學(xué)生開放實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、 化學(xué)化工與生命科學(xué)系生物化學(xué)開放實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（一）食用植物油脂酸價(jià)、碘價(jià)的測(cè)定 專業(yè)：xxxx班級(jí)：xxxxxx 小組長(zhǎng)：xx 小組成員：xxxxxxx 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)樓A403 實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2014年9月13日 指導(dǎo)老師：xx實(shí)驗(yàn)一 食用植物油脂酸價(jià)、碘價(jià)的測(cè)定1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）掌握測(cè)定食品植物油脂的主要常規(guī)指標(biāo)方法；（2）食用植物油脂的品質(zhì)可由測(cè)定其酸價(jià)、碘價(jià)等理化特性來(lái)判斷。2. 實(shí)驗(yàn)原理2.1酸價(jià)酸價(jià)（酸值）是指中和1.0g 油脂所含游離脂肪酸所需氫氧化鉀的毫克數(shù)。R-COOH + KOH R-COOK + H20酸價(jià)是反映油脂質(zhì)量的主要技術(shù)指標(biāo)之一，同一種植物油酸價(jià)越高，說(shuō)明其質(zhì)量

2、越差越不新鮮。測(cè)定酸價(jià)可以評(píng)定油脂品質(zhì)的好壞和貯藏方法是否恰當(dāng)。2.2碘價(jià)碘價(jià)是指在一定條件下與100g油脂起加成反應(yīng)所需碘的克數(shù)。測(cè)定碘價(jià)可以了解油脂脂肪酸的組成是否正常有無(wú)摻雜等。最常用的是氯化碘乙酸溶液法（韋氏法）。其原理：在溶劑中溶解試樣并加入韋氏碘液，氯化碘則與油脂中的不飽和脂肪酸起加成反應(yīng)：CH3CH=CHCOOH + ICl CH3CHI-CHClCOOH再加入過量的碘化鉀與剩余的氯化碘作用，生成游離碘：KI + ICl KCl + I2游離的碘可用硫代硫酸鈉溶液滴定:I2 + 2Na2S2O3 Na2S4O6 + 2NaI同時(shí)做空白試驗(yàn)，空白與試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液之差，從

3、而計(jì)算出被測(cè)樣品所吸收的氯化碘（以碘計(jì)）的克數(shù)，求出碘價(jià)。碘價(jià)大的油脂，說(shuō)明其組成中不飽和脂肪酸含量高或不飽和程度高。3. 儀器及材料3.1儀器碘量瓶 250mL；各種分析天平；堿式滴定管；錐形瓶 250mL；常用玻璃儀器。3.2試劑（1）酚酞指示劑（10g / L）：溶解1g 酚酞于90 mL（95%）乙醇與10 mL 水中。（2）氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液C（KOH）=0.05mol/L。（3）碘化鉀溶液（150g/L）：稱取15.0g 碘化鉀,加水溶解至100 mL,貯于棕色瓶中。（4）硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mol / L）：按GB601 配制與標(biāo)定。（5）韋氏碘液試劑：分別在兩個(gè)燒杯內(nèi)稱入三

4、氯化碘7.9g 和碘8.9g，加入冰醋酸，稍微加熱，使其溶解，冷卻后將兩溶液充分混合，然后加冰醋酸并定容至1000mL。（6）環(huán)己烷（分析純）。（7）冰乙酸（分析純）。（8）可溶性淀粉（分析純）。（9）氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05mol / L）的標(biāo)定：（按GB601 標(biāo)定或用標(biāo)準(zhǔn)酸標(biāo)定）。（10）中性乙醚乙醇（2+1）混合液：按乙醚乙醇（2+1）混合，以酚酞為指示劑，用所配的KOH 溶液中和至剛呈淡紅色，且30s 內(nèi)不退色為止。（11）淀粉指示劑（10g / L）配制：稱取可溶性淀粉0.50g，加少許水，調(diào)成糊狀，倒入50ml 沸水中調(diào)勻，煮沸至透明，冷卻。3.3 材料 食用植物油3.4注意事

5、項(xiàng)（1）測(cè)酸價(jià)，當(dāng)樣液顏色較深時(shí)，可減少試樣用量，或適當(dāng)增加混合溶劑的用量。（2）側(cè)碘價(jià)時(shí)，光線和水分對(duì)氯化鉀起作用，影響很大，要求所用儀器必須清潔，干燥，碘液試劑必須用棕色瓶盛裝且放于暗處。4. 實(shí)驗(yàn)步驟4.1 酸價(jià)的測(cè)定1） 稱取 3.00g5.00g 混勻的試樣，置于錐形瓶中，加入50mL 中性乙醚乙醇混合液，振搖使油溶解，必要時(shí)可置于熱水中，溫?zé)崾蛊淙芙猓?） 冷至室溫，加入酚酞指示劑2-3 滴，以氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，至初現(xiàn)微紅色，且0.5min 內(nèi)部退色為終點(diǎn)；3） 平行2次，空白1次，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。4.2碘價(jià)的測(cè)定1） 試樣的量根據(jù)估計(jì)的碘價(jià)而異（碘價(jià)高，油樣少；碘價(jià)低，油樣

6、多），本實(shí)驗(yàn)在0.120g-1.130g左右；2） 將稱好的試樣放入250mL 錐形瓶中，加入10mL 環(huán)己烷冰乙酸等體積混合液，溶解試樣；3） 準(zhǔn)確加入12.50mL 韋氏試劑，蓋好塞子，搖勻后放于暗處30min 以上（碘價(jià)低于150 的樣品，應(yīng)放1h；碘價(jià)高于150 的樣品，應(yīng)放2h）；4） 反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后，加入10mL 碘化鉀溶液(150/L)和75mL 水，用0.1mol / L 硫代硫酸鈉滴定至淺黃色，加幾滴淀粉指示劑繼續(xù)滴定至劇烈搖動(dòng)后藍(lán)色剛好消失；5） 在相同條件下，平行2次，空白1次。5.結(jié)果與分析5.1 酸價(jià)5.1.1計(jì)算公式式中：X試樣的酸價(jià)（以氫氧化鉀計(jì)），單位為毫克每克

7、（mg/g）；V試樣消耗氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位毫升（mL）；C氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)際濃度（mol/L）；m試樣質(zhì)量，單位為克（g）；56.11與1.0mL 氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液C（KOH）=1.000mol / L相當(dāng)?shù)臍溲趸浐量藬?shù)。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。5.1.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理 數(shù)據(jù)組號(hào)試樣質(zhì)量/g滴定前刻度/ml滴定后刻度/ml消耗KOH標(biāo)準(zhǔn)液體積/ml 13.96800.001.101.1024.04341.102.351.253（空白）02.353.000.65由第一組與空白組數(shù)據(jù)可計(jì)算酸價(jià)如下：由第二組與空白組數(shù)據(jù)可計(jì)算酸價(jià)如下：計(jì)算X1和X2平均值得此實(shí)驗(yàn)樣品的酸價(jià)為0.37m

8、g/g。5.2 碘價(jià)5.2.1計(jì)算公式式中：V1試樣消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2空白試劑消耗硫代硫酸鈉的體積，mL；C硫代硫酸鈉的實(shí)際濃度，mol / L；m試樣的質(zhì)量，g；0.12691/2 I2的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。5.2.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理 數(shù)據(jù)組號(hào)試樣質(zhì)量/g滴定前刻度/ml滴定后刻度/ml試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液體積/ml10.161.007.956.9520.139.1016.17.003（空白）016.5038.1521.65由第一組與空白組數(shù)據(jù)可計(jì)算碘價(jià)如下：由第二組與空白組數(shù)據(jù)可計(jì)算碘價(jià)如下：計(jì)算X1和X2平均值得此實(shí)驗(yàn)樣品的碘價(jià)為129.8mg/100g。

9、5.2.3實(shí)驗(yàn)圖片 使油脂溶解 滴加藥液6.討論與心得6.1思考題6.1.1 油脂中游離的脂肪酸與酸價(jià)有何關(guān)系？答： 油脂酸價(jià)的定義是中和1g油脂中的游離脂肪酸所需KOH的毫克數(shù)。油脂酸價(jià)越高，說(shuō)明樣品質(zhì)量越差，越不新鮮。故酸價(jià)是反應(yīng)油脂質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。其中，游離脂肪酸（%）=酸價(jià)×f（f：不同脂肪酸的換算系數(shù)，以食品中的主要脂肪酸計(jì)）。一般樣品以油酸計(jì)0.503 棕櫚油以軟脂酸計(jì)0.456，椰子油以月桂酸計(jì)0.356 菜子油以芥酸計(jì)0.602。6.1.2 哪些指標(biāo)可以表明油脂的特點(diǎn)？他們表明了油脂哪些方面的特點(diǎn)？答：油脂酸價(jià)：酸價(jià)（酸值）是指中和1.0g油脂所含游離脂肪酸所需氫

10、氧化鉀的毫克數(shù)。酸價(jià)是反映油脂質(zhì)量的主要技術(shù)指標(biāo)之一，同一種植物油酸價(jià)越高，說(shuō)明其質(zhì)量越差越不新鮮。測(cè)定酸價(jià)可以評(píng)定油脂品質(zhì)的好壞和貯藏方法是否恰當(dāng)。碘價(jià)：測(cè)定碘價(jià)可以了解油脂脂肪酸的組成是否正常有無(wú)摻雜等。最常用的是氯化碘乙酸溶液法（韋氏法）。其原理：在溶劑中溶解試樣并加入韋氏碘液，氯化碘則與油脂中的不飽和脂肪酸起加成反應(yīng)，游離的碘可用硫代硫酸鈉溶液滴定，從而計(jì)算出被測(cè)樣品所吸收的氯化碘（以碘計(jì)）的克數(shù)，求出碘價(jià)。過氧化值：檢測(cè)油脂中是否存在過氧化值，以及含量的大小，即可判斷油脂是否新鮮和酸敗的程度。常用滴定法，其原理：油脂氧化過程中產(chǎn)生過氧化物，與碘化鉀作用，生成游離碘，以硫代硫酸鈉溶液滴

11、定，計(jì)算含量。羰基價(jià)：常用比色法測(cè)定總羰基價(jià)，其原理：羰基化合物和2，4二硝基苯胺的反應(yīng)產(chǎn)物，在堿性溶液中形成褐紅色或酒紅色，在440nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度，可計(jì)算出油樣中的總羰基價(jià)。中國(guó)食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：羰基價(jià)20 mmol/kg。6.2實(shí)驗(yàn)心得本次實(shí)驗(yàn)總體來(lái)說(shuō)進(jìn)行的還是比較順利的，而且我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)際值也相差不大，實(shí)驗(yàn)中遇到的一些問題也處理的較妥當(dāng)。指導(dǎo)教師建議： 1、 2、 化學(xué)化工與生命科學(xué)系生物化學(xué)開放實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（二）糖類的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)-糖類的顏色反應(yīng)和 還原作用 專業(yè)：xxxx班級(jí)：xxxx 小組長(zhǎng)：xx 小組成員：xxxxxx 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)樓A403 實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2014

12、年9月21日 指導(dǎo)老師：xx實(shí)驗(yàn)二糖類的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)-糖類的顏色反應(yīng)一、目的1了解糖類某些顏色反應(yīng)的原理。2學(xué)習(xí)應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類的方法。二、顏色反應(yīng)（一）-萘酚反應(yīng)（Molisch反應(yīng)）。1原理 糖在濃無(wú)機(jī)酸（硫酸、鹽酸）作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能與-萘酚生成紫紅色物質(zhì)。因?yàn)榭啡┘翱啡┭苌飳?duì)此反應(yīng)均呈陽(yáng)性，故此反應(yīng)不是糖類的特異反應(yīng)。2器材（1）試管及試管架（2）滴管3試劑（1）莫氏（ Molisch）試劑： 5 -萘酚的酒精溶液1500mL稱取-萘酚5g，溶于95酒精中，總體積達(dá)100mL，貯于棕色瓶?jī)?nèi)。用前配制。（2）1葡萄糖溶液 100mL（3）1果糖溶液 100mL

13、（4）1蔗糖溶液 100mL（5）1淀粉溶液 100mL（6）0.1糠醛溶液 100mL（7）濃硫酸 500mL4操作取5支試管，分別加入1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液、1淀粉溶液、 0.1糠醛溶液各 1mL。再向5支試管中各加入2滴莫氏試劑，充分混合。斜執(zhí)試管，沿管壁慢慢加入濃硫酸約1mL，慢慢立起試管，切勿搖動(dòng)。濃硫酸在試液下形成兩層。在二液分界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn)。觀察、記錄各管顏色。（二）間苯二酚反應(yīng)（Seliwanoff反應(yīng)）1原理在酸作用下，酮糖脫水生成羥甲基糠醛，后者再與間苯二酚作用生成紅色物質(zhì)。此反應(yīng)是酮糖的特異反應(yīng)。醛糖在同樣條件下呈色反應(yīng)緩慢，只有在糖濃度較高或煮沸時(shí)間較

14、長(zhǎng)時(shí)，才呈微弱的陽(yáng)性反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)條件下蔗糖有可能水解而呈陽(yáng)性反應(yīng)。2器材（1）試管及試管架（2）水浴鍋3試劑（1）塞氏（Seliwanoff）試劑 0.05間苯二酚-鹽酸溶液 1000 mL稱取間苯二酚0.05 g溶于30 mL濃鹽酸中，再用蒸餾水稀釋至100 mL（2）1葡萄糖溶液 100mL（3）1果糖溶液 100mL（4）1蔗糖溶液 100mL4操作取3支試管，分別加入1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液各0.5 mL。再向各管分別加入塞氏試劑 5 mL，混勻。將3支試管同時(shí)放入沸水浴中，注意觀察、記錄各管顏色的變化及變化時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1） -萘酚反應(yīng)：試劑現(xiàn)象1%葡萄糖溶液分層；無(wú)

15、色1%果糖溶液分層；維紫紅1%蔗糖溶液分層；顏色不分明1%淀粉溶液分層0.1%糖醛溶液分層；紫紅（2） 間苯二酚反應(yīng)：試劑水浴5min；5ml塞氏試劑水浴10min；5ml塞氏試劑水浴5min；10ml塞氏試劑1%葡萄糖溶液無(wú)無(wú)無(wú)1%果糖溶液微紅磚紅無(wú)1%蔗糖溶液無(wú)無(wú)無(wú)思考題可用何種顏色反應(yīng)鑒別酮糖的存在？ 多羥基酮稱為酮糖，如二羥丙酮、赤蘚酮糖、木酮糖、果糖、景天庚酮糖等都是天然存在的酮糖，酮糖都是碳上有羥基的酮。醛糖和酮糖具有醇羥基和羰基的性質(zhì)，都是還原糖，因?yàn)橥欠肿觾?nèi)雖然無(wú)醛基，但其羰基受相鄰碳原子上羥基的影響，而呈現(xiàn)出還原活性。兩者的鑒別：(1)西利萬(wàn)諾夫試驗(yàn)(Seliwanofs

16、test)，間苯二酚于鹽酸中與酮糖反應(yīng)呈紅色，而醛糖呈色很淺；(2)弱氧化劑，如溴水可將醛糖氧化成相應(yīng)的糖酸，而對(duì)酮糖則無(wú)氧化作用。糖類的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)-糖類的還原作用一、目的學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定糖類還原性的方法及其原理。二、原理許多糖類由于其分子中含有自由的或潛在的醛基或酮基，故在堿性溶液中能將銅、鉍、汞、鐵、銀等金屬離子還原，同時(shí)糖類本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類這種性質(zhì)常被利用于檢測(cè)糖的還原性及還原糖的定量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行糖類的還原作用所用的試劑為斐林試劑和本尼迪克特試劑。它們都是含Cu2+的堿性溶液，能使還原糖氧化而本身被還原成紅色或黃色的Cu2O沉淀。生成Cu2O沉淀的顏色之所以不同是由于

17、在不同條件下產(chǎn)生的沉淀顆粒大小不同引起的，顆粒越小呈黃色，越大則呈紅色。如有保護(hù)性膠體存在時(shí)，常生成黃色沉淀。三、器材1試管及試管架2竹試管夾3水浴鍋4電爐四、試劑1斐林（Fehling）試劑 1000mL甲液（硫酸酮溶液）：稱取34.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶于500 mL蒸餾水中。乙液（堿性酒石酸鹽溶液）：稱取125 g氫氧化鈉和137 g灑石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中。為了避免變質(zhì)，甲、乙二液分開保存。用前，將甲、乙二液等量混合即可。2本尼迪克特（Benedict）試劑1000 mL稱取檸檬酸鈉173 g及碳酸鈉（Na2CO3·H2O）100 g加入6

18、00 mL蒸餾水中，加熱使其溶解，冷卻，稀釋至850 mL。另稱取17.3 g硫酸銅溶解于 100 mL熱蒸餾水中，冷卻，稀釋至150mL。最后，將硫酸銅溶液徐徐地加入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，混勻，如有沉淀，過濾后貯于試劑瓶中可長(zhǎng)期使用。五、操作先取1支試管加入斐林試劑約 1mL，再加入4 mL蒸餾水，加熱煮沸，如有沉淀生成，說(shuō)明此試劑已不能使用。經(jīng)檢驗(yàn)，試劑合格后，再進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。取5支試管，分別加入2 mL斐林試劑，再向各試管分別加入1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液、1麥芽糖溶液、1淀粉溶液各1mL。置沸水浴中加熱數(shù)分鐘，取出，冷卻。觀察各管溶液的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 斐林試劑

19、是一種弱氧化劑，如果是還原性糖就可以和斐林試劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)，會(huì)看到磚紅色氧化亞銅沉淀生成，本尼迪克特試劑，就是班氏試劑，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和斐林試劑一樣，二者的主要成分都是氫氧化銅，前者不穩(wěn)定，后者穩(wěn)定性好。實(shí)驗(yàn)圖片： 對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行提取 實(shí)驗(yàn)顏色鑒定 稱量實(shí)驗(yàn)材料 加入本尼迪克特試劑后顏色對(duì)照 實(shí)驗(yàn)三考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量一、試驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理及操作2. 學(xué)習(xí)利用染色方法提高蛋白質(zhì)消光系數(shù)，以提高分光光度法檢測(cè)靈敏度 二、基本原理1. 根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜進(jìn)行定性或定量分析的方法稱為吸收光譜法或分光光度法 。該法所用的儀器稱為分光光度計(jì)或吸收光譜儀。該法所使用的光譜范圍

20、包括可見光和紫外光，即包括波長(zhǎng)在200 - 800 nm之間的光。2. 分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。 3.紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠(yuǎn)紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm波長(zhǎng)的光，因此常規(guī)紫外測(cè)定集中在近紫外區(qū)，即 200nm-400nm。可見光區(qū)為400nm -800nm。4.考馬斯亮藍(lán)G250法原理：考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其最大吸收波長(zhǎng)從465nm改變?yōu)?95nm,該蛋白染料復(fù)合物吸光系數(shù)很高，所以檢測(cè)靈敏度很高，可以測(cè)定1g /mL

21、的蛋白質(zhì)，染料和蛋白結(jié)合只需要2分鐘，顏色在1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。操作簡(jiǎn)便，快速，是常用的蛋白含量測(cè)定方法之一。去污劑，粘多糖等嚴(yán)重干擾該方法的測(cè)定三、試劑1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液2. 考馬斯亮藍(lán)G250蛋白染色劑：四、操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 取6只試管，分別加入濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.1ml，然后加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，震蕩混勻，2分鐘后于595nm測(cè)定吸光值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品測(cè)定： 樣品液0.1mL , 然后加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，震蕩混勻，2分鐘后于595nm

22、測(cè)定吸光值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度。五、試驗(yàn)結(jié)果1.數(shù)據(jù)記錄標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度mg/ml00.1020.30.40.5C吸光度A00.0210.0370.0560.0700.1070.0172.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3.樣品的測(cè)定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以找出樣品對(duì)應(yīng)的點(diǎn)（0.085，0.017），所以樣品的濃度為0.085mg/ml。實(shí)驗(yàn)圖片： 提取實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料 各類實(shí)驗(yàn)材料提取液對(duì)照注意事項(xiàng)：1.分光光度計(jì)必須放置在固定而且不受震動(dòng)的儀器臺(tái)上，不能隨意搬動(dòng)。嚴(yán)防震動(dòng)、潮濕和強(qiáng)光直射。2.盛待測(cè)液時(shí)，必須達(dá)到比色杯2/3左右，不宜過多。若不慎使溶液流出比色杯外面，必須先用濾紙吸干，再用擦鏡紙或綢布擦

23、凈才能放入比色杯槽內(nèi)。移動(dòng)比色杯槽要輕，以防溶液濺出，腐蝕機(jī)件。3.千萬(wàn)不可用手、濾紙、毛刷等物摩擦比色杯光滑面。4.用完比色杯后應(yīng)立即用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水洗凈。5.每套分光光度計(jì)上的比色杯及比色槽不能隨意更換。實(shí)驗(yàn)四氨基酸纖維素薄層層析一、目的學(xué)習(xí)纖維素薄層層析的操作方法，掌握分配層析的原理。二、原理以纖維素作為支持物，把它均勻地涂布在玻璃板上成一薄層，然后在此薄層上進(jìn)行層析即為纖維素薄層層析。纖維素是一種惰性支持物，它與水有較強(qiáng)的親和力而與有機(jī)溶劑親和力較弱。層析時(shí)吸著在纖維素上的水是固定相，而展層溶劑是流動(dòng)相。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開。

24、三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)材料綠豆芽或萌發(fā)小麥種子2儀器燒杯50mL×1；玻璃板5 cm×20cm×1；層析缸；毛細(xì)管；噴霧器；研缽。3試劑標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：絲氨酸、色氨酸、亮氨酸，分別以0.01mol/L 鹽酸配成4mg/mL 的溶液。纖維素粉（層析用）或微晶型纖維素（層析用）；羧甲基纖維素鈉（CMC）。層析溶劑系統(tǒng)：正丁醇（分析純）冰醋酸（分析純）水411（V/V）。顯色劑：0.1茚三酮-丙酮溶液。四、操作步驟1氨基酸的提取取已萌發(fā)好的小麥種子2g（或綠豆芽下胚軸2g），放入研缽中，加95乙醇4mL 及少量的石英砂，研成勻漿后，倒入離心管中離心3 000r/

25、min、15min，上清液即為氨基酸提取液，用滴管小心吸入點(diǎn)樣瓶中備用。2制板取少量羧甲基纖維素鈉（約12mg），置研缽中充分研磨，再稱取纖維素粉3g 于研缽中研磨，再加入14mL 水研磨勻漿，把纖維素勻漿倒在洗凈烘干的玻璃板上，輕輕震動(dòng)，使纖維素均勻分布在玻璃板上，水平放置風(fēng)干，用前放入100110烘箱中活化30min。此處羧甲基纖維素鈉是起粘合劑作用，它使纖維素粉能較牢固地粘附于玻璃板上，加入量過多會(huì)破壞纖維素薄層的毛細(xì)作用而使層析速度延緩，加的量過少則粘合不牢固，因此需要注意加量控制。3點(diǎn)樣用刀片將薄層板上薄層的左右各邊刮削掉0.5cm，以防止“邊緣效應(yīng)”。在纖維素薄板上距一端15mm

26、處，用鉛筆輕輕劃出點(diǎn)樣記號(hào)。樣點(diǎn)之間距離1.3cm。用毛細(xì)管吸取樣品，在記號(hào)處點(diǎn)樣，樣品斑點(diǎn)直徑控制在2mm 左右。4展層將薄板有樣品的一端浸入已存放展層溶劑的層析缸中，層析溶劑液面不能高于樣品線。待展層溶劑走到距薄板頂端0.51cm 時(shí)取出此薄板（約12h），用鉛筆在前沿處作一記號(hào)后用電吹風(fēng)吹干。5顯色將茚三酮顯色劑噴霧在板上，用熱吹風(fēng)吹數(shù)分鐘，（或置于7080烘箱中烘干）即可觀察到紫紅色的氨基酸斑點(diǎn)，脯氨酸例外，為黃色斑點(diǎn)。用鉛筆圈出氨基酸斑點(diǎn)，量出溶劑前沿的距離及各斑點(diǎn)中心與起點(diǎn)之間的距離，并計(jì)算各氨基酸的Rf 值。Rf 值為遷移率（rate of flow, Rf），在恒定條件下，每種

27、氨基酸有其一定的Rf 值。根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和Rf 值，與小麥（或綠豆芽）提取液中氨基酸的Rf 值比較，確定提取液中含有哪些種氨基酸。五、附 注1在操作過程中，手必須洗凈，只能接觸薄板上層邊角；不能對(duì)著薄板說(shuō)話，以防唾液掉在板上。2配制展層劑時(shí)，要用純?nèi)軇?，?yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，以免放置過久其成分發(fā)生變化（酯化）。六、思考題1什么是分配系數(shù)？分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值。在層析條件確定后分配系數(shù)是一常數(shù)，以K 表示分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時(shí)受溫度、壓力的影響。所以不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同。而在恒溫恒壓條件下，某物質(zhì)在確定的層析系統(tǒng)中的分配

28、系數(shù)為一常數(shù)。2薄層層析中極性氨基酸與非極性氨基酸展層的速度哪個(gè)快一些？層析的分離是基于氨基酸的非極性性質(zhì)。物質(zhì)的極性越?。捶菢O性越大），在有機(jī)溶劑中分配就越多，遷移率就越大；反之物質(zhì)的極性越大，遷移率越小。所以非極性氨基酸在有機(jī)溶劑中展層的速度快于極性氨基酸3何為“邊緣效應(yīng)”？如何減輕或消除？。 在用多元系統(tǒng)進(jìn)行展層時(shí)，其中極性較弱的和沸點(diǎn)較低的溶劑（例如氯仿-甲醇系統(tǒng)中的氯仿）在薄層板的兩邊易揮發(fā)，因此，它們?cè)诒觾蛇叺臐舛缺仍谥胁康臐舛刃。簿褪钦f(shuō)在薄層的兩邊比中部含有更多的極性較大或沸點(diǎn)較高的溶劑，于是位于薄層兩邊的Rf 值要比中間的高，即所謂“邊緣效應(yīng)”。為減輕或消除邊緣效應(yīng)，可在層析缸的內(nèi)壁貼上浸濕了展開劑的濾紙，使層析缸內(nèi)溶劑蒸汽的飽和程度增加。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖片）： 樣本薄板層析 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸薄板層析（對(duì)照）實(shí)驗(yàn)五過氧化物酶活性的測(cè)定POD一、原理：過氧化