凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒

1、凱基TUNELffl胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒凱基TUNELffl胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（通用） （BIOTIN標(biāo)記PODfc，適用于細(xì)胞、組織樣本）使用說(shuō)明書一、TUNE用品說(shuō)明凱基TUNE佟田胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞在凋亡過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素（biotin ）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核甘酸末端轉(zhuǎn) 移酶（TdT Enzyme的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的 DNA勺3 OH末 端，并可與連接了的辣根過(guò)氧化酶的鏈霉親和素（ Streptavidin-HRP ）特異結(jié) 合，在辣根過(guò)氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB的存在下，產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng) （呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正

2、在凋亡的細(xì)胞，因而在普通顯微鏡下即可觀 察和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA勺斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì) 胞涂片）的凋亡原位檢測(cè)。本試劑盒特點(diǎn) 操作簡(jiǎn)便：使用 Ready-to-Use型試劑，并配有 Proteinase K 和DAB 高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細(xì)胞。 高特異性：能特異性染色凋亡細(xì)胞。 快速操作：整體操作約需3小時(shí)。 用途廣泛：可應(yīng)用于組織切片、細(xì)胞樣本等。 方便觀察：使用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。高正確性：有陽(yáng)性對(duì)照片的制備方法，可以確認(rèn)試劑盒的有效性 使用注

3、意事項(xiàng)1 .使用前請(qǐng)認(rèn)真閱讀本說(shuō)明書，提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑。2 .因本試劑盒中組分均為微量，使用前請(qǐng)離心集液。3 .為避免試驗(yàn)誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進(jìn)口微量移液槍及槍頭。4 . TdT酶反應(yīng)液最好在使用前根據(jù)樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本 片上，避免每個(gè)樣本單獨(dú)配制而產(chǎn)生的試劑損耗。5 .為防止樣本脫落，請(qǐng)使用硅烷(Silane )處 理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。6 . 固定好的樣本可以在-20C的70叱醇中放 置30分鐘或至過(guò)夜，以改善細(xì)胞的滲透性。7 .使用PBS青洗細(xì)胞樣本時(shí)，不要直接加在細(xì) 胞樣本上，以防止細(xì)胞樣本的脫落。8 .進(jìn)行PBS青洗時(shí)，以5分鐘清洗3

4、次為標(biāo)準(zhǔn)。9 . DAB為固體粉末，使用前加入 PBS配制成20 X DAB(10 mg/ml)后，按說(shuō)明 書顯色使用。、TUNEL式齊1J盒組分組份Cat:KGA70220 assaysCat:KGA70350 assaysCat:KGA704100 assays儲(chǔ)存條 件Equilibration Buffer1.0 mL2.5 mL5.0 mL-20 CBiotin-11-dUTP20 p L50 p L100 N L-20 CTdT Enzyme80 p L200 p L400 p L-20 C50x Proteinase K40 p L100 N L200 p L-20 CStrep

5、tavidin-HRP10 N L25 p L50 pL4c避 光DAB2mg5mg10 mg-20 C試劑盒以外自備儀器和試劑 光學(xué)顯微鏡、37c孵箱、微量移液器、染色濕盒、蓋玻片、載玻片、染色缸二甲苯、多聚甲醛、PBS HO、TritonX-100、檸檬酸鈉、復(fù)染染液：蘇木素 或甲基綠等。三、操作流程概覽細(xì)胞涂片、貼壁樣本通左性的促TdT酶的作用下加入Strep光學(xué)顯微鏡觀察四、檢測(cè)樣本的預(yù)處理TUNEL檢測(cè)時(shí)樣本的預(yù)處理是試驗(yàn)的關(guān)鍵所在， 本說(shuō)明書推薦的條件僅為 普遍情況，用戶需根據(jù)自已的樣本材料及首次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)調(diào)整各個(gè)條件（參照 Page 9）,如處理時(shí)間、處理濃度等，來(lái)優(yōu)化出適合自身

6、樣本的試驗(yàn)條件，從而 做出客觀的試驗(yàn)結(jié)果。1.細(xì)胞樣本的準(zhǔn)備自然晾干的細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片或墨片】（固凝n 4少疹聚甲醛溶于PHT.4的PES申，需鮮盤熱4?的70%乙醺中放置3口分鐘或至過(guò)夜,以改善細(xì)胞的滲透性PBS漂洗浸入封閉液中，室溫（B25T?） Solomin（封閉海 3%坨6落于甲蹴封閉液配制方法.13。%40?溶于ftnl甲醇浸入通透液中，水上（2-B-C）促港0.l%TnionX-10（l SST嘉髓鮮配部蹦破窗麻二 ifcfi制:loom1水.承閽制好的11mmi的01%»灌蝴中加入O.bniTHmnX-lflO進(jìn)入標(biāo)記反應(yīng)（詳見(jiàn)Page S）操作注意事項(xiàng):1 .為防

7、止樣本脫落，請(qǐng)使用硅烷（Silane ）處 理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。2 .使用PBS青洗細(xì)胞樣本時(shí)，不要直接加在細(xì) 胞樣本上，以防止細(xì)胞樣本的脫落。3 .進(jìn)行PBS青洗時(shí)，以5分鐘清洗3次為標(biāo)準(zhǔn)。4 .固定液、PBS封閉液、通透液、染色缸需用戶自備，請(qǐng)按上述方法配制。五、標(biāo)記和顯色反應(yīng)頊處理好的樣本PBS漂洗兩次，樣本周圍用唳水里吸干每個(gè)樣本滴加打出LTdT箱反應(yīng)版，配蓋碟片37c避光濕潤(rùn)反應(yīng)60由（TdT B6反應(yīng)液=45 M-L Equilibration Buffer +1U-L BioliBrll-dUIF +4j L TdT Enzjg 需薪鮮宏部陰性對(duì)照片不加TdT K&g

8、t;PBS漂洗三次.樣本周圍用吸水紙吸干5 .如果20 X DAB容液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制現(xiàn)象可能原因建議6 .蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液，染色 30s-10min （根據(jù)樣本做適當(dāng)調(diào) 整），蒸儲(chǔ)水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中 5s,立即用蒸儲(chǔ)水沖洗干凈。分 別用70% 85% 95%無(wú)水乙醇浸泡5分鐘。用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲 苯后再浸泡10分鐘。晾干后在切片上加中性樹(shù)膠，加蓋玻片。六常見(jiàn)問(wèn)題的原因及推薦解決方案非特異性染色 （例如:非凋 亡細(xì)胞的強(qiáng)染 色）Biotin-dUTP 的非特異性結(jié)合勿使細(xì)胞干涸在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-

9、100 和 1 mg/ml BSA 的 PBSgfc三次。TdT酶的濃度過(guò)高用 TdT dilution buffer*作 1 ： 21 ：10稀釋，內(nèi)源過(guò)氧化物酶 未被封閉封閉液室溫（15-25 C）封閉10min （封閉 液：3%HO溶于甲醇）光照紫外線導(dǎo)致 包埋試劑的聚合（如:甲基丙烯酸 會(huì)導(dǎo)致樣本DNA勺 斷裂）嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑在固定組織時(shí)樣 本DNAG斷裂（內(nèi) 源核酸酶的作用）確保樣品取樣后立即固定或通過(guò)肝靜脈灌 注固定固定后某些核酸 酶活性依然較局 導(dǎo)致DN幽裂用含有dUTPffi dAPT的溶液封閉染色背景較高福爾馬林固定導(dǎo) 致某些含黑色素 前體的細(xì)胞染成 黃色

10、嘗試以甲醇固定，但可能會(huì)降低檢測(cè)的敏感 性。內(nèi)源過(guò)氧化物酶 未被封閉封閉液室溫（15-25 C）封閉10min （封閉液：3%H2O溶于甲醇）Biotin-dUTP 的非特異性結(jié)合在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100 和 1 mg/ml BSA 的 PBSfc三次。樣本被支原體污 染使用支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，如陽(yáng)性則制備 未被污染的新樣本標(biāo)記反應(yīng)試劑（TdT酶及 dUTP 的濃度過(guò)高稀釋50%以降低標(biāo)記反應(yīng)的濃度細(xì)胞處于高度增 殖期在非高增殖期取樣檢測(cè)DABW育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)減少DA以色時(shí)間標(biāo)記率低、染 色淡至無(wú)如果以乙醇或甲 醇固定的樣本則 標(biāo)記效率較低（因 為在固定時(shí)染色

11、 質(zhì)未能與蛋白質(zhì) 交聯(lián)，而在操作中 丟失）用溶于PBS PH7.4中的4%T聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定。過(guò)度的固定導(dǎo)致 與蛋白過(guò)度交聯(lián)縮短固定時(shí)間，或用溶于 PBS PH7.4的2% 多聚甲醛固定促滲條件不佳，以 致于試劑不能到 達(dá)靶分子或濃度 過(guò)低增加通透劑促滲時(shí)間增加通透劑的作用溫度（15-25 C）優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時(shí)間（如:以 400ug/ml 作用 5min）0.1M的檸檬酸鈉70c作用30min。復(fù)染信號(hào)較弱選擇的染料不合 適用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%?基綠PH4.0 ,或蘇木素復(fù)染陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有 信號(hào)DNase I的濃度過(guò) 低冷凍切片使用3U/mL的DNas

12、e I石蠟切片使用1500U/mL的DNase I一 樣本使用 10U/ml DNase I反應(yīng)緩沖液：10mMTris-HCl ( PH 7.9) 10 mM NaCl, 5mM MnCb, 10mM CaCl2, 25mMKCl2 , 37c 反應(yīng) 30 min, PBSgt 去。組織樣本從載 玻片脫落組織樣本被酶從 玻片消化卜來(lái)降低蛋白酶K的處理時(shí)間*TdT dilution buffer : 60 mM KPB緩沖液(pH7.2) , 150 mM KCl, 1 mM 2-mercaptoethanol , 50 % Glycerol非離子表面活性劑T riton X-100（聚乙二醇

13、辛基苯基醴）免疫細(xì)胞化學(xué)中，Triton X-100常用濃度 為1%和0.3% ,但通常是先配制成30%的Triton X-100儲(chǔ)備液，臨用時(shí)稀釋至 所需濃度。30% Triton X-100 的配制：試齊J: Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS（pH7.3） 或 0.05mol/l TBS（pH7.4） 72.8ml配制方法：取Triton X-100 及PBS （或TBS）混合，置37c40c水浴中2 3h,使其充分溶解混勻。用前取該儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。Triton X-100是一種非離子型表面活性劑（或稱清潔劑），分子量為646.86（C34H62O11 ）。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性。1%的TritonX-100常用于漂洗組織標(biāo)本，0.3%的Thton X-100則常用于稀釋血清，配制BSA滿加柏l stTeptwidir-HlP工作?6,加蓋殘片37c晶麗窿光反應(yīng)列min(Streptavidiir-HKP工作液；0.Hl1 2 * 4 L Streptawi_dinr_tikP-|-99.5M-L. PBS)滴加勖A1TOO注工DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)IQminCDAB IfRftc 5U.L ZOXDAB+im SOMt+MU-L FBS 需藉鮮曹觸FB$器洗三次，光學(xué)顯微鏡察、拍