PCR 技術(shù)的種類及其應(yīng)用

1、PCR 技術(shù)的種類及其應(yīng)用 1 PCR 技術(shù)的基本原理PCR 技術(shù)是在模板DNA、引物和四種dNTP等存在的條件下, 依賴于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步：變性、退火、聚合。以上三步為一個循環(huán)， 每一循環(huán)的產(chǎn)物DNA又可以作為下一個循環(huán)模板，數(shù)小時后，介于兩個引物之間的目的DNA得到了大量的復(fù)制，經(jīng)2530次循環(huán)DNA數(shù)量可達(dá)2×1067拷貝數(shù)。2PCR技術(shù)的種類2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技術(shù)原理：反向PCR是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法主要原理是用一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組I)NA后酶切片段自身環(huán)化

2、以環(huán)化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段 。該方法的不足是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。2.2錨定PC

3、R(Anchored PCR, APCR)技術(shù)用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增, 稱為APCR。應(yīng)用：它可用于擴(kuò)增未知或全知序列, 如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。2.3不對稱PCR(asymmetric PCR)技術(shù)兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術(shù)稱不對稱PCR。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度, 常用50100÷1比例。在最初的1015個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA, 但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后, 高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈DNA。應(yīng)用：可制備單鏈DNA片段用于序列分析或核酸

4、雜交的探針。2.4反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription, RT- PCR)技術(shù)當(dāng)擴(kuò)增模板為RNA時, 需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增。RT - PCR應(yīng)用非常廣泛, 無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等都經(jīng)常采用。2.5修飾引物PCR技術(shù)為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的, 如定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等, 可在引物的5-端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析結(jié)合位點(diǎn)等 。2.6巢式PCR(NEST PCR)技術(shù)先用一對靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量, 然后再用一對內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的PCR帶, 此為巢式PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PC

5、R。為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長些, 且用量較少, 同時在第一次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度, 這樣在第一次PCR時, 由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合, 故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物, 經(jīng)過若干次循環(huán), 待外引物基本消耗盡, 無需取出第一次PCR產(chǎn)物, 只需降低退火即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟, 同時也降低了交叉污染的機(jī)會。這種PCR稱中途進(jìn)退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三種方法主要用于極少量DNA模板的擴(kuò)增。2.7等位基因特異性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技術(shù)AS

6、PCR依賴于引物3- 端的一個堿基錯配,不僅減少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板復(fù)合物的熱穩(wěn)定性。這樣有點(diǎn)突變的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后檢測不到擴(kuò)增產(chǎn)物,可用于檢測基因點(diǎn)突變。2.8單鏈構(gòu)型多態(tài)性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技術(shù)SSCP- PCR是根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中,單鏈DNA遷移率除與DNA長度有關(guān)外,更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象, 相同長度的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異所形成的構(gòu)象就

7、會不同,PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時, 每條單鏈處于一定的位置,靶DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個堿基置換時,就會出現(xiàn)泳動變位,從而提示該片段有基因變異存在。2. 9低嚴(yán)格單鏈特異性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)技術(shù)LSSP - PCR 是建立在PCR 基礎(chǔ)上的又一種新型基因突變檢測技術(shù)。要求是“二高一低”, 高濃度的單鏈引物( 5- 端/ 3- 端引物均可),約4. 8Lmol,高濃度的Taq 酶( 16Lmol/ 100ml) , 低退火溫度( 30),所用的模板必須是純化的DNA片段。在

8、這種低嚴(yán)格條件下, 引物與模板間發(fā)生不同程度的錯配, 形成多種大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物, 經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。對同一目的基因而言, 所形成的帶型是固定的, 因而稱之為“基因標(biāo)簽”。這是一種檢測基因突變或進(jìn)行遺傳鑒定的快速敏感方法。2.10復(fù)合PCR(multiplex PCR)技術(shù)在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴(kuò)增幾種基因片段,如果基因的某一區(qū)段有缺失,則相應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。復(fù)合PCR主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點(diǎn)突變的分子病的診斷。2.11重組PCR技術(shù)重組PCR技術(shù)是在兩個PCR擴(kuò)增體系中, 兩對引物分別由其中之一在其5-端和3-端引物上帶上一段互補(bǔ)的序列,

9、混合兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)變性和復(fù)性,兩組PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR 條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng),產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。2.12隨機(jī)引物擴(kuò)增技術(shù)(arbitrary primedPCR, AP- PCR)AP-PCR技術(shù)通過隨意設(shè)計或選擇一個非特異性引物,在PCR反應(yīng)體系中,首先在不嚴(yán)格條件下使引物與模板中許多序列通過錯配而復(fù)性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復(fù)性引物存在,則可經(jīng)Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生DNA片段的擴(kuò)增, 經(jīng)一至數(shù)輪不嚴(yán)格條件下的PCR循環(huán)后,再于嚴(yán)格條件下進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DNA測序凝膠電泳分離后,經(jīng)放射性自顯影或熒光顯示

10、即可得到DNA指紋圖。AP-PCR用于腫瘤的抑制基因、癌基因的分離；菌種、菌株及不同物種的鑒定；遺傳作圖；不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達(dá)差異等方面的研究。2.13 差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術(shù)d-PCR可以定量檢測標(biāo)本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度,或在引物5- 端標(biāo)記上放射性核素后,通過檢測兩條區(qū)帶放射性強(qiáng)度即可測出目的基因的拷貝數(shù)。2.14定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術(shù)qPCR技術(shù)是用合成的RNA作為內(nèi)標(biāo)來檢測PC

11、R擴(kuò)增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內(nèi)標(biāo)用相同的引物共同擴(kuò)增,但擴(kuò)增出不同大小片段的產(chǎn)物,可容易地電泳分離。一種內(nèi)標(biāo)可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用于研究基因表達(dá),能提供特定DNA基因表達(dá)水平的變化,在癌癥、代謝紊亂及自身免疫性疾病的診斷和分析中很有價值。2.15 競爭性PCR(competitive PCR, c-PCR)技術(shù)c-PCR技術(shù)是競爭cDNA模板與目的cDNA 同時擴(kuò)增,使用同樣的引物,但一經(jīng)擴(kuò)增后, 能從這些目的cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板,其序列與目的cDNA序列相同,不過模板中僅有一個新內(nèi)切位點(diǎn)或缺少內(nèi)切位點(diǎn),突變性的cDNA 模板可用

12、適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶水解,并用分光計測定其濃度。cDNA目的序列和競爭模板相對應(yīng)的含量,可用溴化乙錠染色,電泳膠直接掃描進(jìn)行測定,或摻入放射性同位素標(biāo)記的方法測定。競爭模板開始時的濃度是已知的,則cDNA目的序列的最初濃度就能測定。這種方法能精確測定mRNA中cDNA靶序列,可用于幾個到10個細(xì)胞中mRNA 的定量。2.16半定量PCR(semiquantitative PCR,sq- PCR)技術(shù)sq-PCR不同于c-PCR的是參照物ERCC-2的PCR產(chǎn)物與目的DNA的PCR產(chǎn)物相似,并分別在試管中擴(kuò)增。sq- PCR的流程為樣品和內(nèi)參照RNA分別經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后樣品cDNA和一系列不同量

13、參照cDNA分別在不同管進(jìn)行擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳拍照,光密度計掃描,作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過回歸公式便可定量表達(dá)的基因量。雖然管與管之間的擴(kuò)增效率難以控制,但由PCR擴(kuò)增的所有樣本和參照物在不同的實(shí)驗(yàn)中差異很小。這種敏感的技術(shù)可用于其他低表達(dá)的基因定量2.17原位PCR( in situ PCR)技術(shù)原位PCR綜合了PCR 和原位雜交( Insitu hybridization, ISH) 的優(yōu)點(diǎn),是一種在組織切片或細(xì)胞涂片上原位對特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增,再用特異性的探針原位雜交檢測。原位PCR標(biāo)本一般需先經(jīng)化學(xué)固定,以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜有一定的通透性,P

14、CR擴(kuò)增所需的各種成分可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi),在原位對特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織, 不易透過細(xì)胞膜向外彌散, 故保留在原位。這樣就很容易應(yīng)用ISH將其檢出,同時還可對目的DNA序列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。2.18免疫PCR(immuno PCR)技術(shù)抗原-抗體反應(yīng)與PCR技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生了免疫PCR，是目前為止最為敏感的檢測方法,理論上可測到一個抗原分子的存在。通過用一個具有對DNA和抗體雙重結(jié)合活性的連接分子,使作為標(biāo)記物的DNA分子特異地結(jié)合到Ag- Ab復(fù)合物上，從而形成Ag- Ab- DNA復(fù)合物，附著的DNA標(biāo)記物可用適宜的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。特異性P

15、CR產(chǎn)物的存在證明DNA標(biāo)記物分子特異地附著于Ag - Ab復(fù)合物上，進(jìn)而證明有Ag存在。吳自榮等將Ab通過化學(xué)交聯(lián)劑直接連接到分子上構(gòu)建成Ab-DNA探針,組成免疫PCR檢測新模式，具有高度靈敏和特異性。免疫PCR可對流行性傳染病( 如肝炎、愛滋病等)進(jìn)行檢測，檢測體液中致癌基因和癌基因表達(dá)的微量蛋白等。2.19長片段PCR(long-PCR)技術(shù)長片段PCR是用高質(zhì)量模板DNA保證其完整性,引物應(yīng)較長( 2134bp)，使用高的退火溫度及錯配率更低的酶，將無3-5外切酶活性的DNA聚合酶和低濃度有3- 5外切酶活性的DNA聚合酶組合使用，緩沖體系通過提高Tris的濃度或改用Tricine緩

16、沖液以增強(qiáng)緩沖能力，并調(diào)高體系的pH。熱循環(huán)參數(shù)總的來說需增加延伸時間，一般1kb/ min，同時采用熱啟動。長片段PCR在限制性片段多態(tài)性及單體型分析、染色體基因步移、DNA序列分析及基因突變的鑒定等方面得到應(yīng)用。3 PCR技術(shù)的應(yīng)用3.1 PCR技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用3.1.1 PCR在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用目前，相關(guān)研究人員已經(jīng)利用PCR技術(shù)成功建立了檢測轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、大豆和玉米的技術(shù)路線，對轉(zhuǎn)基因大豆和玉米的檢測低限分別到達(dá)了1和0.1。3.1.2 PCR在研究植作物生長發(fā)育方面的作用植物的生長、發(fā)育、分化和衰老都涉及許多基因的時空順序表達(dá)，因此研究這個過程中基因表達(dá)的變化是揭示生長發(fā)育機(jī)

17、理的重要手段。定量RT-PCR是研究植物基因表達(dá)水平變化的一項(xiàng)重要技術(shù)。通過研究不同植物或同意植物不同發(fā)育時期的基因表達(dá)水平來揭示植物生長發(fā)育的機(jī)理。3.1.3 PCR在作物抗病性基因分析、定位中的應(yīng)用在作物病害研究中，作物抗病性及其機(jī)制研究一直是當(dāng)今作物病理學(xué)和作物抗病育種中的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問題。而我們現(xiàn)在已經(jīng)知道作物對病原物的抗性是由相對的基因所控制的，即被廣泛認(rèn)可的基因?qū)蚶碚?。因此，尋找與作物抗病性緊密連鎖的基因標(biāo)記，即將抗病性基因進(jìn)行定位的研究中具有十分重要的理論意義和實(shí)踐意義。利用PCR和RAPD技術(shù)能夠找到與抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將其進(jìn)行定位。3.2 PCR技術(shù)在食品科學(xué)中的應(yīng)

18、用PCR技術(shù)在食品科學(xué)中主要用于對食品中微生物含量的檢測。應(yīng)用PCR技術(shù)，只需數(shù)小時，就可以用電泳法檢測出來0.1mgDNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列；用PCR擴(kuò)增細(xì)菌中保守的DNA片段，還可對那些人工無法培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測。3.3 PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用目前，全世界利用PCR技術(shù)診斷感染性疾病每年達(dá)幾千萬人次，可見其巨大的市場潛力。PCR技術(shù)主要用于腫瘤、遺傳病和感染性疾病的診斷。3.3.1 PCR在腫瘤診斷上的應(yīng)用遺傳學(xué)改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發(fā)生突變、缺失、增加和易位等而導(dǎo)致了細(xì)胞癌變。PCR不但能有效地檢測基因的突變、重排、易位等，而且能準(zhǔn)確檢測癌基因表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預(yù)后評估等。