環(huán)境微生物綜合實(shí)驗(yàn)報告2015

1、環(huán)境工程微生物學(xué)綜合性試驗(yàn)報告環(huán)境水樣微生物學(xué)指標(biāo)檢測學(xué)院：資源與環(huán)境學(xué)院專業(yè)：環(huán)境工程專業(yè)班級：環(huán)境131班組別：環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)B組組員： 目錄前言3實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?采樣安排4醫(yī)學(xué)院采樣點(diǎn)分布圖4西安工業(yè)大學(xué)采樣點(diǎn)分布圖5醫(yī)學(xué)院采樣過程照片5西安工業(yè)大學(xué)采樣過程照片6采樣數(shù)據(jù)記錄表6材料方法6實(shí)驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備及試劑6儀器6培養(yǎng)基6實(shí)驗(yàn)原理與步驟7實(shí)驗(yàn)一7實(shí)驗(yàn)二7實(shí)驗(yàn)三8實(shí)驗(yàn)四9實(shí)驗(yàn)五9實(shí)驗(yàn)六10結(jié)果與分析11采樣記錄11水樣總細(xì)菌群落測定11.大腸菌群檢驗(yàn)初發(fā)酵結(jié)果的觀察14平板分離及革蘭氏染色結(jié)果記錄16平板分離得到的陽性菌落的相應(yīng)特征記錄19復(fù)發(fā)酵結(jié)果的觀察和大腸菌群數(shù)目的MPN統(tǒng)計

2、20大腸菌群數(shù)目的MPN統(tǒng)計21參考文獻(xiàn)21使用教材及參考書21環(huán)境工程微生物學(xué)綜合性試驗(yàn)報告綜合實(shí)驗(yàn)環(huán)境水樣微生物學(xué)指標(biāo)檢測前言  運(yùn)用綜合應(yīng)用微生物學(xué)基本原理和基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，獨(dú)立完成培養(yǎng)基的制備與滅菌操作及不同類型微生物的分離、純化、觀察、描述，可初步進(jìn)行鑒定、分類（此步不作要求）?？梢詾槲鬯?、垃圾等生物處理進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笞詠硭⒑?、池、湖水、純凈水中微生物學(xué)指標(biāo)的檢測水樣來源：西安工業(yè)大學(xué)湖水和西安醫(yī)學(xué)院湖水1、基本內(nèi)容l 學(xué)習(xí)水樣的采樣方法，采用平板菌落計數(shù)技術(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)；采用多管發(fā)酵法（MPN）測定水中大腸菌群。說明多管發(fā)酵法檢測水樣中大

3、腸菌群的原理和操作過程。l 記錄并報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。l 結(jié)果分析與討論，經(jīng)與國家標(biāo)準(zhǔn)比對檢查，水質(zhì)狀況分析。2、基本要求l 全面掌握微生物實(shí)驗(yàn)基本操作技能；l 掌握水中細(xì)菌總數(shù)測定方法；了解水質(zhì)與細(xì)菌菌落之間的相關(guān)性；l 了解總大腸菌群數(shù)量指標(biāo)在環(huán)境領(lǐng)域的重要性；l 掌握測定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法。實(shí)驗(yàn)操作    本實(shí)驗(yàn)需要的基本操作訓(xùn)練已經(jīng)在前面的一些實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)過，在這里不再一一列出每一操作步驟。為了幫助預(yù)習(xí)，將有關(guān)操作名稱列出，這些操作在建議參考書中都可以找到。1 培養(yǎng)基配制和滅菌2 無菌操作分離純化3 細(xì)菌染色和顯微鏡使用4 菌落特征觀察和描述5

4、 系列稀釋方法6  細(xì)菌鑒定指標(biāo)測定采樣安排內(nèi)容安排：水樣采集時間：11月27日上午（一部分組員采樣，一部分組員準(zhǔn)備滅菌器具和配制培養(yǎng)基）步驟和注意事項(xiàng)：1. 按照樣品采集表（表1，見結(jié)果與分析）記錄樣點(diǎn)，編號，采樣時間，天氣，氣溫，水位，水質(zhì)，現(xiàn)場監(jiān)測項(xiàng)目(pH)，采樣人姓名。并畫出采樣湖的平面圖，圖上標(biāo)示出采樣點(diǎn)位置。醫(yī)學(xué)院采樣點(diǎn)分布圖西安工業(yè)大學(xué)采樣點(diǎn)分布圖2.容器應(yīng)先用混合均勻的水樣充分洗滌23次，然后正式取樣；注意避免攪動沉積物而使水樣受污染；采集表層水樣時，應(yīng)注意不能混入漂浮于水面上的物質(zhì)。3. 采樣時的照片記錄醫(yī)學(xué)院采樣過程照片西安工業(yè)大學(xué)采樣過程照片采樣數(shù)據(jù)記錄表見結(jié)

5、果與分析材料方法實(shí)驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備及試劑儀器1 顯微鏡 2 革蘭氏染色用有關(guān)器材。3 高壓蒸汽滅菌器。4 干熱滅菌箱。5 恒溫箱。6 冰箱。7 放大鏡。8 試管、平皿（直徑9cm）、刻度吸管等，置于干熱滅菌箱中160滅菌2h。培養(yǎng)基1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液成分：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g 、氯化鈉5g、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml 蒸餾水1000ml2 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制3 伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g 、乳糖10g 、磷酸氫二鉀2g 、瓊脂粉25g、蒸餾水1000ml 、2%伊紅水溶液20ml、 0.5 %美藍(lán)水溶液13ml 4 牛肉膏

6、蛋白胨固體培養(yǎng)基胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸餾水1000ml、用1mol/LNaOH調(diào)pH至7.0、瓊脂粉20g 實(shí)驗(yàn)原理與步驟實(shí)驗(yàn)一內(nèi)容安排：水樣采集時間：11月27日上午步驟和注意事項(xiàng)：1.按照樣品采集表（表1）記錄樣點(diǎn)，編號，采樣時間，天氣，氣溫，水位，水質(zhì)，現(xiàn)場監(jiān)測項(xiàng)目(pH)，采樣人姓名。并畫出采樣湖的平面圖，圖上標(biāo)示出采樣點(diǎn)位置2.容器應(yīng)先用混合均勻的水樣充分洗滌23次，然后正式取樣；注意避免攪動沉積物而使水樣受污染；采集表層水樣時，應(yīng)注意不能混入漂浮于水面上的物質(zhì)。3.采樣時的照片記錄實(shí)驗(yàn)二內(nèi)容安排：水樣總菌落數(shù)測定及大腸菌群檢驗(yàn)之初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時間：11月

7、29日 9:00到12:00步驟和注意事項(xiàng)：一按照每組檢測兩個水樣準(zhǔn)備要進(jìn)行滅菌的玻璃器皿和試劑，包括：1.進(jìn)行水樣總菌落數(shù)測定和大腸菌群檢驗(yàn)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的試管、移液管和三角瓶等。試管18支（水樣總菌落數(shù)測定中稀釋6個梯度需5支，兩個水樣一共10支；大腸菌群檢驗(yàn)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵管需4支，兩個水樣一共8支）；三角瓶2個（水樣總菌落數(shù)測定中初次稀釋需1個，兩個水樣共2個）；移液管10只（水樣總菌落數(shù)測定梯度稀釋需10ml一支，2ml的4支，兩個水樣共10支）；培養(yǎng)皿12個（水樣總菌落數(shù)測定共涂板3個梯度，每個梯度2個板子，共6個，兩個水樣共12個）；2.準(zhǔn)備培養(yǎng)基：a.供大腸菌群檢驗(yàn)之初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵實(shí)

8、驗(yàn)的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（每只試管5到10mL，一個水樣3管，兩個水樣共6管，加上復(fù)發(fā)酵需用的，至少準(zhǔn)備120mL，可以一次配制300mL，供2組使用）；b.供大腸菌群檢驗(yàn)之初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（每只試管5到10mL，一個水樣1管，兩個水樣共2管至少準(zhǔn)備20mL，一個班配制200mL<老師指定人員配制>，供全部小組使用）；c.供水樣總菌落數(shù)測定的蛋白胨固體培養(yǎng)基（每只培養(yǎng)皿25mL左右，12個培養(yǎng)皿300mL，每組至少配制300mL）3.發(fā)酵管的準(zhǔn)備：將4支洗凈的杜氏小管裝入4個試管中，2個水樣共準(zhǔn)備8支裝有杜氏小管的試管，然后在其中的6支中灌入普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

9、，2支灌入三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（注意，將大試管傾斜45度左右或更大角度，慢慢注入培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液在進(jìn)入大試管的同時緩緩進(jìn)入大試管中的杜氏小管中，并將杜氏小管中的空氣擠壓出去，若灌完培養(yǎng)液后仍有氣體存在，可以用指頭輕彈試管壁將之震出）；4.滅菌水的準(zhǔn)備，每組至少準(zhǔn)備500mL純凈水進(jìn)行滅菌。二滅菌：1.將配制好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和分裝好普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液和三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管，以及剩下的未用完的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液和三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，還有之前準(zhǔn)備好的各項(xiàng)玻璃器皿包裝好放入滅菌鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。滅菌完畢后，一部分人進(jìn)行水樣的梯度稀釋（注意，初次稀釋要進(jìn)行大體積稀釋

10、，例如將20mL水樣加入180mL滅菌水中；每一步稀釋都必須保證將水樣混勻，特別是在進(jìn)行試管稀釋時，切記）；同時，一部分組員進(jìn)行牛肉膏蛋白胨平板的倒板工作（若選擇直接倒板法涂板的可不用進(jìn)行此部分）；稀釋用的移液管要編號保存，后面涂LB平板的時候要對應(yīng)吸取稀釋的水樣；2.大腸菌群檢驗(yàn)初發(fā)酵管的接種：將10mL原始水樣加入到裝有三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，1mL原始水樣加入1支裝有普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中；稀釋10-1和10-2的水樣分別加入裝有普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液發(fā)酵管中將接種完畢的發(fā)酵管放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h到48h.3.水樣總菌落數(shù)測定之涂平板：從10-3到10-6稀釋梯度

11、中選擇3個梯度的稀釋水樣進(jìn)行LB平板的涂板，方法可選用倒板法（在平板中加入1mL水樣后倒入20mL LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)基溫度必須控制在40以下，倒板速度要快，防止倒板過程中LB固體培養(yǎng)基凝固）或涂板法（將1mL菌液加入到制好的LB平板上，再使用涂布器涂勻，涂布器每次使用前都要酒精燈干熱滅菌，冷卻后再涂板）；涂制好的平板放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h到48h。實(shí)驗(yàn)三內(nèi)容安排：水樣總菌落數(shù)測定及大腸菌群檢驗(yàn)之初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察和記錄時間：11月29日早上9:00到12:00（一部分組員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)二的結(jié)果觀察和記錄，一部分組員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)四的內(nèi)容，先制作伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，清洗出計數(shù)后不用的培養(yǎng)皿（按照初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)

12、果，有幾個陽性結(jié)果準(zhǔn)備幾個培養(yǎng)皿）進(jìn)行包裹滅菌，和制備好的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基一同滅菌）步驟和注意事項(xiàng)：1.水樣總菌落數(shù)測定結(jié)果的觀察（記錄到表2中）菌落計數(shù)：肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記；必要時分區(qū)計數(shù)，菌落成片者作廢。計算方法：a.某稀釋度的菌落數(shù)=兩平板菌落數(shù)取平均值。b.計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度l 僅有一個稀釋度在此范圍：總菌落數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)；l 有兩個稀釋度在30-300之間，兩梯度菌落數(shù)之比（兩個稀釋梯度涂板后所長的菌落數(shù)的比例）>2，選較小值作為菌落數(shù)進(jìn)行計算，菌落數(shù)之比<2，取平均值；l 所有稀釋度均>300，取稀釋倍數(shù)最大者的

13、菌落數(shù)進(jìn)行計算；l 所有稀釋度均<30，取稀釋倍數(shù)最小者的菌落數(shù)進(jìn)行計算；l 沒有任何稀釋度在30-300之間，選最接近該范圍者；c.結(jié)果單位：CFU/mld.稀釋度選擇及細(xì)菌總數(shù)結(jié)果記錄2.大場菌群檢驗(yàn)初發(fā)酵結(jié)果的觀察按照表3進(jìn)行初發(fā)酵結(jié)果的記錄，產(chǎn)氣變色、產(chǎn)氣不變色、變色不產(chǎn)氣和不產(chǎn)氣不變色但變渾濁均為可疑陽性予以記錄，不產(chǎn)氣不變色也不渾濁為陰性記錄，產(chǎn)氣不變色不渾濁為操作失誤。實(shí)驗(yàn)四內(nèi)容安排：大腸菌群檢驗(yàn)之平板分離實(shí)驗(yàn)時間：11月30日19:30到21:00步驟和注意事項(xiàng)：1.伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基的配制按照課本上的方式配制伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基，按照初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果（有幾個陽性結(jié)果準(zhǔn)備幾個

14、培養(yǎng)皿）準(zhǔn)備所需培養(yǎng)基量（每個平板20-25mL）；2.滅菌將準(zhǔn)備好的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基以及倒平板所需的培養(yǎng)皿（按照初發(fā)酵陽性結(jié)果數(shù)目進(jìn)行準(zhǔn)備）；3.倒板將滅菌好的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基倒入滅菌培養(yǎng)皿完成制板；4.涂板或劃線將初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中陽性管中的菌液稀釋一定倍后(菌液渾濁度大的稀釋倍數(shù)適當(dāng)放大）吸取1mL稀釋菌液進(jìn)行涂板，或者直接使用接種環(huán)沾取初發(fā)酵陽性菌液進(jìn)行平板劃線，劃線方式按圖1進(jìn)行，劃線后的平板放入37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)五內(nèi)容安排：大腸菌群檢驗(yàn)之平板分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察、革蘭氏染色和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時間：12月2日10:00到12:00（一部分組員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)四結(jié)果的觀察和記錄并進(jìn)行革蘭氏染色，另一部分組

15、員進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)需用的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的準(zhǔn)備<如果實(shí)驗(yàn)二中剩下的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液沒有受污染則直接使用，準(zhǔn)備復(fù)發(fā)酵管，并進(jìn)行滅菌>，之后對滅菌后的復(fù)發(fā)酵管進(jìn)行接種）步驟和注意事項(xiàng)：1.復(fù)發(fā)酵管的準(zhǔn)備直接準(zhǔn)備4個裝有杜氏小管的發(fā)酵管，按照實(shí)驗(yàn)二的介紹加入實(shí)驗(yàn)二時剩下的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（每管5或10mL，若剩下的培養(yǎng)基已經(jīng)受污染，則必須重新配制）。2.滅菌將步驟1中準(zhǔn)備好的復(fù)發(fā)酵管進(jìn)行滅菌。3.平板分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察在滅菌等待過程中，進(jìn)行平板分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察，其中平板上的菌落若符合以下顏色特征則標(biāo)記為陽性菌落。深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫

16、紅色，中心色較深的菌落。4. 革蘭氏染色挑取步驟3中的陽性菌落的一小部分進(jìn)行革蘭氏染色（步驟如下），記錄結(jié)果。a用培養(yǎng)1824h的培養(yǎng)物涂片，涂層要??；b將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min后用水洗去；c滴加助色劑，1min后用水洗去；d滴加脫色劑，搖動玻片，直止無紫色脫落為止（約2030s），用水洗去；e滴加復(fù)染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。5.平板分離及革蘭氏染色結(jié)果記錄平板分離得到的陽性菌落的相應(yīng)特征按照表4進(jìn)行記錄，并補(bǔ)充革蘭氏染色結(jié)果。6.復(fù)發(fā)酵管的接種使用接種環(huán)挑取步驟4中革蘭氏染色陰性的菌落的另一部分，直接接種于

17、復(fù)發(fā)酵管中，注意做好編號記錄，放入37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)六內(nèi)容安排：復(fù)發(fā)酵結(jié)果的觀察和大腸菌群數(shù)目的MPN統(tǒng)計時間：12月4日8:00到10:00步驟和注意事項(xiàng)：1.復(fù)發(fā)酵結(jié)果的觀察記錄按照實(shí)驗(yàn)三中步驟2的方式進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果（參照P418頁產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況分析）的記錄。2.大腸菌群數(shù)目的MPN統(tǒng)計依據(jù)步驟1的結(jié)果，根據(jù)附錄六表3（P450頁），報告總大腸桿菌群數(shù)。結(jié)果與分析采樣記錄表1水樣采集記錄表（1）西安醫(yī)學(xué)院采樣記錄表觀測項(xiàng)目水樣編號1水樣編號2水樣編號3采集時間11:1211：3011:35采集時溫度10.810.89.7采集地點(diǎn)ABC水體顏色淡黃色淡黃色淡黃色水體渾濁度輕度渾濁輕

18、度渾濁輕度渾濁水體面積180平米180平米180平米水體漂浮物（有無大面積藻類）無無無水體pH值7.07.07.1水體周圍環(huán)境（人員流動密度）較多較多較多（2）西安工業(yè)大學(xué)采樣記錄表觀測項(xiàng)目水樣編號1水樣編號2水樣編號3采集時間10：0010：0210：17采集時溫度666水體顏色黃綠色黃綠色黃綠色水體渾濁度輕度渾濁輕度渾濁輕度渾濁水體漂浮物（有無大面積藻類）無無無水體pH值787878水體周圍環(huán)境（人員流動密度）稀少稀少稀少水樣總細(xì)菌群落測定醫(yī)學(xué)院（稀釋濃度依次為10-2 10-3 10-4）西安工業(yè)大學(xué)表2水樣總細(xì)菌群落測定結(jié)果記錄表稀釋平均菌落水樣來源稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋度菌落數(shù)之比細(xì)菌總數(shù)（個/g或個/ml）報告方式（個/g或個/ml）10-210-310-4西安工業(yè)大學(xué)-50-500000500000西安醫(yī)學(xué)院-235356.71350000350000.大腸菌群檢驗(yàn)初發(fā)酵結(jié)果的觀察初發(fā)酵結(jié)果（照片）西安醫(yī)學(xué)院西安工業(yè)大學(xué)表3初發(fā)酵結(jié)果記錄表(1)醫(yī)學(xué)院記錄表管號是否變色是否有氣體產(chǎn)生是否渾濁備注1 是是是可疑陽性2 否否是可疑陽性3 否否否陰性（2）西安工業(yè)大學(xué)管號是否變色是否有氣體產(chǎn)生是否渾濁備注1 是是是可疑陽性2 否否是可疑陽性3 否否否陰性平板分離