基因工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序目標(biāo)的獲取從基因文庫，PCR擴(kuò)增，人工合成載體構(gòu)建目的基因啟動(dòng)子終止子和標(biāo)記基因目標(biāo)導(dǎo)入目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)檢測鑒定基因探針法，生物學(xué)水平鑒定等1目標(biāo)獲取 人工合成 技術(shù)比較2載體構(gòu)建 組成 功能 步驟3目標(biāo)導(dǎo)入 轉(zhuǎn)化 受體種類 導(dǎo)入方法4檢測鑒定1目標(biāo)獲取編輯從基因文庫中獲取基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫?；蛭膸斓姆N類：1、基因組文庫；2、部分基因文庫。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR含義：是一

2、項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核糖合成技術(shù)。全稱是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR原理：DNA雙鏈復(fù)制。前提條件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。擴(kuò)增過程：目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)多次。結(jié)果：每次循環(huán)后的目的基因的量增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增。人工合成如果基因較小，核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。技術(shù)比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)基因克隆場所細(xì)胞核生物體外細(xì)胞內(nèi)酶解旋酶、DNA聚合酶Taq酶限制酶、連接酶載體不需要不需要需要遵循原則堿基互補(bǔ)配對堿基互補(bǔ)配對堿基互補(bǔ)配對結(jié)

3、果DNA分子DNA分子片段DNA分子片段2載體構(gòu)建編輯組成1、目的基因；2、啟動(dòng)子；3、終止子；4、標(biāo)記基因。功能1、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代；2、使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。步驟、用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使之出現(xiàn)一個(gè)黏性末端切口。、用同種限制酶切割目的基因，產(chǎn)生相同的黏性末端。、將目的基因片段插入質(zhì)粒切口，加入適量DNA連接酶，使目的基因與質(zhì)粒形成重組質(zhì)粒。、基因表達(dá)載體的構(gòu)成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因3目標(biāo)導(dǎo)入編輯轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。受體種類、微生物：細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞：卵細(xì)胞、受精卵、體細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞：

4、受精卵、胚胎細(xì)胞導(dǎo)入方法、微生物：感受態(tài)細(xì)胞法、感受態(tài)細(xì)胞：指細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)過Ca2+處理后，細(xì)胞壁透性增強(qiáng)，能夠吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。、過程：CaCl2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。、植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌：土壤微生物，易感染雙子葉植物和裸子植物；對大多數(shù)單子葉植物沒有感染力。、Ti質(zhì)粒的T_DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。、過程：目的基因插入T_DNA，T_DNA進(jìn)入農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞。、動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射法、目的基因表達(dá)載體經(jīng)過提純備用，取得受體動(dòng)物的卵（或受精卵）備

5、用。、采用顯微注射技術(shù)將目的基因表達(dá)載體注射到卵（或受精卵）中。、培養(yǎng)液培養(yǎng)成為早期胚胎。、將早期胚胎移植到雌性動(dòng)物子宮內(nèi)，發(fā)育成新個(gè)體。4檢測鑒定編輯、檢測：、導(dǎo)入檢測：檢測受體細(xì)胞染色體DNA上是否含有目的基因。DNA分子雜交法（DNA探針法）。、表達(dá)檢測：檢測目的基因是否完成轉(zhuǎn)錄出mRNA。分子雜交法檢測RNA。檢測目的基因是否完成表達(dá)翻譯成蛋白質(zhì)。提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原抗體雜交。、鑒定：個(gè)體生物學(xué)水平鑒定，鑒定抗性等。課時(shí)達(dá)標(biāo)訓(xùn)練(二)基因工程的基本操作程序(時(shí)間：25分鐘；滿分：50分)一、選擇題(每小題2分，共20分)1下列不屬于獲取目的基因方法的是()A利用DNA連接酶

6、復(fù)制目的基因B利用DNA聚合酶復(fù)制目的基因C從基因文庫中獲取目的基因D利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2在基因工程的操作過程中，獲得重組質(zhì)粒不需要()DNA連接酶同一種限制酶RNA聚合酶具有標(biāo)記基因的質(zhì)粒目的基因四種脫氧核苷酸A B C D3下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的描述，不正確的是()A基因槍法導(dǎo)入植物體細(xì)胞的方法比較經(jīng)濟(jì)有效B顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中采用最多的方法 C大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是：使細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變D農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞最常用的方法4下列技術(shù)依據(jù)DNA分子雜交原理的是()觀察DNA在細(xì)胞中的分布檢測目的基因是否導(dǎo)入細(xì)胞檢測目的基因是否完全轉(zhuǎn)錄并翻譯檢測目

7、的基因是否進(jìn)行轉(zhuǎn)錄A B C D5.如圖為表達(dá)載體的模式圖，若結(jié)構(gòu)X是表達(dá)載體所必需的，則X最可能是()A氨芐青霉素抗性基因B啟動(dòng)子C限制酶DDNA連接酶6基因工程利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA。限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)分別是Bgl 、EcoR 和Sau3A 。下列分析錯(cuò)誤的是()A構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用Bgl和Sau3A切割目的基因和P1噬菌體載體B構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用EcoR和Sau3A切割目的基因和P1噬菌體載體C圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoR切割后，含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)D用EcoR切割目的基因和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產(chǎn)生一種重

8、組DNA7利用外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，可生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品。下列選項(xiàng)中能說明目的基因完成了在受體細(xì)胞中表達(dá)的是()A棉花二倍體細(xì)胞中檢測到細(xì)菌的抗蟲基因B大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNAC山羊乳腺細(xì)胞中檢測到人生長激素DNA序列D酵母菌細(xì)胞中提取到人干擾素蛋白8(江蘇高考)下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，錯(cuò)誤的是(多選)()A切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均特異性地識別6個(gè)核苷酸序列BPCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)C載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因D抗蟲基因即使成功地插入到植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)9用某人的胰島素基因制成的DNA探針，能與

9、之形成雜交分子的是()該人胰島A細(xì)胞中的DNA該人胰島B細(xì)胞中的mRNA該人胰島A細(xì)胞中的mRNA該人肝細(xì)胞中的DNAA B C D10某研究所的研究人員將生長激素基因通過質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，使其表達(dá)，產(chǎn)生生長激素。已知質(zhì)粒中存在兩個(gè)抗性基因：A是抗鏈霉素基因，B是抗氨芐青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大腸桿菌不帶有任何抗性基因。下列敘述正確的是()A導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒一定為重組質(zhì)粒BRNA聚合酶是構(gòu)建該重組質(zhì)粒必需的工具酶C可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒D在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中不能生長，但在含鏈霉素培養(yǎng)基中能生長的可能是符合生產(chǎn)要求的大腸桿菌二、非選擇

10、題(共30分)11(10分)農(nóng)業(yè)科技工作者在煙草中找到了一種抗病基因，現(xiàn)擬采用基因工程技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)入棉花，培育抗病棉花品系。請回答下列問題：(1)為了能把該抗病基因轉(zhuǎn)入到棉花細(xì)胞中，常用的載體是_。(2)要使載體與該抗病基因連接，首先應(yīng)使用_進(jìn)行切割。假如載體被切割后，得到的分子末端序列為，則能與該載體連接的抗病基因分子末端是_(填序號)。A. B. C. D.(3)切割完成后，用_酶將載體與該抗病基因連接起來，連接后得到的DNA分子稱為_。(4)再將連接得到的DNA分子導(dǎo)入農(nóng)桿菌，然后用該農(nóng)桿菌去_棉花細(xì)胞，利用植物細(xì)胞具有的_性進(jìn)行組織培養(yǎng)，從培養(yǎng)出的植株中_出抗病的棉花。(5)該抗病基

11、因在棉花細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物是()A淀粉 B脂類 C蛋白質(zhì) D核酸(6)轉(zhuǎn)基因棉花獲得的_是由該表達(dá)產(chǎn)物來體現(xiàn)的。12(12分)科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)成功。請據(jù)圖回答問題：(1)該基因工程操作是采取_的方法獲取目的基因(即_基因)的。(2)圖中DNA以_為模板，_形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的目的基因。(3)代表_，在它的作用下將質(zhì)粒(_DNA)切出黏性末端。(4)圖中代表_，它往往含有_基因，以便對目的基因進(jìn)行檢測。(5)圖中表示_，為使此過程順利進(jìn)行，一般需將大腸桿菌用_處理，以增大其細(xì)胞壁的_。(6

12、)圖中表示_隨大腸桿菌的繁殖而進(jìn)行增殖，此基因在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的標(biāo)志是_。13(8分)科學(xué)家通過基因工程方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉株細(xì)胞內(nèi)，并成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株抗蟲棉。其過程大致如圖所示。根據(jù)題意，回答下列問題：(1)基因工程的操作程序主要包括的四個(gè)步驟是：_、_、_、_。(2)Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA中是利用TDNA_的特點(diǎn)。(3)Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉株細(xì)胞內(nèi)并成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)的過程，在基因工程中稱為_。(4)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有很多種，該題中涉及的是_。(5)目的基因能否在棉

13、株體內(nèi)穩(wěn)定存在和表達(dá)其遺傳特性的關(guān)鍵是_，這需要通過檢測才能知道，檢測常采用的方法是_。答 案1選A對目的基因(DNA片段)進(jìn)行復(fù)制利用的是DNA聚合酶而不是DNA連接酶，DNA連接酶是將DNA片段連接時(shí)所使用的酶，DNA聚合酶是將單個(gè)脫氧核苷酸連接成一條鏈所使用的酶。2選A重組DNA分子包括兩部分：載體DNA和目的基因DNA。同一種限制酶切割載體DNA和目的基因DNA，DNA連接酶將兩者連接，而載體上往往帶有標(biāo)記基因。RNA聚合酶用于RNA的形成，四種脫氧核苷酸則用于DNA的形成。3選A目的基因?qū)胫参矬w細(xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，該方法比較經(jīng)濟(jì)有效，此外還有基因槍法和花粉管通道法；目的基

14、因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法是顯微注射法；大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法就是用Ca2處理細(xì)胞，使細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，完成轉(zhuǎn)化過程。4選C觀察DNA在細(xì)胞中的分布的基本方法是利用甲基綠對細(xì)胞中的DNA分子進(jìn)行染色，再利用顯微鏡進(jìn)行觀察。目的基因是否導(dǎo)入以及是否轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA，一般是利用放射性同位素作標(biāo)記(標(biāo)記目的基因)，是利用DNA分子雜交原理來實(shí)現(xiàn)的。最后檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)，其方法很多，一般是利用抗原抗體雜交的原理來實(shí)現(xiàn)。5選B由X的位置可以判斷其為啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是表達(dá)載體所必需的，功能是啟動(dòng)插入基因的轉(zhuǎn)錄過程。氨芐青霉素抗性基因可以作為標(biāo)記基因，但不是必需的標(biāo)記基因。限制酶和DN

15、A連接酶都不是表達(dá)載體所需要的。6選D從圖甲看出，用EcoR切割目的基因后兩端各有一切口，與圖乙中EcoR切口對接時(shí)，可有兩種可能，即可產(chǎn)生兩種重組DNA。7選D目的基因的表達(dá)是指在受體細(xì)胞中產(chǎn)生了目的基因所控制合成的蛋白質(zhì)。在受體細(xì)胞中檢測到目的基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，并不能表明目的基因已經(jīng)成功表達(dá)。8選ABC限制性核酸內(nèi)切酶大多是特異性識別6個(gè)核苷酸序列，但也有識別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成的，A錯(cuò)誤；PCR中耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用，B項(xiàng)錯(cuò)誤；載體質(zhì)粒上抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇，不是抗生素合成基因，C錯(cuò)誤；目的基因?qū)肓耸荏w細(xì)胞不一定

16、就都能正常表達(dá)，D正確。9選C人的胰島素基因存在于人的所有體細(xì)胞中，因此該人胰島A細(xì)胞和肝細(xì)胞中均含有胰島素基因，可與用胰島素基因制成的DNA探針形成雜交分子。該人胰島B細(xì)胞中的mRNA有一部分是由胰島素基因轉(zhuǎn)錄形成的，也能與用胰島素基因制成的DNA探針形成雜交分子。10選D基因操作過程中，用同一種限制酶分別切割生長激素基因所在的DNA分子和質(zhì)粒后，會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，黏性末端連接時(shí)，目的基因和目的基因、目的基因和質(zhì)粒、質(zhì)粒和質(zhì)粒都可能連接，因此，導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒不一定為重組質(zhì)粒。構(gòu)建該重組質(zhì)粒必需的工具酶是限制酶和DNA連接酶。目的基因插入到基因B中后形成的重組質(zhì)粒的抗氨芐青霉素基因被破壞，故導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌對氨芐青霉素不具有抗性，對鏈霉素仍具有抗性。11答案：(1)Ti質(zhì)粒(2)限制酶A(3)DNA連接重組DNA(4)感染全能篩選(5)C(6)抗病性狀12答案：(1)人工合成胰島素(2)胰島素信使 RNA反轉(zhuǎn)錄(3)限制酶 環(huán)狀(4)重組DNA分子 標(biāo)記(5)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 Ca2通透性(6)目的基因大