壓輸液泵。 高壓輸液泵的作用是輸送流淌相。它以一定的流速使流淌相延續(xù)地流經色譜柱和檢測器。因填充劑顆粒直徑小，要求高壓輸液泵壓力恒定，無脈沖；輸出的壓力高達1530mpa，有的達50mpa,輸出的流量有一定的可調整范圍，便于組成梯度洗脫；耐腐蝕，修理便利。

2、高壓輸液泵按其性質可以分為兩類，即目前常用的恒流泵和恒壓泵。 恒流泵輸出的液體流量恒定。恒壓泵輸出的液體壓力恒定，流量是隨著外界壓力的變幻而轉變的。往復式柱塞泵屬于恒流泵，氣動放大泵屬于恒壓泵。 往復式柱塞泵：泵的液腔體積小，約1/41/3ml，易清洗和更換流淌相，適用于外梯度洗脫。主要的缺點是輸出的液體壓力隨柱塞的往復運動而有顯然的壓力脈沖，必需外加壓力阻尼器來使壓力平衡。 氣動放大泵：輸出的壓力恒定無脈沖，結構容易。主要的缺點是不便于調整輸出的流量，不易于梯度洗脫。多用于填裝色譜柱。 2.梯度洗脫裝置 梯度洗脫裝置就是程序控制器，類似氣相色譜儀中的程序升溫，使分析工作特殊便利。梯度洗脫裝置

3、又稱為程序洗脫裝置。 梯度洗脫是在一個色譜分析周期中，將兩種或兩種以上不同極性的流淌相（溶劑），隨著時光按一定程序不斷地轉變濃度，即按一定的比例舉行混合，以達到延續(xù)轉變流淌相極性的目的，使一個復雜組成的混合物樣品中總的性質相差比較多的組分得到彼此分別。 梯度洗脫分為低壓梯度洗脫和高壓梯度洗脫兩類。 低壓梯度洗脫又稱為外梯度洗脫，是在常壓下，將不同極性的流淌相（溶劑）通過程序控制器，使它按預先設定的比例在高壓泵之前混合，再由高壓泵輸入色譜柱，只需一臺泵。 高壓梯度洗脫，又稱為內梯度洗脫，是用兩臺或三臺高壓輸液泵，分離將兩種或三種不同極性的流淌相（溶劑）用泵加壓后，再輸入混合器，經過充分混合后，再

4、輸入色譜柱。 經過梯度洗脫后，流淌相的組成不是單一的，而是混合溶劑，不適用于折光檢測器。 3.進樣裝置 高效液相色譜儀中的進樣裝置有兩種。一種是微量注射進樣器；另一種是帶定量管的六通閥。其作用是將被分析樣品送入色譜柱。 進樣體積或濃度不應超過柱的線性容量。線性容量是引起保留體積減小10時每克柱填料的樣品量。通常要用不同濃度的樣品做試驗，以觀看峰寬、峰對稱性和保留時光是否恒定。普通進樣體積為12ul。 進樣器進樣的方式有兩種。一種是進樣器挺直進樣，進樣時不停泵；另一種是停歇進樣，進樣時停泵。 4.色譜柱 色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，要求其性能穩(wěn)定、容量大、柱效高、分析快。 色譜柱是直管形，

5、柱長為1050cm，柱內徑為24.6mm，材質為優(yōu)質的不銹鋼管，管內壁應涂覆一層玻璃或。當壓力小于7mpa時，可用厚壁玻璃管或石英管。 色譜柱的填裝辦法，按照固定相顆粒直徑的大小可分為三種：當固定相的顆粒直徑大于20um時，用干法裝填；當固定相顆粒直徑小于10 um時，用濕法即漿法填裝；當固定相顆粒直徑在1020um范圍內時，用半干法填裝。 色譜柱的評價辦法有柱效、峰對稱性、色譜柱的滲透性等。 庇護柱的作用是庇護樣品分別柱不被污染，以達到延伸色譜柱的用法壽命的目的。庇護柱接在分別柱前，長510cm，內填裝與分別柱類似的粗顆粒表面多孔的填料，用干法填裝，定期更換。 5.檢測器 高效液相色譜法中檢

6、測器的作用與氣相色譜儀相同，是將各組分在流淌相中的濃度變幻延續(xù)地改變成易測量的信號輸送給記錄器或色譜數據處理機。 截至目前，液相色譜法還沒有一種用途廣泛、抱負的檢測器。為了滿足不同分析對象的要求，往往需要多種類型的檢測器。液相色譜檢測器可分為通用型和挑選型檢測器兩大類。 通用型檢測器對溶質和流淌相的性質都有響應，如示差折光檢測器、電導檢測器等。這類檢測器應用范圍廣，但因受外界環(huán)境，如溫度、流速變幻影響大，其敏捷度低，而且不能舉行梯度洗脫。 挑選型檢測器，如紫外分光檢測器、熒光檢測器等，僅對溶質響應敏捷，而對流淌相沒有響應。這類檢測器對外界環(huán)境的波動不敏感，具有很高的敏捷度，但只對某些特定的物質

7、有響應，因而應用范圍窄?？赏ㄟ^采納柱前或柱后衍生化反應的方式，擴大它們的應用面。 檢測器的主要技術指標如下。 1)基線穩(wěn)定性：噪聲的大小影響檢測器的最小檢測能力，起伏會給小峰辨認和定量帶來棘手，漂移過大則給檢測器的長時光操作造成困難。 2)敏捷度：即檢測器的輸出信號與待分析樣品的量之比。 3)最小檢測能力：指檢測器能夠檢出的物質的最小量或濃度，它與檢測器的噪聲有關，而且由噪聲的大小來確定， 4)線性范圍：指輸出信號與樣品的量或濃度成正比的范圍。普通狀況下，線性范圍的上限值很簡單確定，而下限值因為樣品濃度低，重臨性差，難以確定，因此常用最小檢測量或濃度作為線性范圍的下限值。 下面介紹幾種常用的液

8、相色譜檢測器。 1.紫外光度檢測器 紫外光度檢測器的原理是基于比爾定律， 1g(io/i)bc （7-10） 1g(io/i)=a （7-11） a=bc （7-12） 式中，io為入射光強度；i為光透過介質后的強度；。為溶質分子的汲取系數；b為光在介質中的長度；c為待測組分的濃度；a為吸光度。由式（7-12）可知，吸光度a與待測組分的濃度成正比。 紫外光度檢測器有固定波長、可變波長以及光電二極管陣列檢測器三種，固定波長檢測器測定波長固定（普通為254nm或280nm)，適用于芳烴化合物的檢測。頻繁的環(huán)鏈化合物，含有c=c,c=0,n=0,n=n官能團的化合物，如生物中的許多重要成分蛋白質、酶

9、、芬芳族氨基酸、核酸等以及許多其他有機化合物都在254nm附近有劇烈的汲取，因此常用紫外光度檢測器的固定波長是254nm。而可變波長檢測器可按照試樣性質測定波長，便利靈便，適用面廣。 光電二極管陣列檢測器由211個或更多個二極管組成陣列，每個二極管可檢測特定波長，將汲取后透過的紫外光束分光投射到二極管陣列上，用計算機迅速處理，可獲得更多信息，并能顯示吸光度、波長、時光的三維立體譜圖。 2示差折光檢測器 示差折光檢測器是一種應用廣泛的濃度型檢測器。其原理是基于含有被測組分的流淌相和純流淌相的溶液折射率之差與被測組分在流淌相中的濃度有關，可按照流淌相折射率的變幻，測定試樣組分含量。 3.熒光檢測器 熒光檢測器是一種敏捷度很高、挑選性較好的檢測器。其原理是當入射紫外光強度、溶液的厚度一定，樣品的濃度較低時，溶質受激發(fā)而輻射出的熒光強度與被測組分的濃度成正比，即聽從比爾定律。凡是經紫外光激發(fā)后能輻射出熒光的物質，如許多生物成分、藥物、胺類、維生素、芬芳族化合物、甾族化合物和酶等都可以用熒光檢測器檢測。 4電導檢測器 電導檢測器是按照被測組分浮現時，流淌相電導率變幻而