吸入溴化異丙托品對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道和肺組織M受體的影響

1、吸入溴化異丙托品對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道和肺組織M受體的影響【摘要】目的觀察吸入溴化異丙托品對大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型氣道和肺組織M受體的影響及其規(guī)律。方法通過長期吸入高濃度SO2氣體的方法建立大鼠COPD模型47只, COPD大鼠在密閉箱內(nèi)吸入霧化的0.025%溴化異丙托品溶液10 ml(2次/天,20分鐘/次)，應(yīng)用放射配基結(jié)合法測定大鼠氣道和肺組織M受體。結(jié)果與對照組相比，COPD大鼠吸入溴化異丙托品5天,氣道和肺組織M受體密度無明顯增加，吸入異丙托品30天，M受體的密度顯著升高(P0.05)，停藥6天后，M受體的密度基本恢復(fù)正常。各組平衡離解常數(shù)(Kd)值差異均無顯著

2、性。結(jié)論長期吸入溴化異丙托品可上調(diào)氣道毒蕈堿M受體，但停藥后能較快恢復(fù)，氣道M受體的上調(diào)可能與長期應(yīng)用異丙托品患者停藥后所出現(xiàn)的暫時(shí)性的支氣管痙攣及肺功能惡化有關(guān)。【關(guān)鍵詞】受體，毒蕈堿肺疾病，阻塞性溴化異丙托品The effect of inhaled ipratropium bromide on airway and lung tissue muscarinic receptors in a rat model of COPDYAO Wanzheng, WANG Guoyang, ZHU Hong, et al. Department of Respiratory Medicine, th

3、e Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of inhaled ipratropium bromide on airway and lung tissue muscarinic receptors (MR) in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). MethodsThe rat model of COPD was established by chro

4、nic exposure with high concentrations of SO2 gas, COPD rats inhaled aerosolized 0.025% ipratropium bromide solution 10 ml (twice/d, 20 min/time). The MR was determined by radioligand binding studies with 3H-QNB as the ligand. ResultsCompared with that of control, there was a marked increase in MR de

5、nsity on day 30 of treatment with ipratropium but not on day 5. The MR density decreased and close to normal level on the 6th day after cessation of regular therapy with inhaled ipratropium for 30 days. No significant difference was observed in antagonist affinity (Kd) among different time groups of

6、 ipratropium therapy. ConclusionsChronic exposure to the anticholinergic agent ipratropium bromide produces an up-regulation of airway MR. The airway MR density can recover to normal when treatment stopped. Up-regulation of airway MR is associated with transient bronchoconstriction following cesstio

7、n of regular ipratropium therapy and lung function deteriorated following long-term inhaled ipratropium bromide.【Key words】Receptors, MuscarinicPulmonary disease, obstructiveIpratropium bromide吸入溴化異丙托品對于慢性阻塞性肺疾病(COPD)的短期療效已被大量的臨床實(shí)踐所證實(shí)1， 但其長期應(yīng)用后的臨床效果尚有爭議, 本實(shí)驗(yàn)采用長期吸入高濃度SO2氣體的方法建立大鼠COPD模型, 應(yīng)用放射配基結(jié)合研究的方法

8、測定大鼠氣道和肺組織M受體, 目的在于探索吸入溴化異丙托品對大鼠COPD模型氣道和肺組織M受體的影響及其規(guī)律, 為臨床的抗膽堿治療提供理論指導(dǎo)。 材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠47只, 體重80120 g, 由北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 隨機(jī)分為：（1）COPD溴化異丙托品治療5天組8只，對照組7只；（2）COPD溴化異丙托品治療30天組9只，對照組8只；（3）吸入異丙托品30天后停藥6天組(停止治療6天組)8只，對照組7只。二、方法1.大鼠COPD模型的建立：按照本研究室所采用的方法，并經(jīng)病理檢查及肺功能測定證實(shí)其符合COPD。2.給藥方法2：向體積為20 cm30 cm30

9、 cm的密閉箱內(nèi)霧入0.025%的溴化異丙托品溶液10 ml（霧化液由勃林格殷格翰公司提供，Sm-1 Rosental霧化反應(yīng)發(fā)生器為美國森迪斯公司產(chǎn)品）,每天2次, 調(diào)節(jié)氧氣流量(10 L/min左右)使溶液在1015分鐘霧化完畢, 動(dòng)物在密閉箱內(nèi)吸入氣溶膠20分鐘后取出。對照組用相同的方法吸入10 ml生理鹽水。3.氣道和肺組織細(xì)胞膜標(biāo)本的制備3：放血處死動(dòng)物, 迅速取出氣管、主支氣管及肺臟, 用冰冷的生理鹽水洗去血污, 留左肺作病理標(biāo)本, 將整個(gè)右肺連同氣管、主支氣管一起作為氣道和肺標(biāo)本, 吸干, 稱重后, 移至冰冷的50 mmol/L K+/Na+磷酸緩沖液(pH 7.4)中, 剪碎后

10、, 在冰浴中勻漿。組織勻漿以600g的速度在4下離心10分鐘后, 棄沉淀,上清再以35 000g離心20分鐘, 所得沉淀懸于適量的緩沖液中, 調(diào)整蛋白含量至12 g/L，立即供實(shí)驗(yàn)用。4.蛋白定量：采用考馬斯亮藍(lán)法測定膜標(biāo)本中蛋白含量4 。5.結(jié)合試驗(yàn)：膜制劑100 l, 加入最終濃度為301 000 pmol/L的3H-QNB（比放射性1.8109 Bq/mol，放化純度97，Dupont公司生產(chǎn)）, 并加緩沖液使總?cè)萘繛?00 l, 在27水浴中孵育60分鐘后, 加入5 ml冰冷的生理鹽水終止反應(yīng), 迅速通過玻璃纖維濾膜行負(fù)壓抽濾, 濾膜用5 ml冰冷的生理鹽水沖洗2次后, 涼干, 液閃儀

11、測量放射性, 非特異性結(jié)合系向反應(yīng)體系中加入最終濃度為1 mol/L的阿托品溶液而得。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由總結(jié)合減去非特異性結(jié)合, 所得特異結(jié)合數(shù)據(jù)依Scatchard公式計(jì)算, 求出最大結(jié)合容量(Bmax)及平衡解離常數(shù)(kd), 結(jié)果以s表示,顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn), 資料的整理及統(tǒng)計(jì)分析由SAS軟件處理。結(jié)果COPD大鼠氣道和肺組織細(xì)胞膜制劑與M受體的標(biāo)記配基3H-QNB在上述條件下所進(jìn)行的結(jié)合試驗(yàn)，隨著后者濃度的遞增而達(dá)到飽和，Scatchard作呈一直線（表1）。表1吸入溴化異丙托品對大鼠COPD模型氣道和肺組織M受體的影響(s)組別只數(shù)Bmax(pmol/mg蛋白)t值P值Kd(pmol/

12、L)t值P值治療5天組80.0350.009*3520*對照組70.0300.0061.0540.0529190.5140.05治療30天組90.0490.016*6137*對照組80.0340.0102.320.05停藥6天組80.0450.010*5026*?對照組70.0370.0101.4430.0553260.1560.05注：*治療組與其對應(yīng)對照組比較P0.05，*P0.05由表1可見，吸入溴化異丙托品5天, COPD大鼠氣道和肺組織M受體雖有升高趨勢, 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，吸入30天，COPD大鼠氣道和肺組織M受體密度顯著升高(P0.05)，停藥6天后，M受體的密度基本恢復(fù)正常。M受

13、體與拮抗劑的親和力Kd值各組差異均無顯著性。討論迷走神經(jīng)張力的增加與COPD患者氣道狹窄及粘液分泌過度有著密切的關(guān)系，膽堿能張力是COPD患者氣道最主要的可逆成分, 抗膽堿治療已成為治療COPD的首選措施1。有報(bào)道，COPD患者長期吸入溴化異丙托品可使氣流阻塞產(chǎn)生可逆性改變，并可降低一秒鐘用力呼氣容積(FEV1)下降的速率5，而另一些研究則認(rèn)為，溴化異丙托品只能暫時(shí)擴(kuò)張支氣管，并不能減緩FEV1的逐年下降率6，哮喘和慢性支氣管炎(慢支)患者長期吸入異丙托品可加速肺通氣功能的惡化7。此外，還有一些研究發(fā)現(xiàn)，長期吸入異丙托品的患者停藥后，氣道對擬膽堿藥發(fā)生超敏反應(yīng)，出現(xiàn)氣道反應(yīng)性的異常增高及肺功能

14、的短暫惡化8，9，這種停藥后的反跳現(xiàn)象，推測可能與用藥后氣道M受體的上調(diào)有關(guān)。大量的研究已證實(shí), 長期應(yīng)用阿托品可上調(diào)細(xì)胞膜表面的M受體, 導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng), 唾液腺, 氣道等多個(gè)組織對膽堿能剌激產(chǎn)生超敏反應(yīng)9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 大鼠慢支模型吸入異丙托品5天后, 氣道M受體有上調(diào)趨勢, 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 吸入30天, 氣道M受體的密度顯著增加, 停止治療6天后, M受體的密度基本恢復(fù)正常。氣道M受體的上調(diào)與長期應(yīng)用異丙托品患者停藥后所出現(xiàn)的氣道反應(yīng)性異常增高及肺功能的暫時(shí)惡化有關(guān)。氣道M受體的上調(diào), 從理論上講, 也可能導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。在Vaughan等10的一個(gè)有安慰劑對照的, 交叉設(shè)計(jì)的雙

15、盲試驗(yàn)中, 22例哮喘患者霧化吸入硝酸甲基阿托品(atropine methylnitrate)2周后產(chǎn)生顯著性的失敏, 由于硝酸甲基阿托品和溴化異丙托品均為阿托品的季胺類衍生物, 因此我們認(rèn)為, 長期應(yīng)用溴化異丙托品也會(huì)導(dǎo)致失敏。但是, 迄今為止, 極少有吸入溴化異丙托品引起耐藥的報(bào)道, 我們認(rèn)為可能的原因有(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本身的缺陷：如實(shí)驗(yàn)未設(shè)對照組, 實(shí)驗(yàn)對象在使用異丙托品的同時(shí), 還應(yīng)用其他的藥物如沙丁胺醇, 皮質(zhì)激素等, 從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。(2)選用的指標(biāo)不夠敏感：應(yīng)用異丙托品后, 肺功能改善最明顯的指標(biāo)是最大呼氣中段流量(MMEF)，而不是FEV1,但是在臨床試驗(yàn)時(shí), 幾乎都

16、用FEV1作為觀察指標(biāo), 有可能對結(jié)果的判斷造成一定的影響。(3)異丙托品的應(yīng)用劑量偏?。耗壳芭R床治療及試驗(yàn)觀察所用的異丙托品大多為每次40 g, 34次/天, 這一劑量實(shí)際上是比較小的, 其上調(diào)M受體的作用較弱, 不大可能充分誘導(dǎo)失敏的產(chǎn)生10。我們認(rèn)為, 雖然溴化異丙托品誘導(dǎo)M受體上調(diào)持續(xù)時(shí)間較短, 對于大多數(shù)患者可能并不產(chǎn)生明顯的影響, 但是對于嚴(yán)重氣道阻塞的患者應(yīng)遞減停藥, 以防病情加重。作者單位：100083 北京醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科參考文獻(xiàn)1Ikeda A, Nishimura K, Koyama H,et al. Bronchodilating effects of c

17、ombined therapy with clinical dosages of ipratropium bromide and salbutamol for stable COPD: Comparison with ipratropium bromide alone. Chest,1995，107:401-405.2衛(wèi)生部防治慢性支氣管炎辦公室.慢性支氣管炎實(shí)驗(yàn)方法匯編. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1973.260-262.3Chiba Y, Misawa M. Characteristic of muscarinic cholinoceptors in airways of antigen-i

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19、nic obstructive pulmonary disease, a combination of ipratropium bromide and albuterol is more effective than either agent alone. Chest,1994，105:1411-1419.6Anthonisen NR, Connett JE, Kiley JP, et al. Effects of smoking intervention and the use of an inhaled anticholinergic bronchodilation on the rate of decline of FEV1-The lung health study. JAMA,1994，272:1497.7Van Schayck CP, Dompeling E, Van Herwaarden CLA, et al. Bronchodilator treatment