谷氨酰胺合成酶測(cè)定

1、谷氨酰胺合成酶（GS活性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)原理谷氨酰胺合成酶（GS是植物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，在 ATP 和皿6+存在下，它催化植物體內(nèi)谷氨酸形成谷氨酰胺。在反應(yīng)體系中， 谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為 丫一谷氨酰基異羥肟酸，進(jìn)而在酸性條件下與鐵形 成紅色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在540nm處有最大吸收峰，可用分光光度 計(jì)測(cè)定。谷氨酰胺合成酶活性可用產(chǎn)生的丫一谷氨酰基異羥肟酸與鐵絡(luò)合物的生成量來表示，單位卩mol mg1proteinh l也可間接用540nm處吸光值的大小來表示，單位 A - mg 1 protein h 1O二、實(shí)驗(yàn)儀器與用具 冷凍離心機(jī)；分光光度計(jì)；天平；研缽；恒溫水浴；剪刀；移液管（ 2ml、

2、1ml）三、實(shí)驗(yàn)試劑（1）提取緩沖液（0.05mol/L Tris-HCI , pH8.0）。 內(nèi)含 2mmol/L Mg2+， 2mmol/L DTT， 0.4mol/L 蔗糖。稱取 Tris （三羥甲基氨基甲烷） 1.5295g , 0.1245g MgSO- 7H2Q 0.1543g DTT（二硫蘇糖醇）和 34.25g 蔗糖，去離子水溶解后，用 0.05 mol/L HCl （0.1mol/L = 1ml 的 36%38濃鹽酸加入到100ml去離子水里）調(diào)至pH8.0，最后定容至 250ml；（ 2）反應(yīng)混合液 A（0.1mol/L Tris-HCl 緩沖， pH7.4）。內(nèi)含80mm

3、oI/L M（g+, 20mmoI/L 谷氨酸鈉鹽，20mmoI/L 半胱氨酸和 2mmoI/L EGTA 稱取 3.0590g Tris , 4.9795 gMgSQ 7H2O, 0.8628g 谷氨酸鈉鹽，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA去離子水溶解后，用O.1mol/LHCI調(diào)至pH7.4,定容至250ml;(3) 反應(yīng)混合液B (含鹽酸羥胺，pH7.4)。反應(yīng)混合液A的成分再加入80mmoI/L鹽酸羥胺，pH7.4 ；(4) 顯色劑( 0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和 0.6mol/L HCl 混 合液)。3.3176g TCA(三氯乙酸)，1

4、0.1021g FeCb 6H2O,去離子水溶解后，加 5ml 濃鹽酸，定容至 100ml；(5) 40mmol/L ATP溶液。 稱取0.1210g ATP溶于5ml去離子水中(臨用前配制)四、方法步驟1. 粗酶液提取稱取植物材料0.5-1g與于研缽中，加3ml (實(shí)際情況作調(diào)整)提取 緩沖液，置冰浴上研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中，4C下12,000r.min -1離心20min,上清液即為粗酶液。2. 反應(yīng)1.6ml反應(yīng)混合液B,加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混勻，于37C下保溫半小時(shí)，加入顯色劑1ml,搖勻并放置片刻后， 于5,000 r.min -1下離心10min,取上清

5、液測(cè)定540nm處的吸光值，以 加入1.6ml反應(yīng)混合液A的為對(duì)照。3. 粗酶液中可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取1ml用考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè) 定可溶性蛋白質(zhì) （方法待定， 試著不用定容直接測(cè)， 即取樣品液 1ml， 如蛋白含量高，再適當(dāng)稀釋，加考馬斯亮藍(lán) 5ml,在595nm下測(cè)定吸 光值，注意應(yīng)放置 10min 后在測(cè)，在 1h 內(nèi)比色完）4. 結(jié)果計(jì)算GS 活力二A/（P.V.T）式中A 540nm處吸收值P- 粗酶液中可容性蛋白的質(zhì)量濃度（ mg/mL）V- 反應(yīng)體系中加入的粗酶液體積（ mL）T- 反應(yīng)時(shí)間GS活力是以每毫克酶蛋白在每小時(shí)催化生成的丫一谷氨酰基異羥肟酸與鐵絡(luò)合的產(chǎn)物在540nm處的吸光值的大小來表示注意：在測(cè)酶時(shí),由于各酶活力大小的表示都是以每小時(shí) /min 產(chǎn)生