核苷酸論文端粒酶反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實驗

1、核苷酸論文|端粒酶反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實驗作者：鄧志華 楊長青 劉燕 劉金龍 楊強 趙婕 韓子巖 曹燕 作者單位：030002 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化科 【摘要】 目的 研究端粒酶反義寡核苷酸對肝癌細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用及其機制。方法 以人肝癌細(xì)胞株SMMC²7721、正常肝細(xì)胞株L²02為研究對象，采用TRAP²ELISA法對腫瘤細(xì)胞端粒酶活性進行定性定量分析；細(xì)胞形態(tài)學(xué)、TUNEL染色、DNA 瓊脂糖凝膠電泳觀察端粒酶反義寡核苷酸對肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進行時相分析，Western雜交對細(xì)胞周期蛋白進行研究。結(jié)果 一定濃

2、度的端粒酶反義寡核苷酸可抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，肝癌細(xì)胞端粒酶活性被抑制后傳代2326次出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期蛋白有關(guān)。結(jié)論 端粒酶反義寡核苷酸可抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性并誘導(dǎo)其凋亡?！娟P(guān)鍵詞】 端粒酶 肝癌 反義寡核苷酸 細(xì)胞凋亡 0 引言我國為肝癌高發(fā)國家，據(jù)統(tǒng)計肝癌位居男性腫瘤患者死亡原因的第二位1。肝癌的發(fā)生發(fā)展與端粒酶激活密切相關(guān)。端粒酶由三部分組成，即端粒酶RNA、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和端粒酶相關(guān)蛋白。端粒酶在行使其功能合成染色體末端端粒序列時必須以自身的RNA為模板2。端粒酶RNA由450 個核苷酸組成，其中11個核苷酸為端粒合成的模板序列。我們設(shè)想，封閉端粒酶RNA的模板序列

3、，干擾端粒酶向染色體末端添加端粒序列的過程, 使癌細(xì)胞端粒長度的穩(wěn)定機制破壞，就可使永生化細(xì)胞的癌細(xì)胞無限增殖受限，從根本上抑制腫瘤細(xì)胞生長。本實驗?zāi)康脑谟谟^察靶向端粒酶模板區(qū)的硫代反義寡核苷酸對肝癌細(xì)胞端粒酶活性及腫瘤細(xì)胞生長的影響，為肝癌治療探索一條新的、有效的途徑。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞株SMMC²7721，正常肝細(xì)胞株L²02，購自中科院上海細(xì)胞生物技術(shù)研究所。1.1.2 TRAP反應(yīng)試劑、TUNEL檢測試劑、Western單抗為寶靈曼公司產(chǎn)品。1.1.3 聚丙烯酰胺銀染試劑 硝酸銀(AgNO3)，無水碳酸鈉(Na2CO3)，購自華美

4、生物公司。1.1.4 儀器 Beckman CS²15R低溫離心機，Perkin²Elmer gene PCR儀，MK²2酶標(biāo)儀。1.2 方法1.2.1 端粒酶反義DNA的設(shè)計 選擇近端粒酶 RNA 模板區(qū)的20個核苷酸為反義靶位，設(shè)計合成端粒酶反義 DNA 序列、正義序列、隨機序列，見表1。硫代反義DNA由中科院上海細(xì)胞所合成與純化，純度達(dá)98%以上。表1 端粒酶模板區(qū)反義、正義及隨機序列（略）Tab 1 The sequence of sense, anti²sense and control²scrabled1.2.2 TRAP²

5、;PCR²ELISA檢測腫瘤細(xì)胞端粒酶活性3。1.2.3 合成DNA對肝癌細(xì)胞端粒酶活性的影響 1×106 SMMC²7721培養(yǎng)于Nunclon 24 孔板，培養(yǎng)液1ml含10% 熱滅活小牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)條件為37、5% CO2 。正義、隨機、反義DNA終濃度為10μmol/L，以PBS為對照，作用時間分別為12、24、36、48、60h，培養(yǎng)結(jié)束后胰酶消化，PBS洗2次，TRAP²ELISA法定量測定端粒酶活性，每一DNA設(shè)3復(fù)孔。進一步觀察倍比稀釋后的端粒酶反義DNA（濃度為10、5、2.5、1.

6、25μmol/L）作用不同時間對細(xì)胞端粒酶活性的影響。1.2.4 凋亡研究(1)TUNEL染色觀察細(xì)胞染色及細(xì)胞調(diào)亡 4×105/ml培養(yǎng)細(xì)胞種植于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，不同寡核苷酸作用14天后PBS洗滌2次進行細(xì)胞爬片，按TUNEL試劑盒說明對細(xì)胞進行固定、通透、標(biāo)記反應(yīng)，蘇木素染色，封片，拍照。(2)流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析 1×104細(xì)胞經(jīng)5μmol/L反義DNA作用14天的細(xì)胞進行細(xì)胞周期時相分析。(3)DNA抽提及電泳 將1×106經(jīng)反義DNA作用14天的細(xì)胞移入1.5ml離心管，加裂解液及蛋白酶²k，55水浴20min，加RNA酶

7、 10μl 作用2min，酚、氯仿²異戊醇各抽提1次，加3M乙酸鈉、無水乙醇沉淀DNA，3000g離心10min，氣干，TE溶解沉淀。 取抽提好的DNA 5μl，在1.8%瓊脂糖凝膠、5V/cm電壓下，電泳3h，以Hind² 酶切的λDNA為分子標(biāo)志，302nm紫外光透照并照相。1.2.5 Western分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 收集經(jīng)反義DNA作用14天的SMMC²7721肝癌細(xì)胞（以未作任何處理的SMMC²7721陰性對照），裂解液裂解，蛋白產(chǎn)物進行SDS²PAGE電泳（15%濃縮膠，5%分離膠），電泳產(chǎn)物半干電轉(zhuǎn)移至

8、NC膜上（轉(zhuǎn)移時間p21為45min，CyclinD1、Cdk2為1h），50g/L脫脂奶粉室溫封閉4h，TBS漂洗3次，分別加入抗小鼠CyclinD1，抗兔Cdk2、p21單克隆抗體及作為內(nèi)參照的β²actin單克隆抗體，4過夜反應(yīng)，TBS漂洗3次，再加入相應(yīng)二抗，室溫反應(yīng)4h，TBS漂洗3次后，DAB顯色。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 合成反義、正義、隨機序列DNA作用不同時間對肝癌細(xì)胞株SMMC²7721端粒酶活性的影響10μmol/L合成端粒酶反義DNA對肝癌細(xì)胞端粒酶活性具有顯著抑制作用，這種抑制作用開始

9、于12h，60h端粒酶活性被完全抑制，而正義鏈及隨機鏈對細(xì)胞端粒酶活性無顯著影響，見表2、圖1。表2 合成DNA對SMMC²7721細(xì)胞端粒酶活性的影響（1×10 6/ml） （略）Tab 2 The effection of Synthesised DNA ontelomerase activity（1×10 6/ml）*：The difference is significant compared to the control，P0.01a:Control scrambled;b:Sense;c: Anti²sense圖1 端粒酶反義寡核苷酸對端

10、粒酶活性的抑制作用（略）Fig 1 The inhibitory effect of anti²sensetelomerase oligonucleotide for telomerase activity2.2 反義寡核苷酸對肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用2.2.1 TUNEL標(biāo)記 在倒置顯微鏡下我們觀察反義寡核苷酸作用14天的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)60%的癌細(xì)胞被染成棕色，并有凋亡小體的產(chǎn)生，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于正義序列，見圖2。a: Anti²sense light microscope(×800)；b: Sense light microscope(×400)圖2

11、 端粒酶反義及正義寡核苷酸作用14天TUNEL染色（略）Fig 2 TUNEL staining for SMMC²7721 after anti²sense andsense telomerase oligonucleotide affected for 14 days2.2.2 DNA電泳 反義寡核苷酸作用14天，光鏡下癌細(xì)胞呈凋亡改變，DNA抽提電泳出現(xiàn)凋亡條帶，見圖3。a:Genomic;b,c:Anti²sense;d:Sense圖3 端粒酶反義寡核苷酸作用14天細(xì)胞DNA電泳圖（略）Fig 3 The DNA electrophoresis after

12、 anti²sense telomeraseoligonucleotide affected for 14 days2.2.3 端粒酶活性與細(xì)胞周期的關(guān)系 合成DNA與1×104/ml細(xì)胞共育2周，反義DNA在端粒酶活性被抑制后,S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降,而G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增高，細(xì)胞聚集于G2/M期，見表3。表3 端粒酶DNA對細(xì)胞周期的影響（n=3）（略）Tab 3 The effection of telomerase DNA on the cell cycle（n=3）*：The difference is significant compared to the co

13、ntrol，P0.012.3 細(xì)胞周期調(diào)控因子檢測結(jié)果反義寡核苷酸作用的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)14天后收集裂解細(xì)胞總蛋白，以β²actin作內(nèi)對照，Western blot技術(shù)檢測CyclinD1(細(xì)胞周期素)、Cdk2(細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶)和p21（細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子）的表達(dá)，結(jié)果顯示在β²actin等量的情況下，與正義序列比較反義寡核苷酸作用的肝癌細(xì)胞CyclinD1、Cdk2的表達(dá)下降而p21蛋白的表達(dá)顯著增加，見圖4。圖4 端粒酶反義DNA作用后SMMC²7721細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)（略）Fig 4 The expression

14、 of cell Cyclin aftertelomerase²antisense DNA affected3 討論我國為病毒性肝炎高發(fā)國家，病毒性肝炎相關(guān)肝硬化、肝癌的發(fā)生率居高不下。病毒感染可造成肝細(xì)胞變性壞死、假小葉形成。肝細(xì)胞在不斷壞死及增殖過程中與病毒核酸整合而造成肝細(xì)胞端粒酶激活、無限增殖、永生化而惡變。因此，端粒酶激活在肝細(xì)胞癌變及其惡性增殖中起決定性作用4。端粒酶是核糖核蛋白復(fù)合體，主要功能是向分裂細(xì)胞染色體末端添加端粒重復(fù)序列以保證腫瘤細(xì)胞的無限增殖。腫瘤細(xì)胞因端粒酶激活而惡性增殖，因此，用反義核酸來抑制或消除腫瘤細(xì)胞端粒酶活性成為近年腫瘤治療研究的熱點，核酸類藥物

15、抗腫瘤具有廣泛臨床應(yīng)用前景5。研究指出：在寡脫氧核苷酸上通過共價連接引入一定的活性基團，可使該寡核苷酸耦合物除具有一般寡核苷酸特性外，其耐核酸酶能力、與靶核酸分子結(jié)合的強度及細(xì)胞對寡核苷酸攝取等均顯著增強6， 修飾的寡核苷酸被認(rèn)為是選擇性抑制基因表達(dá)的新工具和抗腫瘤治療最有前途的新藥。我們對靶向端粒酶模板區(qū)的反義DNA的研究發(fā)現(xiàn)：反義DNA能識別并與端粒酶模板RNA結(jié)合而抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，端粒酶活性的下降具有濃度依賴性，10μmol/L的反義DNA作用12h即開始產(chǎn)生抑制作用，繼續(xù)作用60h端粒酶活性幾乎完全被抑制，實驗中反義DNA作用的時間延擱為12h，可能與其進入細(xì)胞的過程有關(guān)

16、7。隨著肝癌細(xì)胞端粒酶活性的被抑制，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長阻滯，因此，端粒酶反義DNA抑制腫瘤細(xì)胞增殖是通過抑制其端粒酶活性實現(xiàn)的。肝癌細(xì)胞端粒酶活性的抑制，意味著癌細(xì)胞失去了賴以永生化的物質(zhì)基礎(chǔ)而轉(zhuǎn)為“非永生化”。凋亡研究結(jié)果顯示:端粒酶失活的癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞活力顯著下降并出現(xiàn)調(diào)亡。端粒酶反義DNA與肝癌細(xì)胞共育14天后，TUNEL染色60%的癌細(xì)胞被染成棕色，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)核深染、染色質(zhì)邊集、核碎裂及凋亡小體形成；細(xì)胞DNA電泳呈凋亡特征性Ladder，流式細(xì)胞儀研究顯示S期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著下降，說明發(fā)生凋亡的細(xì)胞為處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞8。Western雜交結(jié)果顯示反

17、義DNA作用的肝癌細(xì)胞Cdk2、CyclinD1的表達(dá)量下調(diào)而p21表達(dá)增加。這就意味著端粒酶反義DNA通過對端粒酶活性的抑制而影響了細(xì)胞p21的表達(dá)。有研究表明細(xì)胞周期監(jiān)控機制的破壞可導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定和基因突變，腫瘤細(xì)胞CyclinD1的過度表達(dá)可縮短腫瘤細(xì)胞G1期使細(xì)胞持續(xù)生長，而p21的高表達(dá)則抑制腫瘤增殖并促進其發(fā)生分化9， p21能與Cdk2結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻止其與CyclinD1的結(jié)合。我們所合成的端粒酶反義DNA有可能通過細(xì)胞周期因子CyclinD1、Cdk2和p21的調(diào)控來抑制肝癌細(xì)胞的增殖。端粒酶反義DNA分子特異地與細(xì)胞內(nèi)端粒酶RNA結(jié)合，但對染色體端粒酶基因并無

18、封閉作用，因此，反義DNA對端粒酶活性的抑制是可逆的。我們將去除反義分子的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20天，端粒酶弱表達(dá)且不能恢復(fù)到原來的水平，發(fā)生這種現(xiàn)象的原因可能與下列因素有關(guān)：（1）進入細(xì)胞內(nèi)的反義DNA有足夠量結(jié)合新轉(zhuǎn)錄的端粒酶RNA模板序列；（2）端粒酶發(fā)揮作用必須以全酶的形式，端粒酶蛋白質(zhì)成分在端粒酶活性調(diào)控中起主要作用，反義分子與端粒酶 RNA 結(jié)合后可影響其蛋白質(zhì)亞單位的構(gòu)象或功能而影響端粒酶活性，即使細(xì)胞端粒酶RNA基因有轉(zhuǎn)錄，其蛋白質(zhì)成分也不能發(fā)揮作用；（3）端粒酶在細(xì)胞內(nèi)被滅活后, 腫瘤細(xì)胞自身也發(fā)生了一系列的變化，如分化、老化及凋亡，端粒酶活性均顯著降低10?？傊覀兊难芯勘砻鳎?/p>

19、粒酶反義DNA能抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，并通過此途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖、使S期細(xì)胞凋亡。靶向端粒酶的核酸類藥物有潛在臨床應(yīng)用前景，值得進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1 BU X,JIA F,WANG W,et al. Coupled down-regulation of mTOR and telomerase activity during fluorouracil²induced apoptosis of hepatocarcinoma cellsJ. BMC Cancer, 2007,7:208.2 Gryaznov SM, Jackson S, Dikmen G,et al. Olig

20、onucleotide conjugate GRN163L targeting human telomerase as potential anticancer and antimetastatic agentJ. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2007, 26(10²12):1577²1579.3 鄧志華，韓子巖，王琦，等.抑制端粒酶活性對AS2O3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響J.中國腫瘤生物治療雜志，2006，13（6）：457²461.4 Deng Y, Chang S. Role of telomeres and

21、telomerase in genomic instability, senescence and cancerJ. Lab Invest, 2007,87(11):1071²1076.5 鄧志華，王琦，韓子巖.端粒酶反義寡核苷酸對肝癌細(xì)胞生長的影響J.腫瘤防治研究，2006，33（6）：455²456.6 Iwado E, Daido S, Kondo Y, et al.Combined effect of 2²5A²linked antisense against telomerase RNA and conventional therapies on human malignant glioma cells in vitro and in vivoJ. Int J Oncol, 2007,31(5):1087²1095.7 Agbasi²Porter C,Ryman²Rasmussen J,Franzen S.et al.Transcription inhibition using