脲酶Km值的測定

1、脲酶Km值的測定、背景與目的Km值一般可看作是酶促反應(yīng)中間產(chǎn)物的解離常數(shù)。測定Km在研究酶的作用機制、 觀察酶與底物間的親和力大小、鑒定酶的種類及純度、區(qū)分競爭性抑制與非競爭性抑制作用等中均 具有重要意義。當(dāng)環(huán)境溫度、pH值和酶的濃度等條件相對恒定時，酶促反應(yīng)的初速度v隨底物濃度S增大而增大，直至酶全部被底物所飽和達(dá)到最大速度V。反應(yīng)初速度與底物濃度之間的關(guān)系經(jīng)推導(dǎo)可用下式來表示，即米氏方程式：* Km + &對于K值的測定，我們通常采用 Lineweaver-Burk作圖法，即雙倒數(shù)作圖法。具體做法 為：取米氏方程式倒數(shù)形式。1Km t VV V若以1/v對1/S作圖，即可得下圖中的

2、曲線， 通過計算橫軸截距的負(fù)倒數(shù)，就可以很方便地求得K值。本實驗從大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生碳酸銨，碳酸銨在堿性溶液中與納氏試劑作用，產(chǎn)生橙黃色的碘化雙汞銨。在一定范圍內(nèi)，呈色深淺與碳酸銨的產(chǎn)量成正比。通 過分光光度計所得到的光吸收值可代表酶促反應(yīng)的初速度(單位時間所產(chǎn)生的碳酸銨含量與光吸收值成正比)。具體反應(yīng)如下：(1)酶促反應(yīng)NH；OH()NH1C=O +H孔一-C=C)十 NHjC=<)2NH3 + H2CO31NH；-NHZNHZ J(2 )呈色反應(yīng)NHQH十2(HkJ * 2KI)+ 3NaOH通過本實驗學(xué)習(xí)大豆脲酶的提取方法；掌握脲酶米氏常數(shù)Km勺測定方法。儀器與試

3、劑1. 儀器(1) 721型分光光度計(2)恒溫水浴鍋2. 試劑0.05mol/L 尿素溶液 0.1mol/LpH=7.0Tris-HCI 緩沖液10%Z nS04溶液 0.5mol/LNaOH 溶液(5) 10%酒石酸鉀鈉溶液奈氏試劑 三實驗方法1. 脲酶提取液的制備(由老師準(zhǔn)備)2. 取5支試管編號，按下表加入試劑和操作，加入試劑量單位為 mL試管編號012340.05mol/L 尿素0.251.000.500.400.25每管中尿素的mol數(shù)51.25 X 10-55X 10-52. 5 X 10-52X 10-51.25 X 10-蒸餾水0.75一0.500.600.75PH=7Tri

4、s-鹽酸緩沖液3.003.003.003.003.0025 C恒溫水浴，預(yù)溫 5min脲酶提取液一0.100.100.100.10煮沸的脲酶0.10一一一一25 C恒溫水浴，準(zhǔn)確作用10min10%Z nSO1.001.001.001.001.000.5mol/LNaOH0.200.200.200.200.20充分混勻，過濾另取5支試管，與上述離心管對應(yīng)編號，如下操作上清液0.500.500.500.500.50蒸餾水4.004.004.004.004.0010%酉石酸鉀鈉0.500.500.500.500.50鈉氏試劑1.001.001.001.001.00混合均勻，以對照管調(diào)零，在480n

5、m處，讀取各管的A48o4值A(chǔ)180 nrt值以酶促反應(yīng)初速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)（以 1/ A 480nm代替），以保溫混合液中脲酶提取液濃度，以mol數(shù)計的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，按雙倒數(shù)作圖法，求得K值1/ A 480nm1/SKm82164205328參考數(shù)值Km*S=每管中尿素的mol數(shù)/4.1mL X 10 -3 （4.1mL為酶促反應(yīng)總體積）五、 注意事項 (1)米氏方程系線性方程，酶促反應(yīng)初速度v與光吸收值A(chǔ)成正比，所以用1/A代表1/v作圖求K值，方法簡便，且結(jié)果不受影響。( 2 )本實驗為酶的定量實驗，因此，酶促反應(yīng)所要求的底物及酶的濃度、酶作用的條件及時間要求嚴(yán)格掌握，所加試劑量必須準(zhǔn)確。( 3)試管應(yīng)潔凈干燥，否則不僅會影響酶促反應(yīng)，而且會使鈉氏試劑呈色混濁。( 4)加奈氏試劑時應(yīng)迅速準(zhǔn)確，立即搖勻，馬上比色，否則容易混濁。實驗中加入酒石 酸鉀鈉，目的在于防止奈氏試劑混濁。(5)加入ZnSO科以吸附酶蛋白，起助濾作用。另外，ZnSO4起終止反應(yīng)的