五年的western blot經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1、1.抗體的選擇 對(duì)于國(guó)內(nèi)的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來(lái)講，做western blot實(shí)驗(yàn)選擇抗體是個(gè)頭疼的問(wèn)題。原因很簡(jiǎn)單，買(mǎi)進(jìn)口抗體捉襟見(jiàn)肘，買(mǎi)國(guó)產(chǎn)抗體得需要大無(wú)畏的勇氣，對(duì)于我所在的蘭州地區(qū)的實(shí)驗(yàn)者而言，感觸尤深。在這五年的western blot實(shí)驗(yàn)歷程里，我先后用過(guò)進(jìn)口抗體，進(jìn)口抗體國(guó)內(nèi)分裝包裝，國(guó)產(chǎn)抗體，質(zhì)量良莠不齊。 進(jìn)口抗體一般不會(huì)出現(xiàn)閃失：abcam品種全，質(zhì)量過(guò)硬，但價(jià)高（3400元/100微升），而且說(shuō)是100微升，但至多能吸出來(lái)90微升；Sigma的價(jià)最貴；比較有性價(jià)比的是CST的抗體，現(xiàn)在好像是2200元/100微升，我前后用過(guò)二十幾種， 1:1000的稀釋比下，還沒(méi)有失過(guò)手，100

2、微升通常能完成所有的免疫組化和western blot實(shí)驗(yàn)，還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通常量比100微升多出來(lái)10微升，唯一的不足是CST的品種實(shí)在不多。Santa的多克隆抗體質(zhì)量可以，但是選用Santa的單抗還是有風(fēng)險(xiǎn)，估計(jì)這也是業(yè)界共識(shí)了吧。 進(jìn)口抗體國(guó)內(nèi)分裝包裝我也用過(guò)不少，呵呵，畢竟是窮人（420元/100微升），大概好抗體的比例約為50%，如果能做出來(lái)，也存在一個(gè)問(wèn)題，就是抗體大多只能用一次。我曾經(jīng)把Santa的原裝抗體和分裝抗體做過(guò)比對(duì)（抗體品種，貨號(hào)等完全一致），在都能做出來(lái)的前提下，原裝抗體能重復(fù)使用的次數(shù)要多出許多。具體原因我已經(jīng)揣測(cè)了好幾年，不敢說(shuō)出來(lái)，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和

3、整個(gè)賣(mài)，也會(huì)有所不同。揣測(cè)歸揣測(cè)，假如只為了發(fā)論文畢業(yè)走人，可以考慮選用進(jìn)口分裝的多克隆抗體。 國(guó)產(chǎn)抗體比較知名的就幾家，但質(zhì)量確實(shí)不敢恭維。western blot能做出來(lái)的確實(shí)不多，而且雜帶多，背景不干凈。我們周邊的實(shí)驗(yàn)室大多買(mǎi)國(guó)產(chǎn)抗體做免疫組化，怎么說(shuō)呢，應(yīng)付碩士論文夠了。 我也幫別人自制過(guò)抗體，再用抗原親和純化。效價(jià)非常不錯(cuò)，夸張的時(shí)候1：10000都能做出條帶，唯一的麻煩是兔子太騷（騷臭），不知道這是不是“兔女郎”名號(hào)的來(lái)由。如果讀書(shū)非常悠閑，老板又特別想擁有手工作坊的情況下，可以自己伺候折騰兔子來(lái)玩玩，剛開(kāi)始的時(shí)候還是蠻有成就感的。只是單憑抗原表達(dá)和制備多抗，是不是可以寫(xiě)成論文畢業(yè)

4、，估計(jì)因校而異了。 2.Western Blot設(shè)備 目前最好的垂直槽和轉(zhuǎn)移槽還是Biorad（伯樂(lè)），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四塊膠，但通常用不上，由此造成垂直緩沖液的浪費(fèi)，而且MINI4用綠色塑料夾住玻璃板來(lái)組成內(nèi)槽，容易漏液，塑料夾應(yīng)該是有疲勞壽命的，估計(jì)日子一長(zhǎng)，彈性就會(huì)改變，所以如果你們實(shí)驗(yàn)室剛買(mǎi)了MINI4，趕緊用，遭殃的肯定是某一級(jí)的師弟師妹們。 Biorad的一套系統(tǒng)得兩萬(wàn)多，西部能玩得起伯樂(lè)的還真不多。好在咱中國(guó)人聰明，上海天能的外觀和構(gòu)造和伯樂(lè)的MINI3幾乎一模一樣，而且可以通用，不帶電泳儀是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料壽命不如伯樂(lè)，膠架容易斷

5、裂。不過(guò)仔細(xì)算算，三套天能也就是一套伯樂(lè)的價(jià)格，值了。北京六一的垂直槽很轉(zhuǎn)移槽很好用，但垂直槽配膠不方便，玻板太厚，散熱不好，但能用，六一的電泳儀（電源）還是很好用的。 3. Western Blot實(shí)驗(yàn)條件 Western Blot實(shí)驗(yàn)條件我基本是按ABCAM公司經(jīng)典教材做的，按以下的網(wǎng)址下載下來(lái)就可以了（ 的SM1811,2微升就很清晰了，蘭州的代理是上海生工。 要強(qiáng)調(diào)的是垂直電泳緩沖液千萬(wàn)不能回收用，具體愿因你只需上網(wǎng)查查SDS-PAGE的原理就知道了。轉(zhuǎn)移電泳緩沖液可以回收再用兩次。 轉(zhuǎn)膜我通常是快轉(zhuǎn)兩百200毫安/2小時(shí)，慢轉(zhuǎn)80毫安/12小時(shí)?？燹D(zhuǎn)是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰

6、水混合液里。 封閉我通常用BD的脫脂奶粉，不歸，260元500克，也是從北京華美買(mǎi)的。 ECL我用pierce的，500毫升1650元，比國(guó)產(chǎn)的還便宜好用。 膠片是柯達(dá)的，以前用過(guò)樂(lè)凱的，不如柯達(dá)。 我很少用麗春紅或考馬斯染膜或染膠，總覺(jué)得是脫褲子放屁的事。 4. Western Blot實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵 Western Blot操作步驟多，每一步的失誤都會(huì)造成全盤(pán)失敗，綜合而言，抗體仍然是決定成敗的關(guān)鍵，如果抗體很濫，就是神仙也沒(méi)招。其中內(nèi)參抗體很重要，因?yàn)閮?nèi)參抗體的選擇關(guān)系到全盤(pán)實(shí)驗(yàn)的考評(píng)。Actin，Tubulin，GAPDH我都用過(guò)，Actin，Tubulin的缺點(diǎn)是有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)復(fù)帶，比較穩(wěn)定

7、的還是GAPDH。如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做內(nèi)參。進(jìn)口的，國(guó)內(nèi)分裝的，國(guó)產(chǎn)的，我都用過(guò)。進(jìn)口的最強(qiáng)的1:10000都能做出條帶（Upstate，現(xiàn)在被Minipore招安了），國(guó)內(nèi)分裝的也好用，但就是不好回收重復(fù)使用，國(guó)產(chǎn)的一般只能用一次。我要特別強(qiáng)調(diào)的是，實(shí)驗(yàn)室里最貴的抗體實(shí)際上是內(nèi)參抗體，因?yàn)橹灰猈estern Blot開(kāi)工，每次都得用內(nèi)參抗體，而一般目的蛋白的抗體也就用幾次，重復(fù)三次就了事。但內(nèi)參抗體是不折不扣的耗材，嚴(yán)格意義上將，每跑一次膠，就得雜一次內(nèi)參，使用頻率最高決定了內(nèi)參是最花錢(qián)的抗體。我也自己制備過(guò)內(nèi)參抗體，但好像因?yàn)榉N屬同

8、源性太高，背景總是不干凈。進(jìn)口的好，太貴；國(guó)產(chǎn)的只能使用一次，年終算賬，不比進(jìn)口的便宜。我自己的體會(huì)是多抗制備并不是技術(shù)含量極高的事，為什么國(guó)內(nèi)企業(yè)高的早不了，低的造不好呢？現(xiàn)在我用的是杭州賢至的GAPDH兔多抗，200微升420元錢(qián)，我在蛋白上樣量12微升/孔的情況下，按1:2000稀釋比，條帶非常清晰，沒(méi)有雜帶，是我目前用過(guò)的最好的國(guó)產(chǎn)抗體，我估計(jì)按1:4000照樣能做出來(lái)，因?yàn)榘窗?:2000稀釋做，在暗室里點(diǎn)上ECL后肉眼清楚地看到熒光條帶?？贵w我在不加疊氮化鈉的情況下4度過(guò)夜雜交，可回收重復(fù)使用5到6次。最早我是2008年在丁香通上看到了杭州賢至（當(dāng)時(shí)名叫杭州松華）發(fā)布的廣告，我就慫

9、恿實(shí)驗(yàn)室主管買(mǎi)了2支，很好用，現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室都沒(méi)有用完 ；2009年我的一個(gè)朋友做western，我推薦他又買(mǎi)了1支，做出來(lái)的效果確實(shí)好，2009年底我到了新的實(shí)驗(yàn)室，western的全套我在新實(shí)驗(yàn)室重新建立，啥都采購(gòu)齊了，可就是買(mǎi)不到杭州松華的內(nèi)參抗體，我上網(wǎng)再也找不到這個(gè)公司的網(wǎng)頁(yè)了，沒(méi)辦法，只好一直噌朋友的內(nèi)參抗體用。我有個(gè)陋習(xí)，就是實(shí)驗(yàn)中用順了用穩(wěn)定了試劑輕易不愿意更換品牌。還好，今年7月份我終于找到了當(dāng)年的通訊記錄，一聯(lián)系才知道他們改名叫杭州賢至生物科技有限公司了，呵呵，改了個(gè)名，害我找了大半年。第三次買(mǎi)到的GAPDH內(nèi)參抗體，還是好用，1:2000，條帶清晰，回收重復(fù)用，照樣work，

10、截止目前，我的新導(dǎo)師對(duì)我采購(gòu)的一堆試劑還沒(méi)有不滿意的，嘿嘿！草根出生，我也照樣有我窮人的勞斯萊斯。 5.關(guān)于奶粉，膜的選擇和顯影定影 奶粉看似簡(jiǎn)單，其實(shí)很重要，如果要湊合，可以到超市買(mǎi)光明的脫脂奶粉。奶粉質(zhì)量不好，會(huì)最終導(dǎo)致顯影要么漆黑一片，要么啥都沒(méi)。fluka的很好，可惜因?yàn)榀偱２〉脑?，現(xiàn)在海關(guān)禁止進(jìn)口美國(guó)牛制品。我現(xiàn)在用的bd的，很好很穩(wěn)定，如果回收使用，500可以用很長(zhǎng)時(shí)間。細(xì)菌達(dá)到一定極限后，會(huì)導(dǎo)致tbst里的奶粉變質(zhì)，表現(xiàn)為發(fā)綠發(fā)臭，一種肉眼可察覺(jué)的淡淡的綠，一種鼻子湊過(guò)去能嗅出的臭，這時(shí)候就得扔了。 nc膜，pvdf膜我都用過(guò)，現(xiàn)在我已經(jīng)固定下來(lái)用密理博的0.45微米的pvdf

11、膜。pvdf膜的好處是蛋白載量大，韌性好。唯一的麻煩是事先得用甲醇泡幾分鐘，目的好像是為了增強(qiáng)膜的正電荷。甲醇泡完后，得在轉(zhuǎn)移緩沖液里泡一兩分鐘。國(guó)內(nèi)用nc膜的人多一些，主要是因?yàn)閚c膜有分裝的小片，忽悠老板買(mǎi)一張膜就100元錢(qián)，老板肯定樂(lè)意，若是說(shuō)膜得花上千元，老板就有可能長(zhǎng)時(shí)間的思考，然后過(guò)些日子再答復(fù)你。所以大多數(shù)人會(huì)采取前一種方式，當(dāng)然得告訴老板好幾次，膜就100元錢(qián)。我第一次用到pvdf膜是和好幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室合資買(mǎi)了一卷，我出了475元，類似于打的拼車的方式?，F(xiàn)在pvdf膜國(guó)內(nèi)大概是1600元到1700元一卷，33厘米*375厘米，夠好幾個(gè)人用好長(zhǎng)時(shí)間了，膜假貨不多，至少我沒(méi)有見(jiàn)過(guò)。我們

12、幾個(gè)拼車的窮弟兄拿著尺子分贓的時(shí)候才發(fā)現(xiàn)本地供貨商給我們送的貨少了80厘米，嘿嘿，窮鬼攆著殺叫鬼，我們花錢(qián)容易嗎！所以交涉，再交涉，直到他把我們的血汗膜返還才罷休?，F(xiàn)在我基本是從北京的欣津科和華美買(mǎi)，大概1700元一卷，完完整整。 0.45微米的pvdf膜我用5%的脫脂奶粉（溶于tbst中）室溫封閉1小時(shí)，0.22微米的用8%的脫脂奶粉。bsa我很少用，主要是bsa會(huì)出現(xiàn)封閉不均勻的情況。我也很少用0.22微米的膜，原因是背景不干凈，再者無(wú)論是封閉時(shí)間還是洗膜時(shí)間都得延長(zhǎng)。標(biāo)準(zhǔn)教程上推薦20kd以下的分子用0.22微米的膜，我雜過(guò)最小的分子是cleaved-caspase3,12ka，按我在一

13、樓的轉(zhuǎn)膜條件，在0.45微米的膜上清清楚楚。我在上海的師弟他們轉(zhuǎn)7ka的分子也用0.45微米的，沒(méi)出過(guò)事。廢話一句，我?guī)煹艿膶?shí)驗(yàn)室可是國(guó)家重點(diǎn)，那個(gè)富呀，讓我閉上眼想想吧，那可是屎殼郎掉到了化糞池的感覺(jué)。 一抗我一般4度搖床過(guò)夜，洗膜3此，每次5分鐘。要注意的是，如果一抗里添加了疊氮化鈉，務(wù)必洗膜5次，每次10分鐘，因?yàn)榀B氮化鈉會(huì)滅活二抗偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶（hrp）活性。二抗我用的是中杉金橋分裝的，120元一支，通常1:5000，室溫1小時(shí)，然后洗膜三次，每次5分鐘。 奶粉，一抗，二抗，我都回收，從開(kāi)始到現(xiàn)在，一直如此。因?yàn)槲也桓彝涀约嘿\的出身。我的一抗是國(guó)外的一位老師送給實(shí)驗(yàn)室的，剛開(kāi)始

14、的半年我啥都做不出來(lái)，以至于導(dǎo)師在平安夜領(lǐng)我到教堂祈禱。上海的師弟知道后，每次裁膜的時(shí)候給我一小片一小片日積月累了一些，二抗只拿到了10微升，我怕實(shí)驗(yàn)室的人發(fā)現(xiàn)，一直是熬夜做western?？勺罱K還是因?yàn)槲易约鹤觳焕慰?，?dǎo)致東窗事發(fā)，師弟險(xiǎn)些被開(kāi)除，事情敗露的那天，師弟在長(zhǎng)途電話的那邊哭，我在這邊哭，寫(xiě)著寫(xiě)著，我的眼淚又一次的盈眶而出，說(shuō)不出的辛酸與悲涼，師弟說(shuō)他承擔(dān)一切責(zé)任，讓我裝作不知道，那天晚上，我給他的導(dǎo)師寫(xiě)了一封長(zhǎng)信，只求能保住師弟。老天保佑，他導(dǎo)師讓師弟寫(xiě)檢查認(rèn)錯(cuò)。那以后，我再也沒(méi)有讓師弟為我偷過(guò)東西，我不能再為自己的理想讓朋友付出代價(jià)。雖然現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室的老板比較大方，我依然堅(jiān)持著回

15、收試劑的習(xí)慣，我始終不能忘記自己western blot的開(kāi)始。 一般8.3*4.3厘米的膜，大概要400微升的ecl混合液。加ecl我一般就在燈光下，或者白天把窗簾拉上。加好ecl，覆上保鮮膜后，我才端著暗盒進(jìn)暗室，暗室里我的暗室紅燈始終開(kāi)著，沒(méi)有那么可怕。在暗室里，我一般是剪4張同樣尺寸的膠片，疊在一起，壓在膜上方，暗盒一扣，就干別的事情去了。5個(gè)小時(shí)或過(guò)夜，我再把膠片顯影，顯影我起初很注意技巧，但現(xiàn)在基本上是在顯影液里放10分鐘，撈出來(lái)放到水盤(pán)里涮一涮，然后在定影液里放十分鐘。我一般總能找到一張理想的膠片，因?yàn)槟z片疊加到一起后，層層屏蔽，從而逐漸遞減熒光強(qiáng)度，我試過(guò)多次，即便是熒光強(qiáng)度最

16、強(qiáng)的內(nèi)參，也至多能達(dá)到最上面的第四層膠片。所以顯定影后，肯定有曝光過(guò)度的膠片，但也肯定有趨勢(shì)，背景，強(qiáng)度恰到好處的一張，嘿嘿，傻瓜做法。 傻瓜做法看似呆笨，實(shí)則不然。我在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里，都是讀秒，或三分鐘，或15分鐘，或半小時(shí)，或1小時(shí)取出膠片顯影，眼睛緊緊盯著，一看到條帶就撈出來(lái)定影。如果不理想，再壓膠片，再等，再取再投再撈，活脫脫是個(gè)“猴埋兒”。西北人傳說(shuō)小猴夭折了，母猴把小猴埋到土里面，一會(huì)又挖出來(lái)，再埋進(jìn)去，又挖出來(lái).反復(fù)無(wú)止。顯定影時(shí)如果采取猴埋兒式的技巧，是最費(fèi)膠片，最費(fèi)時(shí)間，最費(fèi)心力的做法。所以我是傻瓜就用傻瓜的辦法。 我用過(guò)好幾個(gè)品牌的國(guó)產(chǎn)ecl，和進(jìn)口的ecl也做過(guò)對(duì)照。國(guó)

17、產(chǎn)的一半是a液b液總共50毫升180元錢(qián)，單價(jià)3.6元/毫升，一般肉眼可見(jiàn)的熒光強(qiáng)度可持續(xù)1個(gè)小時(shí)，pierce和milipore的可以持續(xù)3小時(shí)。milipore的麻煩之處在于由a液b液c液三組成分組成，費(fèi)槍頭，費(fèi)腦子?，F(xiàn)在我固定使用pierce的super ecl，1650元500毫升，折算下來(lái)是3.3元/毫升。上海吉泰是代理。好像分子克隆上寫(xiě)出了ecl的配方，技術(shù)含量并不高， 膠片我用過(guò)醫(yī)院放射科的，樂(lè)凱的，柯達(dá)的，柯達(dá)現(xiàn)在小膠片（小暗盒尺寸）好像是130元/50張，樂(lè)凱的是其價(jià)格的一半。樂(lè)凱的缺點(diǎn)在于膠片容易出現(xiàn)劃痕，有莫名奇妙的背景，雖然瑕不掩瑜，但還是讓人不爽，再就是感光不如柯達(dá)的

18、靈敏。這些我都比對(duì)過(guò)。如果細(xì)心地把二者膠片厚度比比，也可看出差距。我就此請(qǐng)教過(guò)甘肅的樂(lè)凱總代理，他說(shuō)根源出在牛身上。 顯影液定影液我一直用樂(lè)凱的，便宜，量又足，誰(shuí)用誰(shuí)說(shuō)好。進(jìn)口的從未染指，連想都沒(méi)想過(guò)，呵呵，我內(nèi)心里還是極其渴望支持國(guó)貨的，愛(ài)之深，恨之切??！ 6.總結(jié) 從2005年第一次見(jiàn)到抗體到現(xiàn)在，我已經(jīng)做western blot實(shí)驗(yàn)整整五年了。五年里，太多的磨難，太多的驚喜，太多的感觸，太多的代價(jià)?，F(xiàn)在我做博士后，我指導(dǎo)的學(xué)生也能一次就上手，雖然他們也會(huì)出錯(cuò)，但我很少責(zé)備他們，因?yàn)槲抑雷约旱穆吠疽膊⒉豁樌?，如果過(guò)度的責(zé)難他們，會(huì)讓他們失去信心，而且更嚴(yán)重的是會(huì)導(dǎo)致他們遮遮掩掩，我從來(lái)不

19、怕實(shí)驗(yàn)做不出來(lái)結(jié)果，就怕查不出失敗的原因。 我喜歡western blot技術(shù)，甚至偏愛(ài)或癡迷。最夸張的時(shí)候是一天連跑帶轉(zhuǎn)了八張膜，實(shí)驗(yàn)最不順利的那兩個(gè)月我天天就睡在實(shí)驗(yàn)室里，有時(shí)候三天三夜不睡覺(jué)。我不知道自己借了多少錢(qián)從丁香園的二手資源版淘過(guò)別人用剩的抗體，至今我穿的最貴的褲子也就80元錢(qián)，但花1000元買(mǎi)抗體我從來(lái)沒(méi)有覺(jué)得破費(fèi)。好在我的家人和朋友們理解我，支持我，讓我能逐步實(shí)現(xiàn)自己的愿望。五年里，從器具，試劑，儀器，甚至如何用濾紙，我都形成了自己獨(dú)有的體系和訣竅，我的一切東東都有品牌，這些品牌組合起來(lái)就是窮人的勞斯萊斯。 回想過(guò)去，內(nèi)心仍然會(huì)浸沒(méi)到悲涼與辛酸中。最難受的時(shí)候是做p21抗體，

20、整整半年，從丁香園淘了五個(gè)品牌的抗體，都做不出來(lái)。最后逼著導(dǎo)師買(mǎi)cst的抗體，還是不出，那時(shí)候正好是2008年雪災(zāi)，抗體在公路上走了半個(gè)月，我收到抗體是大年初二，興奮地上樣，轉(zhuǎn)膜，還是沒(méi)有，當(dāng)時(shí)我感覺(jué)自己就好像浸沒(méi)在冰窖里。宿舍里暖氣不好，第二天我起床時(shí)，房子里的洗臉?biāo)家呀Y(jié)冰，和我的心緒一模一樣。好在上海吉泰是一級(jí)代理，讓我投訴，cst美國(guó)總部發(fā)回來(lái)他們的蛋白陽(yáng)性對(duì)照品，再試，p21出來(lái)了，技術(shù)支持是個(gè)印度人，一眼就看出來(lái)我沒(méi)有用超聲波裂解。我們實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有這個(gè)東東，我怎么就想不到問(wèn)題就出在這呢！從投訴到解決問(wèn)題又是兩個(gè)月。因?yàn)閣estern，造成我博士延期一年半，害得師弟差點(diǎn)被開(kāi)除，這也是我主動(dòng)和導(dǎo)師關(guān)系疏遠(yuǎn)的開(kāi)始。 但我還是癡迷western，在我心里，western blot技術(shù)本身就是窮人的勞斯萊斯。跑一次膠，我一次可以在兩張膜上裁切出