單克隆抗體制備方法

1、 單克隆抗體單克隆抗體 Monoclonal Antibody 單克隆抗體單克隆抗體(McAb) 1975 1975年英國科學(xué)家年英國科學(xué)家Milstein和和Kohler將產(chǎn)生抗體將產(chǎn)生抗體 的的淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞同同腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗融合，成功建立了單克隆抗 體技術(shù)，而獲得體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。 每個(gè)每個(gè)B淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某 種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無限種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無限 增殖，因此雜交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)增殖，因此雜

2、交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi) 條件下分泌大量結(jié)構(gòu)與特性相同的高純度抗體。條件下分泌大量結(jié)構(gòu)與特性相同的高純度抗體。 單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點(diǎn)是可以用不純的抗單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點(diǎn)是可以用不純的抗 原分子大量制備純一的單克隆抗體。原分子大量制備純一的單克隆抗體。單抗的特點(diǎn)單抗的特點(diǎn)1.高度均質(zhì)性高度均質(zhì)性-始于一個(gè)始于一個(gè)B細(xì)胞的細(xì)胞的單克隆系單克隆系,均質(zhì)均質(zhì)2.高度特異性高度特異性-針對單個(gè)抗原決定針對單個(gè)抗原決定簇反應(yīng)簇反應(yīng),一般無交叉反應(yīng)一般無交叉反應(yīng)3.來源穩(wěn)定來源穩(wěn)定,產(chǎn)量大產(chǎn)量大探討蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)；探討蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)；淋巴細(xì)胞亞群的表面新抗原分析；淋巴細(xì)胞亞群的表面新

3、抗原分析；組織相容性抗原；組織相容性抗原；激素和藥物的放射免疫（或酶免疫）分析；激素和藥物的放射免疫（或酶免疫）分析；腫瘤的定位和分類；腫瘤的定位和分類；純化微生物和寄生蟲抗原；純化微生物和寄生蟲抗原；免疫免疫-化學(xué)療法（化學(xué)療法（“導(dǎo)彈導(dǎo)彈”療法，療法， 利用單克隆抗體與靶細(xì)利用單克隆抗體與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，將藥物帶至病灶部胞特異性結(jié)合，將藥物帶至病灶部 位）?？芍苯佑糜谌祟愇唬？芍苯佑糜谌祟惣膊〉脑\斷、預(yù)防、治療以及免疫機(jī)疾病的診斷、預(yù)防、治療以及免疫機(jī) 制的研究。制的研究。應(yīng)應(yīng) 用用雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生 單克隆抗體示意圖單克隆抗體示意圖性性 質(zhì)質(zhì)常規(guī)血清抗體常規(guī)血清抗體單克隆抗

4、體單克隆抗體抗體含量抗體含量少少 g/mlg/ml多多 mg/ml無關(guān)的無關(guān)的Ig多多少或幾乎無少或幾乎無其它血清蛋白其它血清蛋白有有少，培養(yǎng)物上清常有少，培養(yǎng)物上清常有10胎牛血清胎牛血清Ag-Ab結(jié)合結(jié)合免疫原的全部成分的全部免疫原的全部成分的全部抗原決定簇抗原決定簇免疫原中的一種成分的免疫原中的一種成分的一個(gè)抗原決定簇一個(gè)抗原決定簇特異性親和力的重復(fù)性特異性親和力的重復(fù)性不同批號(hào)間有變化不同批號(hào)間有變化無變化無變化與其它抗原的交叉反應(yīng)與其它抗原的交叉反應(yīng)與帶有共同抗原決定簇的與帶有共同抗原決定簇的抗原有部分交叉抗原有部分交叉一般無。結(jié)合到共同決一般無。結(jié)合到共同決定簇則是完全的定簇則是完

5、全的免疫球蛋白的種類與亞類免疫球蛋白的種類與亞類完全是混合的完全是混合的只是一種或幾種只是一種或幾種免疫球蛋白的物理性質(zhì)免疫球蛋白的物理性質(zhì)典型光譜典型光譜抗體的單一性質(zhì)抗體的單一性質(zhì)單抗與多抗單抗與多抗主要步驟包括：主要步驟包括：（1）抗原制備；）抗原制備；（2）免疫動(dòng)物；）免疫動(dòng)物；（3）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備； （4）細(xì)胞融合；）細(xì)胞融合； （5）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)； （6）雜交瘤細(xì)胞的篩選；）雜交瘤細(xì)胞的篩選； （7）雜交瘤細(xì)胞的克隆化；）雜交瘤細(xì)胞的克隆化；（8）單克隆抗體的檢定；）單克隆抗體的檢定； （9）單克隆抗體的

6、大量制備。）單克隆抗體的大量制備。一一 、抗原提純與動(dòng)物免疫、抗原提純與動(dòng)物免疫 對抗原的要求是純度越高越好對抗原的要求是純度越高越好1 細(xì)胞抗原細(xì)胞抗原-可取可取1107個(gè)細(xì)胞作腹腔免疫個(gè)細(xì)胞作腹腔免疫2 可溶性抗原可溶性抗原-需加完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化需加完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化3 聚丙烯酰胺電泳純化的抗原聚丙烯酰胺電泳純化的抗原-可將抗原所在的電泳條帶可將抗原所在的電泳條帶 切下，切下， 研磨后直接用以動(dòng)物免疫。研磨后直接用以動(dòng)物免疫。選擇選擇BALB/c健康小鼠，鼠齡在健康小鼠，鼠齡在812周，雌雄不限。同時(shí)周，雌雄不限。同時(shí)免疫免疫34只小鼠。只小鼠。免疫過程因動(dòng)物、抗原形式、免疫

7、途徑不同而異，以獲得免疫過程因動(dòng)物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價(jià)抗體為最終目的。免疫間隔一般高效價(jià)抗體為最終目的。免疫間隔一般23周。共計(jì)三到四次周。共計(jì)三到四次。分離脾細(xì)胞融合前分離脾細(xì)胞融合前34天加強(qiáng)免疫一次。天加強(qiáng)免疫一次。 二二 、 三種細(xì)胞三種細(xì)胞 1 Sp2/0(骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞) 本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。融合細(xì) 胞應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞。2 飼養(yǎng)細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí)，還需加入飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）。常用的為小鼠的腹腔細(xì)胞。在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，切

8、忌針頭刺破動(dòng)物的消化器官，否則所獲細(xì)胞會(huì)有嚴(yán)重污染。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備拉頸處死浸泡于拉頸處死浸泡于75酒精，消毒酒精，消毒35分鐘分鐘用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入用無菌注射器注入68ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入放入10ml離心管，離心管，1200轉(zhuǎn)分離心轉(zhuǎn)分離心56分鐘分鐘用用20小牛血清小牛血清(NCS) 的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)110ml加入加入96孔板，孔板，100l孔孔放入放入37孵箱培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)3 免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中免疫脾細(xì)胞指的是處

9、于免疫狀態(tài)脾臟中B淋淋巴母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫巴母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的倍，細(xì)胞數(shù)為的倍，細(xì)胞數(shù)為10左右。左右。三三、細(xì)胞融合、細(xì)胞融合分別收集洗滌和并計(jì)數(shù)將兩種細(xì)胞混合后加分別收集洗滌和并計(jì)數(shù)將兩種細(xì)胞混合

10、后加PEG(聚乙二醇聚乙二醇) 使細(xì)胞彼此融合。其后培養(yǎng)液稀釋使細(xì)胞彼此融合。其后培養(yǎng)液稀釋PEG，消除，消除PEG的作用。的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。注意問題注意問題細(xì)胞比例細(xì)胞比例：常用：常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。有較高活性。反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)時(shí)間：輕柔操作。在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第：輕柔操作。在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第1min滴加滴加ml培養(yǎng)液；第培養(yǎng)液；第2min滴加滴加ml培養(yǎng)液，爾后培養(yǎng)液，爾后min加培養(yǎng)液加培養(yǎng)液0ml。培養(yǎng)液的成分培養(yǎng)液的成分

11、：對融合細(xì)胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其：對融合細(xì)胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時(shí)核查培養(yǎng)基情況。合效率降低，應(yīng)隨時(shí)核查培養(yǎng)基情況。四、四、HAT選擇雜交瘤選擇雜交瘤選擇性培養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)的目的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤次黃嘌呤-鳥嘌呤鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死

12、亡。而死亡。 未融合的未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。培養(yǎng)基中存活和增殖。 次黃嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶核苷五、雜交瘤細(xì)胞的克隆化五、雜交瘤細(xì)胞的克隆化有限稀釋法有限稀釋法制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)陽性孔細(xì)

13、胞的計(jì)數(shù)取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞ml，100l孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)ml，100l孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)ml，100l孔，加G、H兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200l孔。第89天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測。 六、單克隆抗體的鑒定六、單克隆抗體的鑒定1.抗體特異性的鑒定：方法可用抗體特異性的鑒定：方法可用ELISA法。法

14、。2.McAb的的Ig類與亞類的鑒定類與亞類的鑒定3.McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來觀察動(dòng)物同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)?；蚣?xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。4.McAb識(shí)別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合識(shí)別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合試驗(yàn)、測相加指數(shù)的方法，測定試驗(yàn)、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識(shí)別抗原所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來確定位

15、點(diǎn)，來確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。的識(shí)別的表位是否相同。5.McAb親和力的鑒定：用親和力的鑒定：用ELISA或或RIA競競爭結(jié)合試驗(yàn)來確定爭結(jié)合試驗(yàn)來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。七、單克隆抗體的大量生產(chǎn)七、單克隆抗體的大量生產(chǎn)體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水。體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水。腹腔注射腹腔注射1106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，亡

16、之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲一般一只小鼠可獲110ml腹水。也可用注射器腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。八:細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇-慢凍快復(fù)（一）保存 連續(xù)傳代的過程中，可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移丟失產(chǎn)生抗體的特性。所以必須冷藏保存一部分。保存方法如下：1材料(1) 細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞。(2) 10二甲基亞砜保護(hù)液：含10二甲基亞砜、20滅活胎牛血清，70RPMI1640液。(3) 20FCS1640培養(yǎng)液：含青霉素100U/ml，鏈霉素100g/ml。(4) 滅菌的2ml安瓶等2操作方法(1) 去掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液，加

17、入10FCS1640液，使細(xì)胞懸浮。(3) 1 000r/min離心10min，去上清。細(xì)胞沉淀用10二甲基亞砜保護(hù)液制成懸液。(4) 用注射器將細(xì)胞分裝安瓶，每瓶0.5ml1.0ml，熔封安瓶。(5) 放4 2h。(6) 放液氮罐氣態(tài)部分（-70）15h。(7) 轉(zhuǎn)入液氮部分。（二）復(fù)蘇二）復(fù)蘇1從液氮罐中取出安瓶立即放37水浴中速溶。2無菌操作打開安瓶，取出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)瓶。3逐滴緩慢加入20FCS1640培養(yǎng)液3.5ml，這個(gè)過程延續(xù)3min。45CO2飽和濕度，37培養(yǎng)。54h后棄去培養(yǎng)液上清，加入新鮮的20FCS1640培養(yǎng)液。6繼續(xù)培養(yǎng)，換液，以至形成單層。主要失敗原因和影

18、響因素有主要失敗原因和影響因素有:1.污染污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALBc小鼠的腹腔，小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，取出分離雜交瘤細(xì)胞，一待長出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。般可除去支原體污染。2.融合后雜交瘤不生長融合后雜交瘤不生長：PEG有毒性或作用時(shí)間過長有毒性或作用時(shí)間過長牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體HAT有問題，主要是有問題，主要是A含量過高或含量過高或HT含量不足含量不足3.雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體融合后有細(xì)胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是融合后有細(xì)胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致