黃曲霉毒素及其檢測方法整體解決方案

1、黃曲霉毒素及其檢測方法整體解決方案 一、黃曲霉毒素介紹 黃曲霉毒素(aflatoxin，簡稱為AF)是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素。它可通過多種途徑污染食品和飼料，直接或間接進(jìn)入人類食物鏈，威脅人類健康和生命安全，對人體及動物內(nèi)臟器官尤其是肝臟損害嚴(yán)重，該毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中。黃曲霉毒素比較耐熱，加熱至230才能被完全破壞，因此一般烹飪加工也不易消除。 二、黃曲霉毒素對人體的危害 1、 引起急、慢性中毒： 黃曲霉毒素是劇毒物質(zhì)，其毒性相當(dāng)于氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。黃曲霉毒素屬肝臟毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝臟蛋

2、白質(zhì)的合成，黃曲霉毒索引起人類的急性中毒事件，國內(nèi)外均有許多報(bào)導(dǎo)，最典型的是印度的霉變玉米事件，該事件直接導(dǎo)致了數(shù)十人喪生，數(shù)百人患上不同類型的肝臟疾病。 2、 致癌性： 黃曲霉毒素有極強(qiáng)的致癌性，長期攝入黃曲霉毒素會誘發(fā)肝癌。它誘發(fā)肝癌的能力比二甲基亞硝胺大75倍，是目前公認(rèn)的致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一。另據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)導(dǎo)，黃曲霉毒素含量在3050ug/kg時(shí)為低毒，50100ug/kg時(shí)為中毒，1001000ug/kg時(shí)為高毒，1000ug/kg以上為極毒。鑒于黃曲霉毒素對人類的巨大危害性，我國對其在食品中的含量作了嚴(yán)格規(guī)定，其中，乳制品中黃曲霉毒素最高允許量為5ug/kg（即5ppb）。三、

3、黃曲霉毒素的種類 黃曲霉毒素主要有4種：即B1、B2、G1、G2，其中B1被認(rèn)為是主要的有毒物質(zhì)，有2種這些毒素的代謝產(chǎn)物M1和M2。其中黃曲霉毒素B1主要存在于農(nóng)產(chǎn)品，動物飼料，中藥等產(chǎn)品中；黃曲霉毒素M1是動物攝入黃曲霉毒素B1后在體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，一部分從尿和乳汁排出，一部分存在于動物的可食部分，如乳、肝、蛋類、腎、血和肌肉中，其中以乳最為常見。黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1的基本相似。由于牛乳及其制品是人類、特別是嬰兒的主要食品，所以其危害性更大。 四、最新政策及國標(biāo)（含國外一些政策） 1、 自2003年8月1日起，凡在我國境內(nèi)從事米、面、油、醬油、醋生產(chǎn)加工的企業(yè)

4、，其產(chǎn)品須經(jīng)檢驗(yàn)合格后方可上市。國家質(zhì)檢總局發(fā)布的關(guān)于印發(fā)小麥粉等5類食品生產(chǎn)許可證實(shí)施細(xì)則的通知中明確規(guī)定，黃曲霉毒素B1必須檢測。 2、 在第八期中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公報(bào)中發(fā)布關(guān)于黃曲霉毒素檢測方法的最新國標(biāo)： （1）、GB/T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層凈化高效液相色譜法和熒光光度法 （2）、GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定免疫親和層凈化高效液相色譜法和熒光光度法 以上兩項(xiàng)國標(biāo)均在2003年8月1日開始實(shí)施 3、2002年2月4日歐盟決議對從中國進(jìn)口或委托從中國進(jìn)口的花生和花生制品實(shí)施黃曲霉毒素強(qiáng)制性檢測的特殊條

5、件 五、中國及國際上對黃曲霉毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn) 1、主要國家： 品名 中國標(biāo)準(zhǔn) 美國標(biāo)準(zhǔn) 歐盟 玉米、花生、花生油，堅(jiān)果和干果（核桃、杏仁） 20g/kg (ppb) 20g/kg (ppb) 2、4、5、8、10、15g/kg (ppb) 玉米及花生仁制品（按原料折算） 20 g/kg (ppb) 20g/kg (ppb) 2、4、5、8、10、15g/kg (ppb) 大米、其它食用油（香油、菜子油、大豆油、葵花油、胡麻油、茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油） 10 g/kg (ppb) 10g/kg (ppb) 2、4g/kg (ppb) 其它糧食（麥類、面粉、薯干）、發(fā)酵食品（醬油、食

6、用醋、豆豉、腐乳制品）、淀粉類制品（糕點(diǎn)、餅干、面包、裱花蛋糕） 5g/kg (ppb) 5g/kg (ppb) 不得檢出 牛乳及其制品（消毒牛乳、新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、淡煉乳、甜煉乳、奶油）、黃油、新鮮豬組織（肝、腎、血、瘦肉） 0.5g/kg (ppb) 0.5g/kg (ppb) 0.05g/kg (ppb) 2、其他 (1)、WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)。國際衛(wèi)生組織(WHO)/世界糧農(nóng)組織所屬的食品法典委員會(CAC)推薦食品、飼料中黃曲霉毒素最大允許量標(biāo)準(zhǔn)為總量(B1+B2+G1+G2)小于15g/kg；牛奶中M1的最大允許量為05g/kg (2)、南非標(biāo)準(zhǔn)。1990頒布了黃曲霉毒素的最大

7、允許標(biāo)準(zhǔn)：食品中黃曲霉毒素總量小于10g/kg，其中黃曲霉毒素B1小于5g/kg。 (3)、其他標(biāo)準(zhǔn)。印度標(biāo)準(zhǔn)是花生中黃曲霉毒素B1小于30g/kg；越南和阿根廷的標(biāo)準(zhǔn)為黃曲霉毒素B1小于20g/kg。 六、黃曲霉毒素檢測方法 測定黃曲霉毒素測定的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、質(zhì)譜法、放射免疫測定法。這些方法中，國標(biāo)方法“免疫親和柱法”是現(xiàn)在國際公認(rèn)的比較經(jīng)濟(jì)有效的分析方法。有著較好的權(quán)威性和通用性，且為國外多個(gè)組織認(rèn)可，被列為標(biāo)準(zhǔn)方法，如： 美國公職分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC） 美國農(nóng)業(yè)部聯(lián)邦谷物檢測中心（FGIS） 國際純粹與應(yīng)用化學(xué)協(xié)會（IUPAC） 美國食品藥品行

8、政署（US-FDA） 美國農(nóng)業(yè)部（USDA） 同時(shí)在國內(nèi)被認(rèn)證的機(jī)構(gòu)： 中國出入境檢驗(yàn)檢疫局（CIQ）七、黃曲霉毒素檢測“免疫親和柱法”方法有以下特點(diǎn)： 1、 認(rèn)證機(jī)構(gòu)廣泛，通用性強(qiáng)2、 分析速度快，一個(gè)樣品只需10-15分鐘，其他傳統(tǒng)的方法要做到定量分析需要幾小時(shí)至幾天的時(shí)間。 3、 靈敏度高，測定范圍廣泛（0-300ppb）,用熒光計(jì)可以測定0.1ppb的黃曲霉毒素四種異構(gòu)體，用HPLC可以檢測出10ppt的黃曲霉毒素B1。 4、 采用單克隆免疫技術(shù)，可以特效性地將黃曲霉毒素和其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高，正確性和可靠性強(qiáng)。 八、黃曲霉毒素檢測“免疫親和柱法”方法具體步驟如下：

9、 1、試劑配制 （1）樣品提取溶劑：甲醇/水（4/1，v/v）（2）5mmol磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（pH7.2）母液配制：1）稱取50.14gNa2HPO4.12H2O溶解于700ml水中。2）稱取9.66gNaH2PO4.H2O溶解于350ml水中。3）將上述兩種溶液進(jìn)行混合并加入42.5gNaCl，配制成pH7.2 5mmol磷酸鹽緩沖溶液（3）1mmol磷酸鹽緩沖溶液(PBS)（pH7.2）工作液配制：取200ml 的5mmol磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）稀釋于800ml水中。（4）磷酸鹽緩沖溶液（PBS）/吐溫(Tween)配制：取8ml吐溫-20稀釋于92mlpH7.2磷酸鹽緩沖

10、溶液中（5）HPLC 流動相配制： 水/甲醇/乙腈（60/30/15,v/v）2、樣品處理方法：方法一：標(biāo)準(zhǔn)方法 該處理程序適用于樣品基質(zhì)中沒有干擾，主要適用于大多數(shù)谷類樣品的處理。1、取20g樣品加入100ml提取液（甲醇/水，4/1，v/v）放入勻漿機(jī)中，并高速攪拌5分鐘。2、用濾紙過濾上述提取液3、取14ml過濾后的提取液加入86ml的1mmolPBS緩沖溶液（pH 7.2）。如果樣品量比較少，取樣品體積可以適當(dāng)減少（如1.4ml+8.6ml緩沖溶液）。如混合過程中有沉淀產(chǎn)生，樣品需要用注射過濾器進(jìn)行過濾或進(jìn)行離心。4、打開凈化柱上密封蓋和下面堵頭后，柱中的緩沖溶液會排出，直到緩沖溶液液

11、面達(dá)到柱中填料上層處。5、取5-50ml稀釋后的提取液（取樣體積根據(jù)分析方法的靈敏度來確定）上AflaCLEANTM柱。在凈化過程中可對柱子進(jìn)行抽真空和加壓；但必須保證過柱流速不大于1-2滴/秒。盡量讓所有上樣樣品都通過柱子流出來，即使柱中溶劑流干了也沒有太大問題，但是要避免柱子溶劑完全流干。6、用10ml蒸餾水或純化水清洗柱子7、用氣體吹掃或抽真空除去柱子中殘余的水8、每次用1ml甲醇洗脫柱子，可洗2次。第一次加入的甲醇需用堵頭堵住柱子下端，使甲醇在凈化柱中保持5min后，再放出收集。9、根據(jù)分析的需要對洗脫液進(jìn)行稀釋或濃縮并直接進(jìn)行HPLC分析。方法二：標(biāo)準(zhǔn)方法加正己烷分層 該樣品處理方法

12、針對樣品中含有油脂比較多，如堅(jiān)果類，一些香料或無花果醬，脂肪和樣品中含有一些需要用正己烷去除的雜質(zhì)。1、 稱取20g樣品并加入2g的氯化鈉2、 加入100ml提取溶劑（甲醇/水，4/1，v/v）和50ml正己烷于勻漿機(jī)中高速攪拌5min。3、 靜止分層，取下層液進(jìn)行下一步處理4、 取下層液用濾紙過濾5、 取14ml過濾后的提取液加入86ml 的1mmolPBS緩沖溶液（pH 7.2）。如果樣品量比較少，取樣品體積可以適當(dāng)減少（如1.4ml+8.6ml緩沖溶液）。如混合過程中有沉淀產(chǎn)生，上柱液需要用注射過濾器進(jìn)行過濾或進(jìn)行離心。6、 打開凈化柱上端密封蓋和下端堵頭后，柱中的緩沖溶液會排出，直到緩

13、沖溶液液面達(dá)到柱中填料上層處。7、 取5-50ml稀釋后的提取液（取樣體積根據(jù)分析方法的靈敏度來確定）上AflaCLEANTM柱。在凈化過程中可對柱子進(jìn)行抽真空和加壓；但必須保證過柱流速不大于1-2滴/秒。盡量讓所有上樣樣品都通過柱子流出來，即使柱中溶劑流干了也沒有太大問題，但是要避免柱子完全溶劑流干。8、 用10ml蒸餾水或純化水清洗柱子9、 用氣體吹掃或抽真空除去柱子中殘余的水10、 每次用1ml甲醇洗脫柱子，可洗2次。第一次加入的甲醇需用堵頭堵住柱子下端，使甲醇在凈化柱中保持5min后，再放出收集。11、 根據(jù)分析的需要對洗脫液進(jìn)行稀釋或濃縮并直接進(jìn)行HPLC分析。方法三：標(biāo)準(zhǔn)方法加正己

14、烷分層和PBS/Tween稀釋 該處理過程用于樣品含有干擾雜質(zhì)，主要是大部分的香料和中草藥。1、 此處理過程樣品最大取樣量為20g（一些樣品需要減少取樣量可以達(dá)到比較好的提取效果）。2、 稱取20g樣品并加入2g氯化鈉3、 樣品先進(jìn)行均質(zhì)化處理，向處理好的樣品中加入100ml提取溶劑（甲醇/水，4/1，v/v）和50ml正己烷于勻漿機(jī)中并高速攪拌5min。4、 提取液靜止分層，取下層溶液進(jìn)行下一步處理5、 取下層溶液用濾紙過濾6、 取5ml濾液加入35mlPBS/Tween溶液稀釋。如稀釋混勻中出現(xiàn)沉淀，需用注射過濾器進(jìn)行過濾或離心。7、 打開凈化柱上端密封蓋和下端堵頭后，柱中的緩沖溶液會排出

15、，直到緩沖溶液液面達(dá)到柱中填料上層處。8、 取14ml稀釋后的提取液（取樣體積根據(jù)分析方法的靈敏度來確定）上AflaCLEANTM柱。在凈化過程中可對柱子進(jìn)行抽真空和加壓；但必須保證過柱流速不大于2ml/min。盡量讓所有上樣樣品都通過柱子流出來，即使柱中溶劑流干了也沒有太大問題，但是要避免柱子完全溶劑流干9、 用10ml蒸餾水或純化水清洗柱子10、 用氣體吹掃或抽真空除去柱子中的殘余的水11、 每次用1ml甲醇洗脫柱子，可洗2次。第一次加入的甲醇需用堵頭堵住柱子下端，使甲醇在凈化柱中保持5min后，再放出收集。12、 根據(jù)分析的需要對洗脫液進(jìn)行稀釋或濃縮并直接進(jìn)行HPLC分析3、HPLC分析

16、方法：黃曲霉毒素檢測需要一臺配有熒光檢測器的HPLC系統(tǒng)。黃曲霉毒素HPLC分析檢測條件可參照以下設(shè)定： 流動相：水/甲醇/乙腈 60/30/15 (v/v)； 流速：1.2ml/min 進(jìn)樣量：10-100µL；柱溫：36 HPLC黃曲霉毒素專用分析柱：150×4.6mm；RP C18（貨號：10522） 熒光檢測器設(shè)置：EX.:365nm;Em.:460nm (使用柱后衍生系統(tǒng)，詳見柱后衍生技術(shù)) 或Em.:430nm用于黃曲霉毒素B類的檢測和455nm用于黃曲霉毒素G類的檢測4、柱后衍生技術(shù)在HPLC分析中，為提高一些檢測痕量目標(biāo)物的靈敏度（如黃曲霉毒素B1和G1），

17、需要對檢測的目標(biāo)物進(jìn)行衍生化，目前在HPLC中，以柱前衍生法和柱后衍生法居多，但柱前衍生法由于操作過程較繁瑣，容易影響定量的準(zhǔn)確性，不適合用于對大量樣品做常規(guī)檢測，而柱后衍生法操作簡單，可連續(xù)反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)自動化分析，適用于大量樣品的連續(xù)的自動化操作。LCTech公司現(xiàn)有UVETM光化學(xué)柱后衍生設(shè)備LCTech的UVETM柱后衍生設(shè)備（如圖1，P/N 10519）是最簡單，最便捷和性價(jià)比高的柱后衍生設(shè)備。只要將該設(shè)備連接到HPLC柱出口和熒光檢測器的進(jìn)口之間可以使用。該設(shè)備不需要任何試劑，HPLC流動相的水就可以作為反應(yīng)試劑。當(dāng)分析時(shí)不需要使用該設(shè)備，只要將設(shè)備電源關(guān)閉就可以了，不需要額外的操作。

18、圖1 LCTech公司的UVETM系統(tǒng)圖2 Aflatoxin B1 光化學(xué)衍生到 AflatoxinB2a 的過程雖然黃曲霉毒素B2和G2在熒光檢測器上有很好的響應(yīng)值，但是黃曲霉毒素B1和G1需要進(jìn)行衍生才可以在熒光檢測器上有好的響應(yīng)值。這個(gè)過程可以通過UVETM在254nm紫外光照射下進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)完成。 通過黃曲霉毒素B1和G1進(jìn)行羥基化（在雙鍵結(jié)構(gòu)上加一分子水，如圖2），并產(chǎn)生穩(wěn)定可測的熒光。這個(gè)光化學(xué)反應(yīng)過程不影響其他黃曲霉毒素B2和G2化學(xué)和檢測性質(zhì)。 一般來說，檢測方法的檢出限與樣品前處理過程和熒光檢測器的性能有關(guān)。如果儀器靈敏度足夠好，黃曲霉毒素經(jīng)AflaCLEANTM柱凈化后直接檢測，其檢測限可達(dá)到ppt級。圖3 使用UVETM柱后衍生化處理黃曲霉毒素HPLC檢測的色譜圖比較6a圖是UVETM打開的結(jié)果，6b是UVETM關(guān)閉的結(jié)果5、黃曲霉毒素分析實(shí)驗(yàn)室配置1、儀器貨號10514：AflaCLEANTM黃曲霉毒素免疫親和柱貨號10081：三指型燒杯夾，用于固定120ml免疫親和柱上樣瓶；貨號10896：120ml免疫親和柱上樣瓶，DURAN玻璃，包含蓋和密封墊貨號10519：UVETM 黃曲霉毒素紫外柱后衍生儀，CE認(rèn)證貨號10522：黃曲霉毒素專用HPLC分析柱，貨號10523：預(yù)柱（3個(gè)/