奶粉中阪崎腸桿菌分離株表型特征分類

1、奶粉中阪崎腸桿菌分離株表型特征分類 阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)屬于腸桿菌屬的1個新種1。本文采用目前應(yīng)用最廣、在微生物鑒定方面得到公認的腸桿菌科細菌生化鑒定試劑(API20E)分析了阪崎腸桿菌的生化反應(yīng)特性，并利用陰溝腸桿菌噬菌體進行裂解試驗測定了阪崎腸桿菌的易感性，對奶粉中18株阪崎腸桿菌分離株和4株美國典型菌種保藏中心(ATCC)參考菌株進行了表型分類。旨在對奶粉中阪崎腸桿菌分離株的表型特征進行分類，以便準確地對其鑒別。現(xiàn)報告如下。1 材料與方法11 材料 (1)標準菌株：阪崎腸桿菌ATCC29544，ATCC29004，ATCC51329，ATCC1286

2、8。(2)阪崎腸桿菌分離株：分離自國內(nèi)市場奶粉抽查樣品，共18株。經(jīng)AP120E和英國熒光快速微生物鑒定藥敏分析儀，2種系統(tǒng)對阪崎腸桿菌的鑒定概率()。檢驗檢疫菌種保藏中心(IQCC)10403-1(984，9848)；10403-2(98，9489)；10403-3(984，9995)；10403-4(984，9230)；10403-5(98，9237)；10403-6(98，9935)；10403-7(984，993)；10403-8(984，9796)；10403-9(98，9726)；10403-10(984，9596)；10403-11(98，996)；10403-12(984，99

3、26)；10403-13(98，9926)；10403-14(98，100)；10403-16(984，9951)；10403-17(98，9822)；10403-18(98，9935)；10403-23(98，996)。(3)試劑與培養(yǎng)基：腦心浸液肉湯(BHI)(美國Difico公司)；胰酪胨大豆胨瓊脂(TSA)、營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋公司)；API20E(法國生物梅里埃公司)；陰溝腸桿菌噬菌體(廣州虎克生物技術(shù)有限公司)。12 方法121 菌株培養(yǎng) 將每株參考菌株和分離菌株分別接種于滅菌BHI肉湯，36培養(yǎng)24h，再接種于TSA斜面，36培養(yǎng)24h，作為儲備菌株，試驗時從儲備菌株用接種環(huán)接種于

4、營養(yǎng)瓊脂，劃線分離37培養(yǎng)24h形成單菌落。122 阪崎腸桿菌的生化特征及噬菌體裂解實驗 API20E實驗：將試驗菌株，按照API20E使用說明進行操作，36培養(yǎng)2224h后，按照說明書滴加相關(guān)試劑，觀察和記錄結(jié)果。噬菌體裂解實驗：接種針輕點生長于營養(yǎng)瓊脂上的單個純菌落，通過管壁研磨使其均勻分散在2ml普通肉湯中，約100CFUml，取1接種環(huán)(約100l)菌懸液涂布于經(jīng)過預(yù)處理(90mm，20ml，放4244恒溫箱30min使表面干燥)的營養(yǎng)瓊脂表面，干燥(同前)，取100l陰溝腸桿菌噬菌體滴加于營養(yǎng)瓊脂表面，36培養(yǎng)2224h，觀察裂解結(jié)果，以融合裂解、不完全裂解和不裂解記錄實驗結(jié)果。12

5、3 阪崎腸桿菌的表型特征分類 以ATCC參考菌株在API20E上反應(yīng)的生化特征為生物1型，對于阪崎腸桿菌分離株，去掉相同的生化反應(yīng)，保留不一致的生化反應(yīng)項目進行分析，每1種與參考菌株不同的生化特性為1種新的表型。2 結(jié)果21 API20E測定結(jié)果 API20E共有21項生化反應(yīng)，主要區(qū)別在于伏-普試驗(VP)、肌醇和山梨醇方面，4株ATCC參考菌株生化反應(yīng)一致，鑒定數(shù)值為3305373，7株分離株與參考菌株一致(389)，將參考菌株的表型特征定義為生物1型，按照伯杰氏細菌手冊分類方法2，VP、肌醇、山梨醇分別為+、+、-，與生物1型相比，肌醇陰性為3株，比例為167，為生物2型；VP陰性9株，

6、比例為50，為生物3型；山梨醇陽性2株，比例為111，為生物4型；尿素陽性，1株，比例為5，為生物5型；精氨酸陰性1株，比例為5，為生物6型。22 陰溝腸桿菌噬菌體裂解實驗 4株ATCC阪崎腸桿菌參考菌株和18株分離菌株經(jīng)陰溝腸桿菌噬菌體裂解實驗，1株分離株被融合裂解，編號為IQCC10403-18，1株為不完全裂解，編號為IQCCl0403-13。3 討論1999年，Nazarowec-white和Farber對臨床和食品中分離到的17株阪崎腸桿菌以及1株ATCC29544進行了表型特征分類3，以ATCC29544參考菌株表型反應(yīng)作為生物1型，與該生化反應(yīng)模式比較，山梨醇陽性反應(yīng)株列為生物2

7、型，VP陰性為生物3型。 本實驗采用此方法，對22株(包括4株ATCC參考菌株)進行分析，但實驗結(jié)果存在差異。首先，ATCC參考菌株反應(yīng)數(shù)值為3305373，而不是3304373，也即差異在VP實驗。本實驗4株參考菌株VP反應(yīng)均為陽性，經(jīng)典考夫曼方法重復(fù)實驗結(jié)果也為陽性，伯杰氏手冊中阪崎腸桿菌的VP反應(yīng)陽性率為90%1002，臨床微生物學(xué)手冊為904。但本實驗的分離株VP陽性率為50，這可能與VP實驗結(jié)果判斷臨界點有關(guān)。本實驗之所以進行陰溝腸桿菌噬菌體裂解實驗，是因為阪崎腸桿菌在1984年前屬于陰溝腸桿菌，包括參考菌株在內(nèi)的22株菌，有2株分離株能被陰溝腸桿菌噬菌體裂解，這2株均產(chǎn)黃色素，AP

8、I20E鑒定為阪崎腸桿菌的概率為98，英國先德熒光快速微生物鑒定藥敏分析儀鑒定為阪崎腸桿菌的概率>99。此外，還出現(xiàn)尿素反應(yīng)陽性和精氨酸反應(yīng)陰性的阪崎腸桿菌菌株，在對阪崎腸桿菌的鑒別中值得注意。【參考文獻】 1 Joshua B Gurtler,Jeffrey L Kornacki,Larry R Beuchat.Enterobacter sakazakii:A coliform of increased concern to infant healthJ.International Journal ofFood Microbiology,2005,104(1):1-34.2 李蓉，徐迪誠.微生物分類和鑒定技術(shù)進展M.上海：光明日報出版社，1989：39-46.3 M,Nazarowec-white,JM Farber.Phenitypic and genotypic typing of food and clinical i