乳核速消膠囊對大鼠乳腺增生病治療作用的實驗研究

1、乳核速消膠囊對大鼠乳腺增生病治療作用的實驗研究         【摘要】  目的觀察乳核速消膠囊對實驗性大鼠乳腺增生病的 治療 作用 ,探討其療效和作用機理。 方法 用肌注外源性苯甲酸雌二醇及黃體酮的方法復(fù)制大鼠乳腺增生模型 ,觀察各組大鼠乳腺變化 , 用放射免疫法檢測血清生殖激素三項（E2，P，PRL）,免疫組化方法觀察乳腺組織中雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的變化。結(jié)果乳核速消膠囊治療組大鼠的乳腺增大和腺泡、導(dǎo)管增生均顯著輕于模型組;血漿雌二醇、乳腺組織中 ER 和 PR 含量顯著低于模型組;

2、血漿黃體酮含量則顯著高于對照組。結(jié)論乳核速消膠囊對大鼠乳腺增生具有抑制作用 ,其機理與調(diào)節(jié)實驗性大鼠性激素的血濃度及其受體的表達有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  乳腺組織增生 乳核速消膠囊Abstract:ObjectiveTo study the function mechanism of the traditional medicine - Ruhesuxiao Capsules on experimental mastoplasia rat.Methods The progesterone and estrogen were used to set up the rat mastoplas

3、ia model . Serum hormone (E2 P PRL) was measured，the change of rat mastoplasia pathology was observed by light microscope,the expression of ER，PR in breast tissue was observed by immunohistochemical technology.ResultsCompared with the model group, the effects of treatment groups were more obvious in

4、 improving the rats mastoplasia pathology structure,regulating the E2,P,PRL in serum,decreasing the expressions of ER ,PR in breast tissue.ConclusionRuhesuxiao Capsules can inhibit the astoplasia .It is possible that the function mechanism is related to regulating the level of hormone in serum and r

5、educing the expressing of ER,PR in breast tissue .Key words:Ruhesuxiao Capsule;  Hyperplasia of mammary glands   乳核速消膠囊是寧夏中醫(yī) 研究 院中醫(yī)婦科研制的純中藥制劑，由夏枯草、山慈姑、生牡蠣、生麥芽、海藻、鹿角霜等15味中藥組成，具有疏肝理氣、軟堅散結(jié)、活血化淤、調(diào)經(jīng)止痛之功效，上用于治療乳腺增生病效果良好。我們對其作用機制進行實驗研究。現(xiàn)報道如下。1  材料1.1  動物istar雌性未孕大鼠50只，體重180200 g，由寧

6、夏院動物中心提供。合格證號：寧醫(yī)動字第13-201號。1.2  藥物乳核速消膠囊由寧夏中醫(yī)研究院中藥制劑室提供；苯甲酸雌二醇（2 mg/支）和黃體酮（10 mg/支）均上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號分別為H31021114，H31021401；乳癖消，遼寧護士藥業(yè)（集團）有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號為Z21021823。1.3  試劑由武漢博士德生物制品有限公司提供的放射免疫試劑盒、免疫組化試劑盒。2  方法2.1  造模及給藥方法將istar大鼠50只，經(jīng)實驗室常規(guī)飼養(yǎng)觀察3 d后隨機分成5組，即空白對照組、模型對照組、乳癖消組、乳核速消膠囊高劑量組、乳

7、核速消膠囊低劑量組。每組10只。參照有關(guān) 文獻 1，除空白對照組外，其余各組每只按體重0.5 mg/kg給大鼠后肢后外側(cè)肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液(左右后肢交替肌肉注射，以免肌肉硬結(jié)， 影響 藥物效果)，1次/d，連續(xù)20 d。隨后按每只5 mg/kg肌注黃體酮，1次/d，連續(xù)5 d?？瞻讓φ战M動物每日在后外肢后外側(cè)注射生理鹽水0.1 ml/只，1次/d，連續(xù)注射25 d。造模成功后開始灌胃給藥。空白組、模型組給予生理鹽水2 ml/只；乳核速消膠囊高、低劑量組每只分別給予乳核速消膠囊0.56，0.28 g/kg；乳癖消組每只給予乳癖消0.43 g/kg；以上各組藥物分別用生理鹽水配成所需濃度，

8、灌胃量為2 ml/只，連續(xù)20 d。2.2  檢測項目2.2.1  末次給藥3 d后，摘眼球取血23 ml，用放射免疫法測定雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）。2.2.2  經(jīng)乳頭基底部最大切面取下該對完整的乳腺，用10%的甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，在光鏡下觀察計數(shù)每個小葉腺泡數(shù)，導(dǎo)管上皮增生數(shù)，求其平均值。2.2.3  通過免疫組化方法觀察ER，PR的表達情況，取乳腺組織于10%甲醛溶液固定，常規(guī)方法進行石蠟包埋。石蠟切片脫蠟脫水；3H2O2室溫孵育510 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 mi

9、n。5%10正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（大鼠ER或PR單克隆抗體，IgG）, 37孵育 12 h  或4過夜。PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標記的二抗（用1BSAPBS稀釋的兔抗大鼠IgG），37孵育1030 min；PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37孵育1030 min； PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。2.3  學(xué) 分析 生殖激素的量、導(dǎo)

10、管上皮層數(shù)、小葉腺泡數(shù)，PR，ER表達積分均采用均數(shù)±標準差表示。各組數(shù)據(jù)之間的比較采用方差分析。         3  結(jié)果3.1  各組大鼠血清中生殖激素的測定結(jié)果見表1。表1  各組大鼠血清中生殖激素的測定結(jié)果（略）   表1結(jié)果所示，模型對照組動物血液中的催乳素、雌二醇的含量均顯著高于正常對照組（P0.05或P0.01），孕酮則顯著低于正常對照組(P0.05或P0.01);經(jīng)乳核速消膠囊及對照藥物的 治療 后，大鼠血清催乳素、雌二醇與模型對照組比較

11、均有所降低（P0.05或P0.01）。3.2  乳腺導(dǎo)管上皮層數(shù)腺泡變化觀察經(jīng)藥物治療的各組，乳腺增生的程度均有不同情況的改善，與模型對照組比較有不同程度的的改善。各組乳腺導(dǎo)管上皮增生及小葉中腺胞數(shù)比較見表2。表2  各組大鼠乳腺導(dǎo)管上皮層數(shù)腺泡數(shù)比較（略）   表2提示，模型對照組與空白對照組相比導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)明顯增多，有顯著性差異(P0.01)。而乳核速消劑組經(jīng)對照藥治療后，導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)明顯減少，與模型對照組相比有顯著差異(P0.01)，且乳核速消高劑組優(yōu)于乳癖消組，有較顯著性差異(P0.01)。3.3  大鼠乳腺PR，ER的

12、表達ER，PR陽性判斷標準2為乳腺導(dǎo)管和小葉上皮細胞核和/或細胞漿著色時為陽性。陽性細胞率20%者為（-），陽性細胞率不足20%,但局部區(qū)域有少量較強著色的陽性細胞者為(±)，陽性細胞率20%者且陽性細胞數(shù)由少至多,著色由淺至深為+,+,+,+, 并分別計1，2，3，4，5，6分，積分愈高表明ER，PR含量愈高。各組ER，PR的積分見表3。表3  各組大鼠 PR 積分比較（略）   表3提示，模型對照組與正常對照組比較ER，PR積分有顯著意義，乳核速消高、低劑量組與模型對照組相比也分別有顯著和極顯著的差異；乳核速消高劑量組與乳癖消組相比也有顯著性差異(P

13、0.05)，而乳核速消低劑量組與該組相比無顯著性差異。4  討論4.1  動物實驗?zāi)Ｐ偷倪x擇從實驗結(jié)果看，模型對照組的大鼠乳頭明顯高于正常對照組，有顯著性差異(P0.01)；經(jīng)病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，模型對照組的乳腺導(dǎo)管上皮層數(shù)、小葉腺泡數(shù)均高于正常對照組，有顯著性差異（P0.01），而且乳腺增生呈多種類型，如導(dǎo)管增生、腺泡增生和囊性增生等，都表明成功復(fù)制了大鼠乳腺增生模型。該結(jié)果與 文獻 報道的一致3，說明該種模型的可比性強，模型的制作 方法 是成功的。4.2  乳核速消膠囊治療乳腺增生病的機制綜合本課題的其它動物實驗資料，乳核速消膠囊主要是通過以下幾個方面達到治療作

14、用的4.2.1  調(diào)節(jié)血清性激素的水平乳腺增生病的發(fā)生由于內(nèi)分泌失調(diào)的觀點已為大多數(shù)學(xué)者公認。一般認為主要為E2(雌二醇)絕對或相對增高，P(孕酮)分泌相對或絕對不足，失去制約E2與保護乳腺組織的作用，E2/P比例失調(diào)，同時PRL(催乳素)的升高亦直接刺激乳腺組織，并進一步刺激E2的合成和抑制P的分泌，使乳腺組織不斷處于E2的刺激之中，而引起乳腺組織增生。本實驗中結(jié)果表明，經(jīng)過乳核速消膠囊治療，動物血液中垂體促乳素和雌二醇與模型對照組比較均有所降低（P0.01或P0.05），從而使E2/P的比例接近生理狀態(tài)。4.2.2  降低乳腺組織PR的含量一般認為PR激素受體是雌激素對

15、靶細胞發(fā)揮生理效應(yīng)的媒介，當(dāng)孕酮含量升高時經(jīng)PR的介導(dǎo)，通過完整的PR系統(tǒng)，使PR合成進一步增加，對PR的依賴性、敏感性同步增加，引起乳腺上皮細胞的增生和細胞功能活躍，從而引起乳腺組織增生。本實驗中海珠消癖丸高劑量組PR的積分明顯低于模型組（P0.01），因而可以推測乳核速消膠囊是通過降低大鼠乳腺組織PR含量，使乳腺組織局部對P的敏感性下降，從而減弱雌激素在靶細胞上的生物學(xué)效應(yīng)，產(chǎn)生抑制和治療乳腺增生作用。4.3  存在 問題 與展望通過動物實驗 研究 表明，中醫(yī)藥在治療乳腺增生病方面確有重要作用，且效果顯著。既能從組織病理上修復(fù)增生的乳腺，也可以通過調(diào)整機體內(nèi)源性激素水平、激素受體免疫功能、改善血液流變等直接或間接作用靶器官-*，達到治療的作用。今后應(yīng)充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，努力研制出符合中醫(yī)證候的模型，完善模型動物的