絕經(jīng)后退行性脊柱滑脫椎體軟骨終板內雌激素受體表達與青年女性的差異

1、絕經(jīng)后退行性脊柱滑脫椎體軟骨終板內雌激素受體表達與青年女性的差異【摘要】 目的：探討雌激素受體（ER）在絕經(jīng)后退行性脊柱滑脫（DS）軟骨終板內的表達及其意義。方法：用RTPCR方法檢測絕經(jīng)后DS與絕經(jīng)前年輕女性正常腰椎(N)的軟骨終板內ER mRNA的表達；Western blot方法檢測絕經(jīng)后DS與N的軟骨終板內ER蛋白質的表達；用免疫組織化學法（Envision法）檢測絕經(jīng)后DS與N的軟骨終板內ER的分布和表達，測定絕經(jīng)后DS患者血液中雌激素濃度；分析雌激素、ER和DS之間的關系。結果：ER mRNA的表達量在絕經(jīng)后DS的軟骨終板中較N明顯下降（P<0.05）；絕經(jīng)后DS的軟

2、骨終板中ER蛋白質的表達量較N明顯下降（P<0.05）；免疫組織化學結果顯示ER在絕經(jīng)后DS的軟骨終板中僅少量表達，在N的軟骨終板中表達量較強；絕經(jīng)后DS患者血液中雌激素濃度明顯下降。結論：女性在絕經(jīng)后體內雌激素下降，軟骨終板中ER表達量較N顯著下調，可能是引起絕經(jīng)后女性DS高發(fā)的原因之一。 【關鍵詞】 雌激素受體 退行性脊柱滑脫 軟骨終板 脊柱不穩(wěn)是指在脊柱結構喪失維持其自身生理平衡位置的能力，導致脊柱節(jié)段間位移超出其生理限度對于承載的異常反應。最常見的為退行性腰椎不穩(wěn)，長期的不穩(wěn)逐漸發(fā)展為退行性脊柱滑脫（degenerative spondylolishesis DS）。DS

3、是一種獨特形式的椎體滑脫，為神經(jīng)孔完整的進展性椎體滑移1。然而，DS的病因還不清楚。在過去幾十年中，大多數(shù)研究僅強調了關節(jié)突關節(jié)形態(tài)的異常23，但Love等4指出小關節(jié)角度的增加是小關節(jié)炎重建的結果，而不是DS的起始病因。 DS多見于女性，在40歲以前一般不發(fā)病，絕經(jīng)后發(fā)病率顯著升高。這表明雌激素在DS發(fā)病中可能有潛在作用。Richmond等5發(fā)現(xiàn)成人軟骨細胞中有雌激素受體（ER）、ER的mRNA表達和ER蛋白的存在，說明軟骨是雌激素敏感性組織。女性絕經(jīng)后體內雌激素水平下降，下調ER的表達，可能是絕經(jīng)后婦女高發(fā)DS的原因之一。 本研究對成年女性軟骨終板上ER進行檢測,比較絕經(jīng)前后軟骨終板上ER

4、的表達情況，旨在闡明雌激素及其受體在DS中的可能作用。 1 材料與方法 1.1 標本來源 取2006年4月 2006年8月期間東南大學附屬中大醫(yī)院骨科因DS行椎間植骨融合椎弓根釘內固定術的絕經(jīng)后患者共18例，術中用刮勺刮取軟骨終板（不包括骨性終板和軟骨下骨）作為實驗組，同期本校解剖教研室取新鮮女性尸體軟骨終板18例作為對照組。所有標本保存于-80 待提取RNA及蛋白質。記錄患者和尸體的體重、年齡和體重指數(shù)。以人群絕經(jīng)前婦女血液中平均雌激素濃度作為對照組，測患者術前清晨空腹血液中雌激素濃度作為實驗組。 1.2 主要試劑 兔抗人ER抗體（Abcam公司，英國），羊抗兔第二抗體（南京大治生物有限公司

5、），顯色試劑DAB（北京中杉生物有限公司）。TRNzol總RNA提取試劑盒（Takara公司），通用兩步法RTPCR試劑盒（北京博大泰克生物基因技術有限責任公司）。 1.3 實驗方法 1.3.1 RTPCR （1）細胞總RNA的提?。河梦⒘刻炱椒Q取100 mg組織，液氮冷凍，在研缽中不斷加入液氮的情況下研磨成粉末狀，轉入2 ml玻璃勻漿管在冰浴下制成組織勻漿，加入2 ml TRNzol試劑。按試劑說明書提取細胞內的總RNA，紫外分光光度儀（UV755B型，上海精密科學儀器有限公司）測定其濃度和純度，重復3次，計算樣本總RNA濃度，A260/A280值在1.8 2.0之間。（2）RNA完整性的鑒

6、定：溴化乙錠凝膠電泳，顯示28 S、18 S及5 S 3條帶，且28 S/18 S為2/1。（3）引物的設計與合成：在GenBank查到人類ER和actin（內參）的編碼序列及合成引物序列。ER擴增產(chǎn)物的長度為888 bp，上游引物為5AAGAGCTGC CAGGCCTGC3，下游引物為5CATCTCCAGCAGCA GGTCA3；actin擴增產(chǎn)物長度為621 bp，上游引物為5ACACTGTGCCCATCTACGAGG3，下游引物為5AGGGGCCGGACTCGTCATACT3。（4）RTPCR及凝膠成像分析：按照兩步法RTPCR試劑盒說明書分別進行反轉錄和PCR擴增，PCR的反應條件為變

7、性94 1 min,退火55 1 min,延伸70 1 min,共35個循環(huán),最后1個循環(huán)72 延伸7 min。取5 l的PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，應用image MASTER凝膠成像儀照相，而后用Labimage灰度分析軟件分析ER和actin條帶的強度，強度以灰度乘以面積表示。計算ER/actin的值（D值），正常軟骨終板的D值/DS軟骨終板的D值2.0（ND/DD2.0）即為陽性。 1.3.2 Western blot （1）用微量天平稱取50 100 mg組織，加入1 ml裂解液低溫快速勻漿，采用紫外分光光度法測定蛋白濃度。取蛋白100 g經(jīng)10%的SDSPAGE凝膠

8、電泳后轉移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉PBST溶液室溫下封閉1 h，PBST洗膜后加入5%的脫脂奶粉PBST溶液配制的兔抗人ER抗體（1500）4 過夜，洗膜后與用HRP標記的二抗進行雜交，洗膜后加入DAB進行顯色。（2）結果于image MASTER凝膠成像儀下掃描，掃描結果用Labimage灰度分析軟件進行強度分析，強度以灰度與面積的乘積表示。 1.3.3 免疫組織化學法 （1）終板組織經(jīng)硝酸脫鈣、蠟塊包埋，蠟塊切片（4 m）常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸組織抗原修復液對切片進行高壓抗原修復，加50 l兔抗人ER抗體（1100），室溫下孵育1 h，加50 l二抗，室溫下孵育10 15 min，加

9、100 l新鮮配制的DAB顯色4 min，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，切片用酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，對切片拍照。（2）染色陽性表達為棕黃色,無著色為陰性。以不加一抗為對照。 1.3.4 雌激素濃度的測定 采取靜脈血2 ml，EDTA抗凝，離心取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附的方法測定。 1.4 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以x-±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用t檢驗和方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 2 結 果 2.1 所取標本的人群特征 實驗組DS患者的平均年齡為55.5歲（43 68歲），對照組的平均年齡為22.5歲（18 2

10、7歲）；實驗組和對照組人群的體重為（61.1±0.822） kg和（59.7±1.095） kg，P=0.052，兩組之間無顯著差異；實驗組和對照組人群的BMI（體重指數(shù)）為（23.4±0.482） kg·m-2 和（22.9±0.260） kg·m-2，P=0.09，兩組之間無顯著差異。 2.2 ER mRNA在腰椎軟骨終板中的表達 通過RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)ER mRNA的表達量在DS軟骨終板中明顯低于正常腰椎（圖1A），經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)條帶強度在DS軟骨終板中為0.413±0.032，在正常腰椎軟骨終板中為0.842

11、7;0.018，且ND/DD的均值為2.04（圖1B），兩組之間的差異有顯著性（P<0.05）。 2.3 ER蛋白質在腰椎軟骨終板中的表達 通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)ER蛋白質的表達量在DS軟骨終板中顯著低于正常腰椎，經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)條帶強度在DS軟骨終板中為0.402±0.006，在正常腰椎軟骨終板中為0.475±0.020，兩組之間的差異有顯著性（P<0.05），并且此結果與RTPCR結果基本一致。見圖2。 2.4 免疫組織化學染色結果 免疫組織化學檢測可見ER為胞內受體；正常女性腰椎軟骨終板中膠原纖維排列緊密，DS軟骨終板中膠原纖維

12、排列紊亂，細胞數(shù)減少；女性DS軟骨終板中ER和正常腰椎軟骨終板相比明顯減少。見圖 3。 2.5 血液中雌激素濃度檢測結果 人群絕經(jīng)前女性血液中雌激素的濃度6卵泡期為37 330 pmol·L-1，排卵期為367 1 835 pmol·L-1，黃體期為184 881 pmol·L-1；實驗組女性患者血液平均雌激素濃度為56 pmol·L-1，同絕經(jīng)前相比明顯降低。 3 討 論 腰椎的穩(wěn)定是其運動節(jié)段的內源性穩(wěn)定因素與外力負荷相互作用時的平衡狀態(tài),即一種“穩(wěn)態(tài)”，而不穩(wěn)則是這種“穩(wěn)態(tài)”被破壞后出現(xiàn)的失穩(wěn)狀態(tài)，當這種失穩(wěn)狀態(tài)引發(fā)出各種臨床癥狀時即出現(xiàn)了不穩(wěn)癥。

13、腰椎的運動節(jié)段包括1個椎體間關節(jié)和2個關節(jié)突關節(jié)，正常情況下這3個關節(jié)維持著機械性平衡,但如果其中1個出現(xiàn)異常,則最終將破壞這種平衡而使運動節(jié)段失去穩(wěn)定性。過去認為關節(jié)突關節(jié)的退變、損傷、角度的增加是引起腰椎失穩(wěn)的主要原因，但Love等4指出小關節(jié)角度的增加是小關節(jié)炎重建的結果，而不是DS的起始?。徊⑶以缭?989年國內學者就已指出，腰椎間盤的退變可引起椎間盤高度下降,關節(jié)突關節(jié)囊松弛而重疊加大,黃韌帶回縮變厚,從而導致腰椎內在力學因素的改變,出現(xiàn)腰椎負重力線的重新分布,使相鄰節(jié)段的椎體不穩(wěn)7。 Imada等8通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除后病人DS的發(fā)病率是非切除病人的3倍，他們認為這是由于卵

14、巢切除造成體內雌激素水平急劇下降而使椎旁韌帶系統(tǒng)的彈性喪失造成的，而忽略了椎間盤在這其中的作用。Yves等9通過研究雌激素替代和非替代治療的絕經(jīng)后婦女椎間盤高度發(fā)現(xiàn)，替代治療組能夠顯著維持椎間盤的高度。這些研究表明雌激素有維持椎間盤高度、防止椎間盤退變的作用。椎間盤是由軟骨終板、纖維環(huán)和髓核構成，由于椎間盤是全身最大的無血管組織，其營養(yǎng)來源主要依賴于軟骨終板的滲透作用，因此椎間盤功能的維持依賴于軟骨終板的功能。軟骨終板是由軟骨細胞及其分泌的基質型膠原、蛋白多糖和水組成。 Richmond等5通過RTPCR和免疫組化的方法證明了成人軟骨細胞中ER、ER的mRNA表達和ER蛋白的存在，表明軟骨是雌

15、激素敏感組織。在本研究中通過RTPCR和Western blot發(fā)現(xiàn)在軟骨終板中存在ER，表明腰椎軟骨終板也是雌激素敏感性組織，并且還發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后DS患者軟骨終板中ER較正常腰椎顯著下降。近年來的研究表明，雌激素通過一系列的機制作用于軟骨細胞，影響軟骨組織的基質成分，從而影響其功能。萬榮等1011通過在培養(yǎng)的軟骨細胞中加入不同濃度的17雌二醇發(fā)現(xiàn)，雌二醇影響軟骨細胞膠原表型和蛋白多糖的分泌，不同濃度對軟骨細胞分泌功能的影響不同,生理濃度的雌二醇可以促進軟骨細胞分泌蛋白多糖和型膠原的分泌。另有學者通過卵巢切除術建立雌激素缺乏（絕經(jīng)）動物模型和17雌二醇替代治療的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除術后關節(jié)軟骨的損

16、傷較對照組明顯加重，關節(jié)軟骨和軟骨下骨的厚度和硬度增加，雌激素替代治療可以緩解軟骨的損傷1213。雌二醇可以緩和母羊卵巢切除術后關節(jié)軟骨中蛋白多糖含量和骨密度的下降14。不僅如此，Lee 等15發(fā)現(xiàn)通過在培養(yǎng)的軟骨細胞中加入17雌二醇，可以降低軟骨細胞MMP1的合成，維持MMPs和TIMPs之間的平衡，發(fā)揮對軟骨細胞的保護作用。采用同樣的方法，Horst等16發(fā)現(xiàn)雌激素可以保護軟骨細胞免受氧化應激的損害作用。同時雌激素可以通過調節(jié)胰島素樣生長因子水平增加蛋白多糖和膠原的合成,減少細胞因子介導的軟骨基質的降解5。上述研究表明雌激素可以促進終板軟骨細胞合成、分泌蛋白多糖和型膠原，從而維持終板軟骨的

17、基質成分，對終板軟骨發(fā)揮保護性作用。 通過檢測血液中雌激素濃度發(fā)現(xiàn)，女性在絕經(jīng)后體內雌激素水平顯著下降，由于ER本身處于不斷合成和分解之中，受其配體雌激素的調節(jié)，雌激素水平的下降引起軟骨細胞上ER數(shù)量和親和力下調。而劉斌等17通過對椎體終板軟骨細胞的提取和培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，軟骨終板中的軟骨細胞和關節(jié)軟骨細胞的表型和功能相似。由于體內雌激素水平下降、軟骨細胞上ER的下調，軟骨終板基質分泌下降、降解增加導致軟骨終板的退變，影響葡萄糖、氧等營養(yǎng)物質軟骨終板的滲透和椎間盤代謝廢物的排除，導致髓核內低氧、低葡萄糖、低pH值、高酸的微環(huán)境，髓核細胞功能改變，基質分泌功能下降，導致椎間盤的退變。軟骨終板和椎間盤的退

18、變使其不能正常發(fā)揮其傳遞負荷、吸收震蕩的功能，腰椎的負重力線發(fā)生改變，關節(jié)突關節(jié)負重增加，關節(jié)突關節(jié)損傷、退變、角度增加，從而發(fā)生腰椎不穩(wěn)，長期的不穩(wěn)逐漸進展為DS。所以，女性在絕經(jīng)后體內雌激素水平的下降及軟骨細胞上ER的下調可能是DS發(fā)生的原因之一。 體重和BMI是引起退行性腰椎不穩(wěn)的常見影響因素，而在本研究中所選取的實驗組和對照組在體重和BMI之間無顯著差異，排除了實驗組由于與對照組體重和BMI的不同而引起的DS。本研究發(fā)現(xiàn)，在腰椎軟骨終板中存在ER，并且絕經(jīng)后退行性腰椎不穩(wěn)患者體內雌激素濃度較絕經(jīng)前人群明顯下降，軟骨終板中ER mRNA和蛋白的表達量較青年女性腰椎軟骨終板內顯著下調，表明

19、雌激素及其受體可能是退行性腰椎不穩(wěn)的發(fā)生發(fā)展原因之一。這為我們進一步研究雌激素及其受體在退行性腰椎不穩(wěn)中的作用提供了一定的理論基礎?！緟⒖嘉墨I】 1HA K Y,CHANG C H,KIM K W,et al.Expression of estrogen receptor of the facet joints in degenerative spondylistheisJ.Spine,2005,30(5):562566.2BODEN S D,RIEW K D,YAMAGUCHI K,et al.Orientation of the lumbar facet joints:associatio

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