重組質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)化篩選和鑒定 (2)

1、DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定摘要本實(shí)驗(yàn)通為了驗(yàn)證重組質(zhì)粒的類型，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：PUC19的單酶切、連接、轉(zhuǎn)化、重組子的篩選與鑒定、轉(zhuǎn)化子的菌落PCR、平板復(fù)證、瓊脂糖凝膠電泳等。所用的酶有Hind 核酸內(nèi)切酶，T4連接酶和Taq酶。由于Hind 單酶切質(zhì)粒產(chǎn)生的片段多樣，需要通過(guò)一系列的篩選、副證與電泳鑒定來(lái)最終確定酶切片段的類型。關(guān)鍵字 酶切 連接 轉(zhuǎn)化 重組子瓊脂糖凝膠電泳引言重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，

2、供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。本實(shí)驗(yàn)的供體是 DNA，受體是E.coliDH5,載體是PUC19。DNA的酶切通常是DNA重組技術(shù)的第一步，酶切是指將不同來(lái)源的DNA上將待克隆的DNA片段特異性切下，同時(shí)在載體DNA分子（一般為質(zhì)粒DNA）上打開(kāi)相應(yīng)的缺口，然后將兩者連接成重組DNA分子。這一特異性的切割過(guò)程常由特定的限制性核酸內(nèi)切酶來(lái)完成。目前在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)有600多種限制性核酸內(nèi)切酶，根據(jù)其性質(zhì)的不同可分為三大類，分別為、和類：類酶的識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，切斷部位不定；類酶的識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，但切斷特定部位；類酶切斷識(shí)別部位或其附近的特定部位，酶切后的雙鏈DNA的末端是粘性

3、末端，某些限制酶產(chǎn)生平末端。因此，應(yīng)用于基因工程研究用的限制酶，一般全是類酶。酶切又分為單酶切和雙酶切，單酶切就是只用一個(gè)限制性內(nèi)切酶去切質(zhì)粒,使環(huán)狀的質(zhì)粒被切割為一條或多條線狀DNA,單酶切操作簡(jiǎn)單，但是后期篩選工作復(fù)雜；雙酶切用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶,質(zhì)粒上就產(chǎn)生了兩個(gè)缺口,環(huán)狀質(zhì)粒變成兩段線狀DNA了片段，雙酶切前期酶切操作復(fù)雜，但是重組效率高。本實(shí)驗(yàn)所選用的限制酶是Hind ，選用方法是單酶切法。DNA連接反應(yīng)是利用DNA連接酶把載體DNA和要克隆的目的DNA片段連接在一起，成為一個(gè)完整的重組分子的反應(yīng)。當(dāng)載體DNA和外源DNA末端都是由一種產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的話（同尾酶也可以），

4、或者兩者末端被接上一段互補(bǔ)的多聚體的尾巴，那么經(jīng)退火后可形成新的重組分子。連接后產(chǎn)生的重組分子中仍然保留著外源DNA兩端的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，從而使我們能方便地從重組分子再次取出所克隆的DNA段。本實(shí)驗(yàn)所選用的連接酶是T4連接酶。轉(zhuǎn)化是某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型的細(xì)胞的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。為了檢驗(yàn)連接產(chǎn)勿，需要對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，本實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，用氨芐抗性的選擇培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選；通過(guò)紅白斑反應(yīng)對(duì)重組子進(jìn)行篩選。電泳是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)

5、向相反的電極移動(dòng)。凝膠電泳是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠是電泳支持介質(zhì)，具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，此時(shí)移動(dòng)的速度可因帶電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定 和 純化DNA片段。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒的類型，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了如下后續(xù)實(shí)驗(yàn)：菌落PCR、進(jìn)一步的酶切反應(yīng)、和一系列的DNA電泳（對(duì)菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳、重組質(zhì)粒的1%瓊脂糖凝膠電泳、酶切重組質(zhì)粒的1.2%瓊脂糖凝膠電泳），最終從電泳圖中確定出酶切產(chǎn)物的片段大小。正文1.材料和方法1.1 材料和試劑

6、實(shí)驗(yàn)材料：PUC19質(zhì)粒，E.coliDH5。實(shí)驗(yàn)試劑：Hind 核酸內(nèi)切酶，T4連接酶和Taq酶，瓊脂糖，TEA，質(zhì)粒提取試劑盒，buffer，PCR引物，ddH2O，CaCl2，麥康凱培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基等。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)（1）分別在1.5ml離心管中按照表1表酶切反應(yīng)體系按順序加入各組分，每組都需要酶切自己組提出的pUC19質(zhì)粒，韓霜酶切 DNA（商品），王帥酶切pUC19（商品）。加樣序號(hào)反應(yīng)體系成分pUC19（各組） DNA（商品）pUC19（商品）體積（L）體積（L）體積（L）1ddH2O13.069.062.0210×M buffer2.

7、010.08.03DNA4.015.04.04Hind （15U /L）1.06.06.0共計(jì)20.0100.0（50+50）80.0（40+40）表1 酶切反應(yīng)體系（2）每組樣品混勻后4000rpm,1min離心，將液體集中于管底（3）在37水浴12h后,將溶液存放在-20以待下次電泳使用。2.第一次材料準(zhǔn)備（1）每組將1.5mL離心管若干放入500mL三角瓶中滅菌；（2）全班用100 mL三角瓶裝2瓶20mL無(wú)菌水以待高壓滅菌（3）全班配置用2個(gè)量筒（以及搪瓷杯）配置LB液體培養(yǎng)基共2000ml ，并進(jìn)行如下分裝：25ml/100ml三角瓶×20瓶，50ml/300ml三角瓶&#

8、215;6瓶,100ml/300ml三角瓶×12瓶(加入1.3%的瓊脂，即15.6g瓊脂),放入高壓鍋滅菌。（4）把使用的槍尖盒裝滿、包好，做好“黃藍(lán)”標(biāo)記，高壓除菌；3.對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1瓊脂糖凝膠電泳（1）正確組裝制膠槽、制膠板、18尺的樣品梳（制兩塊膠）；（2）取80mL1×TAE至250mL紅蓋試劑瓶中；再稱0.8g瓊脂糖，倒入瓶中，輕旋混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無(wú)顆粒；（3）待溶液冷卻至60左右，加入40L 1mg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，使EB溶液終濃度為0.5mg/mL，混勻后倒入制膠槽中，冷卻凝固待用（冷卻凝固時(shí)間要在30min以上

9、）。（4）每組取1個(gè)1.5mL離心管，加入8L反應(yīng)體系的酶切反應(yīng)液和2L 6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混勻。韓霜取1個(gè)1.5mL離心管，分別加入4L 反應(yīng)體系的DNA（商品）酶切反應(yīng)液和1L6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混勻。王帥取1個(gè)1.5mL離心管，分別加入4L 反應(yīng)體系的pUC19（商品）酶切反應(yīng)液和1L6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混勻。老師取1個(gè)1.5mL離心管，分別加入4L 反應(yīng)體系的pUC19（商品test）酶切反應(yīng)液和1L6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混勻。（5）待

10、膠冷卻完畢，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳槽中事先加入1×TAE電泳緩沖液）將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE至高出膠面約1mm；（6）將上述混合好的DNA樣品，按照表順序，點(diǎn)樣到上樣孔中（13韓霜點(diǎn)樣；26王帥點(diǎn)樣，其他上樣孔各組點(diǎn)各自的樣）。表2酶切反應(yīng)電泳上樣順序泳道12345678樣品/Hind DNA/ Hind（Test）pUC19（商品）pUC19（商品）/ Hind （對(duì)照）pUC19（商品）/ Hind （T）1組pUC19/ Hind 2組pUC19/ Hind 樣量5.0L5.0L5.0L5.0L5.0L5.0L10.0L10.0L泳道

11、910111213141516樣品3組pUC19/ Hind 4組pUC19/ Hind 5組pUC19/ Hind 6組pUC19/ Hind 7組pUC19/ Hind 8組pUC19/ Hind 9組pUC19/ Hind 10組pUC19/ Hind 樣量10.0L10.0L10.0L10.0L10.0L10.0L10.0L10.0L（7）開(kāi)啟電泳儀電源，選擇合適的電壓120V和時(shí)間40min；（8）將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連；（9）啟動(dòng)電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開(kāi)；（10）電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝

12、膠，在紫外燈下觀察電泳條帶。4. 第二次材料準(zhǔn)備（1）每個(gè)500 ml三角瓶配制250ml 麥康凱培養(yǎng)基，共配制12瓶。（除第2大組多配兩瓶，其余每個(gè)小組各配1瓶）：取13g麥康凱瓊脂，重蒸水溶解、定容至250mL，高壓除菌；（2）包裝14套培養(yǎng)皿，每套12個(gè)皿，高壓除菌；（3）準(zhǔn)備6盒無(wú)菌牙簽與100ml 燒杯，中高壓除菌；（4）準(zhǔn)備12組無(wú)菌試管，每組4支，高壓除菌；（5）將無(wú)菌Ep管塞滿到500ml三角瓶中，高壓除菌；（6）把使用的槍尖盒裝滿、包好，做好“黃藍(lán)”標(biāo)記，高壓除菌；5.載體與外源DNA的連接反應(yīng)（1）分別在1.5ml離心管中按照表3表酶切反應(yīng)體系按順序各組分，其中3組和10組

13、用的是自己提的pUC19質(zhì)粒，其他組用商品化的pUC19質(zhì)粒。每組都用自己提的 DNA。表3 連接反應(yīng)體系加樣順序成分體積（L）1ddH2O3.2210×T4 Ligase Buffer1.03pUC19/Hind 2.0（50ng）4 DNA /Hind 3.0（135ng）5T4 DNA Ligase（350 U/L）0.8合計(jì)10.0（2）每組樣品混勻后，4000rpm離心1min，集液于管底。（3）將樣品至于16條件下過(guò)夜。6. E. coli受體菌DH5的準(zhǔn)備（1）倒LB平板，劃線活化E.coli 受體菌DH5；（2）挑取單菌落至5mL LB液體中，37°C振蕩培

14、養(yǎng)過(guò)夜；（3）將過(guò)夜培養(yǎng)物按1%轉(zhuǎn)接至新鮮20mL LB液體，37°C，220rpm培養(yǎng)2-2.5hr后，將菌液置于冰浴中。7.平板制備每組傾注12個(gè)麥康凱培養(yǎng)基平板，其中1組做不加氨芐的對(duì)照組，其他組都做加氨芐的實(shí)驗(yàn)組。（1）將熱的麥康凱培養(yǎng)基室溫冷卻至55-60°C左右；（2）加入終濃度100g/mL的Amp 250l（1組不加）于培養(yǎng)基中；（3）無(wú)菌操作倒平板12個(gè)。8.制備E. coli感受態(tài)細(xì)胞（1）用搪瓷杯取滿冰（2）取2個(gè)1.5mL Ep管，分別加入1.5mL E.coliDH5菌液，4離心機(jī)4000rpm, 5min離心，棄上清；（3）利用Ep管中殘留液體渦

15、旋細(xì)胞；（4）分別向2個(gè)Ep管中加入800L預(yù)冷的0.1M CaCl2;（5）冰浴懸浮細(xì)胞；（6）用4離心機(jī)4000rpm，5min離心，吸棄上清；（7）分別向2個(gè)Ep管中加入100L冷0.1M CaCl2，用槍尖輕輕吹懸細(xì)胞；（8）冰浴20 min;（9）將其中一管的液體取50L至一新的Ep管，做好標(biāo)記“3”，剩下的殘留50L的管標(biāo)記為“2”，沒(méi)有分裝的裝有100L感受態(tài)細(xì)胞的標(biāo)記為“1”。此時(shí)感受態(tài)細(xì)胞制備完成（現(xiàn)用或者48小時(shí)內(nèi)使用，4存放）。9.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細(xì)胞（1）按照表4的步驟由1到7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表4連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細(xì)胞步驟步驟171234567實(shí)

16、驗(yàn)設(shè)組感受態(tài)細(xì)胞（L/管）DNA（L）冰浴熱擊冰浴復(fù)蘇培養(yǎng)基涂布平板-試驗(yàn)組樣量1000連接物5.010min90s5min向每個(gè)Ep管中加入0.9mL LB ，0.51 h麥康凱+Amp50L×2100L×2150L×2200L×2-轉(zhuǎn)化對(duì)照50pUC191.0（自提）麥康凱+Amp50L×1-細(xì)胞對(duì)照50麥康凱+Amp50L×1麥康凱50L×1(2)平板正置于操作臺(tái)上10分鐘后，倒置于37溫箱中培養(yǎng)1620h。10. 轉(zhuǎn)化子的菌落PCR、平板復(fù)證及酸堿檢測(cè)（1）用馬克筆將預(yù)留的麥康凱+Amp平板劃線分區(qū)，用高壓過(guò)的牙簽挑

17、取4個(gè)白色的單菌落在4個(gè)區(qū)域分別劃線；（2）將劃線的麥康凱+Amp平板在37溫箱倒置培養(yǎng)1620h；（3）取出4個(gè)Ep管，按照表6 PCR反應(yīng)體系在冰浴中，依序向Ep管中加入如下成分，然后將剛剛劃線的牙簽在反應(yīng)液中快速轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)菌在反應(yīng)體系中充分混勻；表520L菌落PCR的反應(yīng)體系組分加量（L）ddH2O14.610×Buffer2.0dNTP(2.5mM each)1.6M13F(10M)0.8M13R(10M)0.8模版（110ng/L）-Taq酶（5U/L）0.2（4）用兩張pH試紙分別放在在紅色菌落和白色上觀察pH試紙顏色變化。11轉(zhuǎn)化子的液體培養(yǎng)將驗(yàn)證平板上的菌落分別挑取到

18、含5mL液體LB+Amp培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。（共4管）12.對(duì)菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳（1）正確組裝制膠槽、制膠板、25尺的樣品梳（制兩塊膠）；（2）取80mL1×TAE至250mL紅蓋試劑瓶中；再稱0.96g瓊脂糖，倒入瓶中，輕旋混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無(wú)顆粒；（3）待溶液冷卻至60左右，加入40L 1mg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，使EB溶液終濃度為0.5mg/mL，混勻后倒入制膠槽中，冷卻凝固待用（冷卻凝固時(shí)間要在30min以上）。（4）向4管20L菌落PCR的反應(yīng)體系中（表5）分別加入4L loading buffer

19、，吹吸混勻后，取10L上樣電泳。（5）待膠冷卻完畢，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳槽中事先加入1×TAE電泳緩沖液）將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE至高出膠面約1mm；（6）將上述混合好的DNA樣品，按照表6順序，點(diǎn)樣到上樣孔中。表6-1菌落PCR的反應(yīng)體系電泳上樣順序（1至5組）泳道123456789樣品DL2000-陽(yáng)性-陰性1-11-21-31-42-12-2樣量（L）51010101010101010泳道101112131415161718樣品2-32-43-13-23-33-4-陽(yáng)性-陰性4-1樣量（L）101010101010101010泳道1

20、9202122232425樣品4-24-34-45-15-25-35-4樣量（L）10101010101010表6-2菌落PCR的反應(yīng)體系電泳上樣順序（6至10組）泳道123456789樣品DL20006-16-26-36-47-17-27-37-4樣量（L）51010101010101010泳道101112131415161718樣品-陽(yáng)性-陰性8-18-28-38-49-19-29-3樣量（L）101010101010101010泳道1920212223樣品9-410-110-210-310-4樣量（L）1010101010（7）開(kāi)啟電泳儀電源，選擇合適的電壓120V和時(shí)間40min；（8

21、）將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連；（9）啟動(dòng)電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開(kāi)；（10）電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝膠，在紫外燈下觀察電泳條帶。13.試劑盒法提取重組質(zhì)粒DNA（1）取2個(gè)新的Ep管，做好標(biāo)記，分別加入3mL菌液（按兩次加入），室溫下13000rpm離心1min收集細(xì)菌。（2）倒棄上清，加入250L Solution/RNase A混合液，渦旋振蕩使細(xì)胞完全懸浮。（3）往重懸混合液中加入250L Solution，輕輕顛倒混勻46次。（4）加入350L Solution，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。（

22、5）室溫下，13000rpm離心10min。（6）移上清液至套有2mL收集管的Hibind DNA結(jié)合柱中，室溫下13000rpm離心1min，倒去收集管中的濾液。（7）把柱子重新裝回收集管，加入500L HB Buffer，按上述條件離心，棄去濾液。（8）把柱子重新裝回收集管，加入700L DNA Wash Buffer，按上述條件離心，棄去濾液。（9）棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，13000rpm離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)。（10）把柱子裝在干凈的1.5mL離心管上，加入50L Elution Buffer到柱子基質(zhì)中，靜置12min，13000rpm離心1min洗脫出DNA。14.

23、重組質(zhì)粒的1%瓊脂糖凝膠電泳（1）正確組裝制膠槽、制膠板、18尺的樣品梳（制兩塊膠）；（2）取80mL1×TAE至250mL紅蓋試劑瓶中；再稱0.8g瓊脂糖，倒入瓶中，輕旋混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無(wú)顆粒；（3）待溶液冷卻至60左右，加入40L 1mg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，使EB溶液終濃度為0.5mg/mL，混勻后倒入制膠槽中，冷卻凝固待用（冷卻凝固時(shí)間要在30min以上）。（4）取2個(gè)新的Ep管，做好標(biāo)記，分別加入2l ddH2O,2l質(zhì)粒和1l loading buffer，輕彈/用槍吹吸混勻，快速離心集液于管底。（5）待膠冷卻完畢，輕輕拔出梳子，

24、放入電泳槽中（電泳槽中事先加入1×TAE電泳緩沖液）將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE至高出膠面約1mm；（6）將上述混合好的DNA樣品，按照表7順序，點(diǎn)樣到上樣孔中。表7-1重組質(zhì)粒（rp）電泳上樣順序（1至6組）泳道123456789樣品超螺旋markerpUC191-11-22-12-23-13-2超螺旋marker樣量(L)6.05.05.05.05.05.05.05.06.0泳道101112131415161718樣品pUC194-14-25-15-2超螺旋markerpUC196-16-2樣量(L)5.05.05.05.05.06.05.05.05

25、.0表7-2重組質(zhì)粒（rp）電泳上樣順序（7至10組）泳道123456789樣品超螺旋markerpUC197-17-28-18-29-19-2超螺旋marker樣量(L)6.05.05.05.05.05.05.05.06.0泳道101112樣品pUC1910-110-2樣量(L)5.05.05.0（7）開(kāi)啟電泳儀電源，選擇合適的電壓120V和時(shí)間40min；（8）將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連；（9）啟動(dòng)電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開(kāi)；（10）電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝膠，在紫外燈下觀察電泳條帶。15.重組質(zhì)粒的

26、酶切反應(yīng)（1）按表7建立重組質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系表7重組質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系成分及加樣順序大片段或高產(chǎn)量（小體系，L）中片段或高產(chǎn)量（中體系，L）小片段或高產(chǎn)量（大體系，L）ddH2O7.27.04.510×M Buffer 1.01.21.5Re-pUC191.03.08.0Hind（15U/L） 0.80.81.0共計(jì)10.012.015.0（2）加完樣品后，輕彈/用槍吹吸混勻，快速離心集液于管底；（3）37孵育2h后至于-20 保存。-20 保存。16.酶切重組質(zhì)粒的1.2%瓊脂糖凝膠電泳（1）正確組裝制膠槽、制膠板、18尺的樣品梳（制兩塊膠，插3個(gè)樣品梳）；（2）取80mL1&#

27、215;TAE至250mL紅蓋試劑瓶中；再稱0.96g瓊脂糖，倒入瓶中，輕旋混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無(wú)顆粒；待溶液冷卻至60左右，加入40L 1mg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，使EB溶液終濃度為0.5mg/mL，混勻后倒入制膠槽中，冷卻凝固待用（冷卻凝固時(shí)間要在30min以上）。（3）取40mL1×TAE至250mL紅蓋試劑瓶中；再稱0.48g瓊脂糖，倒入瓶中，輕旋混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至溶液澄清無(wú)顆粒；待溶液冷卻至60左右倒入制膠槽中，冷卻凝固待用（冷卻凝固時(shí)間要在30min以上）。（4）每組取4個(gè)Ep管，兩個(gè)做酶切反應(yīng)體系的電泳，兩個(gè)

28、做重組質(zhì)粒的電泳設(shè)為對(duì)照。酶切反應(yīng)體系的電泳：分別向兩管酶切反應(yīng)液中加入2l10x Loading buffer，輕彈/用槍吹吸混勻，快速離心集液于管底；重組質(zhì)粒的電泳：大片段重組質(zhì)粒：向Ep管中加入1l大片段重組質(zhì)粒，4l ddH2O和1l 6/10x Loading buffer；中、小片段重組質(zhì)粒：向Ep管中加入1l大片段重組質(zhì)粒，4l ddH2O和1l 6/10x Loading buffer；輕彈/用槍吹吸混勻，快速離心集液于管底。（5）待膠冷卻完畢，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳槽中事先加入1×TAE電泳緩沖液）將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE

29、至高出膠面約1mm；（6）將上述混合好的DNA樣品，按照表8順序，點(diǎn)樣到上樣孔中。表8-1 酶切重組質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系（大、中片段）泳道123456789樣品/HindPUC19/HindL3(rp)L3L4(rp)L4L6(rp)L6L7-1（rp)樣量(L)1056126146126泳道101112131415161718樣品L7-1L7-2(rp)L7-2L9-1(rp)L9-1L9-2L9-2(rp)L10(rp)L10樣量(L)12614612146614表8-2 酶切重組質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系（小片段 組1至組5）泳道123456789樣品/HindPUC19/HindL1-1(rp)

30、L1-1L1-2(rp)L1-2L2-1(rp)L2-1L2-2（rp)樣量(L)1056176176176泳道101112131415161718樣品L2-2L3(rp)L3L4(rp)L4L5(rp)L5PUC19/Hind/Hind樣量(L)176176171417510表8-3 酶切重組質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系（小片段 組5至組10）泳道123456789樣品/HindPUC19/HindL5(rp)L5L6(rp)L6L8-1(rp)L8-1L8-2（rp)樣量(L)1056176176176泳道101112131415161718樣品L8-2L10(rp)L10PUC19/Hind/Hi

31、nd樣量(L)17617510（7）開(kāi)啟電泳儀電源，選擇合適的電壓120V和時(shí)間40min；（8）將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連；（9）啟動(dòng)電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開(kāi)；（10）電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝膠，在紫外燈下觀察電泳條帶。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）圖1是酶切反應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳的圖，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。圖2是堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳的圖（表9顯示堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19 DNA的加樣順序），設(shè)為對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)主要分析實(shí)驗(yàn)組。圖1 酶切反應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳表9堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19 DNA

32、的加樣順序泳道123456789DNA樣品/marker超螺旋markerpUC19pUC19/Hind1組DNA樣品2組DNA樣品3組DNA樣品4組DNA樣品5組DNA樣品超螺旋marker樣量6L5L5L5L5L5L5L5L6L泳道1011121314151617DNA樣品/marker6組DNA樣品6組DNA樣品（陽(yáng)性對(duì)照）7組DNA樣品8組DNA樣品9組DNA樣品10組DNA樣品pUC19HindpUC19/ 樣量5L5L5L5L5L5L5L5L圖2 堿裂解法提取質(zhì)粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖1中泳道1和泳道3是/Hindmarker。用來(lái)指示pUC19質(zhì)粒被Hind 酶切后

33、的條帶位置，marker的條帶由下至上分別為：125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp和23130bp。而由于125bp和564bp片段太小并且marker的加樣量不夠，在圖中沒(méi)有明顯的指示條帶。有圖1可見(jiàn)，線性PUC19所在位置在2322bp和4361bp之間，被檢測(cè)的/Hind marker是可用的。圖1中泳道4的樣品是標(biāo)準(zhǔn)的pUC19，用于顯示沒(méi)有被酶切的pUC19質(zhì)粒的位置，有兩條帶，一條超螺旋的，一條線性的，線性條帶很淺，幾乎看不見(jiàn)；泳道5是被Hind酶切的標(biāo)準(zhǔn)pUC19質(zhì)粒，用于指示被酶切后和沒(méi)有被酶切的的pUC19質(zhì)粒的位置，兩

34、條亮帶分別是超螺旋和開(kāi)環(huán)的PUC19,超螺旋的在下方，兩條亮帶之間有很弱的酶切后的線性的PUC19，由圖可知，該質(zhì)粒的酶切效果并不好；而泳道6是要檢測(cè)的pUC19質(zhì)粒被Hind酶切后的電泳圖像,此處的PUC19酶切完全，只有一條帶。泳道7（圖1）到泳道16（圖1）是各組所配pUC19被Hind酶切后的產(chǎn)物條帶。方框（圖1）內(nèi)的是酶切后的線性pUC19條帶，方框下的條帶是沒(méi)有被酶切的超螺旋pUC19條帶。無(wú)論是酶切完全的條帶，還是沒(méi)有被酶切的條帶的位置都相對(duì)于泳道5（圖1）偏下，是因?yàn)槲覀冎八醦UC19質(zhì)粒狀態(tài)本身就不是很好（圖2），因?yàn)閴A變性法有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性，不適合大質(zhì)粒的抽

35、提。堿裂解法是很劇烈的方法，質(zhì)粒在堿性條件下會(huì)變性，時(shí)間一長(zhǎng)，這種變性就是不可逆的了,我們堿變性時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致質(zhì)粒DNA的變性不可逆，所以實(shí)際條帶位置和預(yù)估不一樣。泳道9（圖1）和泳道16（圖1）的被Hind 酶切產(chǎn)物的條帶較亮，是由于他們組之前提取的pUC19質(zhì)粒在電泳時(shí)就存在較多的在預(yù)期位置的條帶（圖2泳道6和泳道15）。其他組酶切條帶較弱的原因根所提取的pUC19質(zhì)粒狀態(tài)有關(guān)。酶切反應(yīng)的條帶明亮程度（圖1）和所提取的pUC19質(zhì)粒（圖2）的量的多少有關(guān)。大體來(lái)說(shuō)，所提取的pUC19質(zhì)粒（圖2）的量越多，酶切反應(yīng)的條帶（圖1）越量。但是也有特例，如：7組（圖1泳道13和圖2泳道12）的pU

36、C19質(zhì)粒提取量較多（圖2泳道12），但是酶切時(shí)的條帶很暗（圖1泳道13），這說(shuō)明他們組在加樣或者是之前的步驟存在DNA的損失。個(gè)別組在上樣孔處存在較弱的DNA條帶，是因?yàn)闆](méi)有除盡的蛋白質(zhì)把加樣孔堵住了，導(dǎo)致少數(shù)DNA無(wú)法從加樣孔跑到凝膠當(dāng)中去。個(gè)別組在加樣孔下方都存在較窄的DNA條帶，這種條帶是大片段的染色體DNA雜質(zhì)，DNA的分子量太大，電泳速率慢。連續(xù)均勻很弱的長(zhǎng)帶是堿變性法提取質(zhì)粒產(chǎn)生的染色體DNA碎片雜質(zhì)。（2）表顯示的是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后在平板上的生長(zhǎng)結(jié)果。表5 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)基涂布平板培養(yǎng)結(jié)果（單菌落平均數(shù)和菌落顏色）-試驗(yàn)組麥康凱+Amp50L×2有紅色菌落和

37、白色菌落，單菌落數(shù)為474100L×2有紅色菌落和白色菌落，單菌落數(shù)為884150L×2有紅色菌落和白色菌落，單菌落數(shù)為1120200L×2有紅色菌落和白色菌落，單菌落數(shù)為1440-轉(zhuǎn)化對(duì)照麥康凱+Amp50L×1只有紅色菌落-細(xì)胞對(duì)照麥康凱+Amp50L×1沒(méi)有長(zhǎng)菌麥康凱50L×1只有白色菌落，并且菌落數(shù)遠(yuǎn)大于-轉(zhuǎn)化對(duì)照的菌落數(shù)未轉(zhuǎn)化的受體菌（-細(xì)胞對(duì)照）不具有抗性，在含有氨芐的培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化了空載體的轉(zhuǎn)化子（-轉(zhuǎn)化對(duì)照）形成紅色菌落。未轉(zhuǎn)化的受體菌（-細(xì)胞對(duì)照）在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出白色菌落，并且菌落數(shù)遠(yuǎn)大于-轉(zhuǎn)化對(duì)照的菌落數(shù)

38、，是因?yàn)檗D(zhuǎn)化效率不為百分之百。在轉(zhuǎn)化了連接產(chǎn)物的平板里，有紅色菌落和白色菌落，紅色菌落是轉(zhuǎn)化的沒(méi)有連接成功的載體，白色菌落是連接成功的載體。轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子所占比例很少，約為6.6%（以50L的涂布平板為例），說(shuō)明重組效率低（重組效率=重組克隆數(shù)/總的克隆數(shù)=白色菌落數(shù)/（白色菌落數(shù)+紅色菌落數(shù)）。我們平板上的菌落密度大，說(shuō)明我們的轉(zhuǎn)化效率高，我們組的轉(zhuǎn)化效率為3.8×105（轉(zhuǎn)化效率=單菌落數(shù)/載體DNA（g），3.8×105=119×4÷（50×（5÷10）×（50÷1005）×10-3）。紅色

39、菌落周圍有霧狀沉淀產(chǎn)生，而白色菌落周圍有透明圈。以-細(xì)胞對(duì)照中的不長(zhǎng)菌落的培養(yǎng)基的顏色作為對(duì)照，沒(méi)加Amp的培養(yǎng)基顏色變黃，長(zhǎng)出大量紅色菌落的培養(yǎng)基顏色變紅。（3）圖3是菌落PCR的反應(yīng)體系電泳圖。圖3-1菌落PCR反應(yīng)體系的瓊脂糖凝膠電泳（1組至5組）圖3-2菌落PCR反應(yīng)體系的瓊脂糖凝膠電泳（6組至10組）上樣孔1（圖3-1和圖3-2）都是DL2000 marker,由上至下分別是2kb、1kb、750bp、500bp、250bp和100bp的條帶。對(duì)PCR擴(kuò)增片段大小起對(duì)照作用。在DL2000 marker的250bp和100bp的條帶之間的PCR產(chǎn)物片段大小為125bp,在500bp和

40、250bp的條帶之間的PCR產(chǎn)物片段大小為564bp。方框內(nèi)（圖3-1的上樣孔2，3，16，17；圖3-2的上樣孔10，11）的是陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照在左側(cè)，陰性對(duì)照在右側(cè)），只有圖3-2的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是典型的。據(jù)推測(cè)，圖3-2的陽(yáng)性對(duì)照的片段大小為125bp的DNA片段。圖3-1的上樣孔20有很寬的條帶，由于量太大，不像是PCR擴(kuò)增片段，很有可能是DNA雜質(zhì)；或者是挑的菌落量過(guò)大。圖3-2的上樣孔16和17有在500bp和750bp之間的片段，這種情況可能是由于眾多125bp或是564bp或是125bp和564bp自連產(chǎn)生的；也有可能是DNA雜質(zhì)。要通過(guò)進(jìn)一步酶切對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證

41、。沒(méi)有條帶的上樣孔中的樣品有兩種可能：沒(méi)有連入DNA片段的空載體，也就是挑的單菌落是紅色菌落；重組質(zhì)粒連入的DNA片段大小大于2000bp,在PCR反應(yīng)中沒(méi)有被擴(kuò)增出來(lái)。 我們組的上樣孔為12，13，14，15（圖3-2）。泳道13跑出了275bp的片段，泳道12，14和15沒(méi)有跑出條帶，可用于重組質(zhì)粒的電泳檢測(cè)。(4)圖4是重組質(zhì)粒（rp）的瓊脂糖凝膠電泳圖圖4-1重組質(zhì)粒（rp）的瓊脂糖凝膠電泳（1至6組）圖4-2重組質(zhì)粒（rp）的瓊脂糖凝膠電泳（7至10組）上樣孔1、9、15（圖4-1）和上樣孔1和11（圖4-2）是超螺旋marker（supercoiled DNA Ladder Mar

42、ker）。上樣孔2、10、16（圖4-1）和上樣孔2和12（圖4-2）是PUC19。超螺旋marker由8種超螺旋的質(zhì)粒DNA 構(gòu)成，DNA大小分別為：2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp；用來(lái)指示重組質(zhì)粒片段大小。PUC19空載體起對(duì)照作用，PUC19片段大小約為2.7kb,在泳道上跑出兩條帶，2,087 bp和3,049 bp之間的條帶是超螺旋的PUC19，5,026 bp處的條帶是構(gòu)象改變的（線性的）PUC19。上樣孔1和2沒(méi)有條帶可能是：上樣時(shí)樣品并沒(méi)有點(diǎn)進(jìn)上樣孔；上樣時(shí)樣品彌

43、散或是點(diǎn)樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致樣品彌散。正常情況來(lái)說(shuō)，如果不考慮質(zhì)粒的構(gòu)象變化，除超螺旋marker外，其他泳道中的DNA只會(huì)跑出一條帶。如考慮質(zhì)粒的構(gòu)象變化，泳道中的DNA會(huì)跑出三條帶，由下往上依次是：超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)。大多數(shù)泳道的條帶都在預(yù)期范圍之內(nèi)，但是泳道7、11、17（圖4-1）和泳道4、7（圖4-2）跑出了多條帶，原因是他們?cè)谔舻膯慰寺〔患?。DNA被Hind沒(méi)切成酶切出8個(gè)片段。片段長(zhǎng)度分別為125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp和23130bp。當(dāng)插入到PUC19載體中時(shí)，其片段大小應(yīng)當(dāng)加上2.7kb,而23130bp的片段太大，并

44、且23130bp片段末端和4361bp末端可以通過(guò)氫建相連形成粘性末端。所以很難與PUC19載體再連接。因此，在電泳時(shí)出現(xiàn)的重組質(zhì)粒（rp）片段大小應(yīng)的可能情況為2.8kb、3.26kb、4.7kb、5kb、7kb、9.3kb和12kb。實(shí)際連入片段大小還需通過(guò)酶切驗(yàn)證。我們組的條帶在上樣孔5和6（圖4-2），條帶大小分別在2.8kb和3.26kb（插入片段大小分別為125bp和564bp）的位置，屬于小片段。連接產(chǎn)物的大片段有：圖4-1的泳道7和17，圖4-2的泳道4和7；中片段有：圖4-1的泳道11，圖4-2的泳道3、8和9；其余的都是小片段。依據(jù)不同的片段大小建立不同的沒(méi)切反應(yīng)體系。有些

45、目的片段的下方還存在很弱的條帶（如圖4-1的泳道2、3、4），這是因?yàn)閴A變性法有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性，不適合大質(zhì)粒的抽提。堿裂解法是很劇烈的方法，質(zhì)粒在堿性條件下會(huì)變性，時(shí)間一長(zhǎng)，這種變性就是不可逆的了,我們堿變性時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致質(zhì)粒DNA的變性不可逆，所以實(shí)際條帶位置和預(yù)估不一樣。（5）圖5是酶切重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖圖5-1 酶切重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳（大、中片段）圖5-2 酶切重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳（小片段 組1至組5）圖5-3 酶切重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳（小片段 組5至組10）圖5-1的上樣孔1，圖5-2的上樣孔1和18，圖5-3的上樣孔1和14都是/Hindmarker

46、，用來(lái)指示酶切后重組質(zhì)粒的插入片段，marker的條帶由下至上分別為：125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp和23130bp。而由于125bp和564bp片段太小并且marker的加樣量不夠，在圖中沒(méi)有明顯的指示條帶。圖5-1的上樣孔2，圖5-2的上樣孔2和17，圖5-3的上樣孔2和13是PUC19/Hind，起對(duì)照作用，用來(lái)指示酶切后載體片段大小。重組質(zhì)粒是超螺旋DNA，而酶切后的片段是線性的，所以重組質(zhì)粒的大小相對(duì)于PUC19/Hind偏下。各組的重組質(zhì)粒被酶切后都出現(xiàn)了大小為2.7kb的片段。圖5-1的泳道4，8，10和14是大片段酶

47、切后的結(jié)果，由圖可知，他們插入重組質(zhì)粒的DNA片段大小為6657bp。泳道4在2.7kb下方還有一條帶，這是由于堿變性法提質(zhì)粒導(dǎo)致部分質(zhì)粒結(jié)構(gòu)改變而產(chǎn)生的條帶。泳道10跑出了marker的效果，可能原因有：是他們?cè)诮⒚盖畜w系時(shí)時(shí)混入了/Hindmarker；他們的重組質(zhì)粒就是DNA（或DNA的部分片段）與PUC19的重組子，不過(guò)這種可能性很小，只有在Hind的活性很低的情況下才可能發(fā)生。所配的膠不勻。圖5-1的泳道6，12，15和18是中片段酶切后的結(jié)果，由圖可知，他們插入重組質(zhì)粒的DNA片段大小為2322kb或是2027kb（泳道18）。圖5-2酶切后大小為564bp的片段很明顯（方框內(nèi)）

48、，但是125bp的片段不明顯（泳道12和14均沒(méi)有顯現(xiàn)出來(lái)），可能是樣品彌散了。并且可以判斷泳道8所提的質(zhì)粒很不好，因?yàn)樗腜UC19的條帶并沒(méi)有在PUC19/Hind對(duì)照的地方出現(xiàn)。圖5-2酶切后大小為125bp的片段很明顯（方框內(nèi)），564bp的片段也很明顯（箭頭所指）。本組的樣品在泳道7，8，9，10（圖5-3），酶切后出現(xiàn)123bp的條帶（泳道8）和564bp的條帶（泳道10）。重組質(zhì)粒（泳道1，9）上方的條帶是超螺旋質(zhì)粒的線性和開(kāi)環(huán)變構(gòu)形式。泳道上的白色模糊淺帶是DNA堿變性提取質(zhì)粒的DNA雜質(zhì)。3.討論1.Hind酶儲(chǔ)存液中含有Tris-HCl(pH=7.5)、KCl、EDTA、B

49、SA、DTT和甘油。Tris-HCl(pH=7.5)是一種緩沖液，能保持酶切體系中DNA的穩(wěn)定性；EDTA能與二價(jià)陽(yáng)離子絡(luò)合而降低DNase的活性，防止DNA分解；BSA是牛血清蛋白，通過(guò)提高溶液中蛋白質(zhì)濃度而對(duì)酶起保護(hù)作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性。DTT是一種還原劑，起到穩(wěn)定酶活性的作用。它通過(guò)還原蛋白質(zhì)之間的二硫鍵使已發(fā)生聚集的晶體蛋白分子解離成單個(gè)蛋白質(zhì)分子。甘油可以作為防凍劑，能使低溫下保存的蛋白質(zhì)保持活性。2.酶切反應(yīng)體系要注意DNA加量。DNA加量過(guò)多會(huì)引入過(guò)多雜質(zhì)影響，；DNA量少則載體量少，酶切條帶不好看。根據(jù)所提取的DNA濃度來(lái)權(quán)衡DNA所加得量。酶切

50、反應(yīng)體系中，酶的加入量不應(yīng)該超過(guò)反應(yīng)體系的10%，如果限制酶過(guò)量會(huì)出現(xiàn)星號(hào)作用，產(chǎn)生非特異性酶切。3.注意酶切反應(yīng)的加樣順序：量多的先加，量少的后加。因?yàn)闊o(wú)法避免每次加樣的時(shí)候槍頭會(huì)沾有管內(nèi)的液體，而量多的損失一些沒(méi)有很大的關(guān)系，量少的再損失就會(huì)嚴(yán)重影響精確度；精貴的東西(如酶和DNA)后加，以防中間出錯(cuò)，造成浪費(fèi)。酶往往對(duì)溫度敏感，容易在高溫下失活，所以一般酶要最后加。要使DNA電泳的條帶好看，至少需要100ng的DNA上樣量，所以根據(jù)pUC19 （商品）的濃度0.5g / l可以算出加樣量至少為4.0l（0.5g / l ×4l ）÷80l = 25 ng /l）。同理

51、可以算出DNA（商品）的加樣量。4.影響DNA連接的因素有：溫度：理論上連接反應(yīng)的最佳溫度是37，此時(shí)連接酶的活性最高。但37時(shí)粘性末端分子形成的氫鍵配對(duì)結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此我們選擇在1216進(jìn)行連接。該最適溫度下，既可以最大限度發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。時(shí)間：在最適溫度下，一般粘性末端的連接30min即可取得較好的效果，連接60min則更完全些，為了實(shí)驗(yàn)方便有時(shí)也在4條件下連接過(guò)夜。而對(duì)于平頭末端的連接，最好在37條件下連接，并且時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。而更為普遍的條件是：16 連接過(guò)夜。酶單位（Takara)：在20ml的連接發(fā)應(yīng)體系中，6mg的 DNA-HindIII的分解物在1

52、6下反應(yīng)30min時(shí)，有90%以上的DNA片段進(jìn)行連接的酶量為1U。酶量連接實(shí)驗(yàn)中DNA的濃度比酶量定義狀態(tài)下低很多倍，所以實(shí)際酶量是過(guò)量的。平末端連接要比粘性末端連接所需酶量大10100倍，因此廠商提供的連接酶濃度往往是高濃度的，常規(guī)粘性末端的連接反應(yīng)體系中酶量的加入往往是過(guò)量的。緩沖體系（buffer)：Tris-HCl提供連接所需的合適pH值; DTT提供還原力; ATP促進(jìn)連接反應(yīng)的有效進(jìn)行。緩沖液的反復(fù)凍融會(huì)引起ATP的分解，從而影響連接效率。為了保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，一般大劑量的緩沖液可以分裝成小管保存并使用。DNA濃度：連接反應(yīng)中DNA的濃度一般為0.11pmol/ml。其中載體濃

53、度過(guò)高會(huì)增加而載體分子間的環(huán)化，而過(guò)低則獲得重組分子的效率低，甚至導(dǎo)致載體分子的自身環(huán)化。外源DNA則依據(jù)連接類型的不同加入載體濃度的110倍。5.T4 DNA ligase的儲(chǔ)存液除了含有Tris-HCl(pH=7.5)、DTT、KCl、EDTA、甘油意外，還含有Mg2+和ATP。Mg2+是T4 DNA ligase作用的輔因子，而ATP為反應(yīng)提供能量。6.向培養(yǎng)基里面加氨芐時(shí)，保證加入原液所占體積為使用液的1/1000,所以250ml的麥康凱養(yǎng)基里面應(yīng)該加入250l的Amp。要等待高壓過(guò)的培養(yǎng)基降低到適宜溫度再加氨芐，否則氨芐會(huì)失活。倒平板時(shí)要注意無(wú)菌操作。7.制備E. coli感受態(tài)細(xì)胞時(shí)要保證無(wú)菌和4的條件。要在4的條件下制備感受態(tài)細(xì)胞是因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)胞膜的通透性變大而變得脆弱，低溫能夠提高感受態(tài)細(xì)胞的存活率。8