熒光定量PCR詳細(xì)流程和問題解析(共11頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上熒光定量PCR詳細(xì)流程和問題解析普通PCR與熒光定量PCR技術(shù)區(qū)別？簡(jiǎn)單的講PCR技術(shù)最早是用于擴(kuò)增一段特異的PCR片段，用于克隆、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)，后來也將其用于樣本中特異的PCR片段有無或非很粗的相對(duì)定量，而熒光定量PCR技術(shù)則是為了測(cè)定樣本中特異的PCR片段相對(duì)及絕對(duì)量，是一種測(cè)定特異的PCR片段含量的方式。如測(cè)定病人樣本中病原體的含量、實(shí)驗(yàn)樣本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人講過普通PCR后，通過電泳也可以進(jìn)行定量，其實(shí)是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。近兩年沒有人再講這類的話了。Sybr Green、Taqman、Molecular bea

2、con、LUX這些方法如何選擇？從實(shí)驗(yàn)成本來講，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一點(diǎn)Sybr Green I 熒光染料即可，其信號(hào)強(qiáng)度也很好，還可以進(jìn)行融解曲線分析等，但缺點(diǎn)是只能在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行一種PCR反應(yīng)的檢測(cè)，另一個(gè)問題是非特異性擴(kuò)增會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)然也有一些技術(shù)解決這些問題，后面會(huì)講到。對(duì)于研究人員來講，如果需要檢測(cè)的基因很多，而每個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行一種PCR反應(yīng)的檢測(cè)可以滿足實(shí)驗(yàn)要求，則Sybr Green是最好的選擇。如果需要進(jìn)行多通道實(shí)驗(yàn)，即在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行2種或以上的反應(yīng)，則要選擇其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，這

3、兩種都是探針的方式，由于增加了探針的特異性，因此其擴(kuò)增曲線反映的就是特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線，不含有非特異性擴(kuò)增的成分。因此商業(yè)用途的檢測(cè)試劑盒大都采用這一技術(shù)，以減少非特異性產(chǎn)物造成錯(cuò)誤結(jié)論的可能性。其缺點(diǎn)在于探針成本較高，有時(shí)設(shè)計(jì)的探針并不合適，有造成損失的可能性。并且要進(jìn)行較多的實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。這兩種探針技術(shù)用于商業(yè)目的時(shí)都有專利問題，據(jù)說取得Molecular beacon的許可權(quán)的成本相對(duì)較低，但只是據(jù)說。另一種值得一提的是LUX探針，它也可進(jìn)行多通道實(shí)驗(yàn)，但它沒有Taqman和Molecular beacon方法的增加探針特異性的功能，因此只能是一種折中的方案，如果不考慮多通道實(shí)驗(yàn)，則

4、不如Sybr Green法選擇單通道實(shí)驗(yàn)還是多通道實(shí)驗(yàn)？這是要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來選擇的，如果有一個(gè)、兩個(gè)或是三個(gè)基因要進(jìn)行比較，并用看家基因進(jìn)行對(duì)照，可以考慮選擇多通道實(shí)驗(yàn)。多通道實(shí)驗(yàn)的好處是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多，一是條件的優(yōu)化比較麻煩，即多種PCR反應(yīng)以及探針要在同一個(gè)反應(yīng)條件下進(jìn)行，并且效率都要比較高，另一個(gè)困難是要求相互之間沒有干擾，因?yàn)楦蓴_會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。還有一個(gè)困難是當(dāng)一個(gè)基因的模板數(shù)顯著大于其他基因時(shí)，因?yàn)楣灿煤塑账岬荣Y源的原因，會(huì)讓模板數(shù)少的基因的定量值變小或變?yōu)榱?。因此一般兩通道的?shí)驗(yàn)比較多些，即一個(gè)基因進(jìn)行多樣本比較，用看家基因進(jìn)行對(duì)照?？梢钥闯觯绻?/p>

5、單通道實(shí)驗(yàn)可以解決問題，就不要選擇多通道實(shí)驗(yàn)了。三個(gè)以上的基因進(jìn)行比較時(shí)就最好用單通道。因?yàn)橐话愕膬x器最多也只有四個(gè)通道，就是有更多的通道，實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化也是足夠麻煩了。雙通道實(shí)驗(yàn)時(shí)如何克服反應(yīng)條件、干擾以及模板數(shù)差別很大等困難？對(duì)于反應(yīng)條件的優(yōu)化，可通過兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來優(yōu)化，主要是復(fù)性溫度，可用PCR儀的溫度梯度功能來選擇，然后找到一個(gè)合適的復(fù)性溫度。對(duì)于如何確定是否存在相互干擾，則要通過兩個(gè)獨(dú)立的單通道實(shí)驗(yàn)與雙通道實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較，如果差別不大，則表明沒有干擾。至于模板數(shù)差別很大的問題，可以通過降低引物濃度的方法來實(shí)現(xiàn)，即primer limited，在一般的PCR反應(yīng)中，引物的

6、濃度是足夠高的，基本上可以將反應(yīng)液中的核苷酸全部消耗盡，在優(yōu)化引物濃度時(shí)，用不同的引物濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，找到不影響反應(yīng)的C值的最低引物濃度。這樣在實(shí)際反應(yīng)中，模板數(shù)高的基因在引物耗盡后，反應(yīng)液中仍然有足夠的核苷酸等用于另一個(gè)基因的反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)中的幾個(gè)注意事項(xiàng)1、 引物設(shè)計(jì)最好用相關(guān)的軟件來進(jìn)行設(shè)計(jì)，考慮引物自身回折、錯(cuò)配、引物二聚體、復(fù)性溫度、產(chǎn)物變性溫度等問題，其中產(chǎn)物的變性溫度是大家不太關(guān)心的問題，但有些產(chǎn)物在一般的95度條件下不能充分解鏈，會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2、 引物所設(shè)計(jì)的片斷一定要有足夠的特異性，選擇好片段后，最好到互聯(lián)網(wǎng)中進(jìn)行相關(guān)的搜索，看在樣本的基因組有沒有相擬的基因以及假基因等

7、，如果有，則可選擇特異性更高的區(qū)域。3、 在進(jìn)行mRNA表達(dá)量的定量，可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮基因組的污染問題，即在引物設(shè)計(jì)時(shí)讓兩個(gè)引物跨一個(gè)內(nèi)含子，這樣基因組污染所造成的擴(kuò)增可以區(qū)別出來，或因?yàn)槠芜^大而不能擴(kuò)增4、 由于mRNA表達(dá)量的定量有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過程，如果逆轉(zhuǎn)錄是用poly（T）作引物，則設(shè)計(jì)的片段盡量靠近poly（A），以免逆轉(zhuǎn)錄的效率影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果用特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，則要考慮引物區(qū)是否存在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的問題5、 產(chǎn)物片段的大?。憾縋CR一般產(chǎn)生片段都不大，不會(huì)超過600bp。Sybr Green法一般選擇250-600bp，過大會(huì)影響到PCR擴(kuò)增的效率，過小則很難通過

8、融解曲線與引物二聚體分開，但并不是絕對(duì)的。Taqman法的擴(kuò)增片段都很小，幾十或是100多，這是其原理造成的。Molecular beacon法對(duì)片段大小的要求不高，只要不是太長(zhǎng)即可。Sybr Green法的實(shí)驗(yàn)策略：實(shí)驗(yàn)可分為三個(gè)階段，即實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化、預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)。一、 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化階段，這一階段是最花時(shí)間的，1、 要找到一個(gè)陽性的模板，可以是克隆有基因質(zhì)粒、強(qiáng)陽性樣本或純化的PCR產(chǎn)物等。有了陽性的模板才能進(jìn)行最基本的定量擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，如果有普通PCR的實(shí)驗(yàn)條件，也可以此為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、 擴(kuò)增出的產(chǎn)物要通過電泳方法確定其大小，以確認(rèn)定量PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物是你的目的基因，有些用戶就發(fā)生

9、過優(yōu)化了幾天的條件才發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段的大小不對(duì)，不是自己想要的基因。當(dāng)然，能測(cè)個(gè)序什么的最好。并通過融解曲線實(shí)驗(yàn)來確定產(chǎn)生的Tm值以及所用的變性溫度是否已經(jīng)足夠，個(gè)別情況下會(huì)出來解鍵不充分的現(xiàn)象。3、 有了基本的PCR條件后，要將陽性模板進(jìn)行倍比稀釋，一般用10倍稀釋。將稀釋的模板帶上陰性對(duì)照，分成多份進(jìn)行溫度梯度實(shí)驗(yàn)，對(duì)復(fù)性溫度進(jìn)行優(yōu)化，以找出復(fù)性溫度范圍，復(fù)性溫度最好能滿足以下條件：高中低模板濃度下PCR擴(kuò)增效率都很高、陰性模板沒有擴(kuò)增。選擇滿足條件的中間溫度，這樣可以提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，不會(huì)因?yàn)闃颖竟茉诩訜崮K中的位置不同而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4、 如果找不到合適的條件，如引物二聚體過多，可對(duì)引物濃

10、度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進(jìn)行優(yōu)化，然后再進(jìn)行復(fù)性溫度梯度實(shí)驗(yàn)。其中Mg2+離子濃度、DMSO含量都會(huì)影響Tm值以及所用的變性溫度。二、 預(yù)實(shí)驗(yàn)階段按照優(yōu)化的條件對(duì)所需要分析的樣本做一個(gè)沒有重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣本做一個(gè)10倍和100倍稀釋的實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的主要有兩個(gè)，一是了解樣本的模板濃度范圍，如果有樣本的模板濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，如過高或過低，則可能要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行重新優(yōu)化，當(dāng)然，如果過高和過低不影響你的實(shí)驗(yàn)結(jié)論則可定為高于多少或低于多少，直接進(jìn)行外推是不科學(xué)的。另一個(gè)目的看樣本中是否有PCR抑制物的影響，如果每個(gè)樣本的定量結(jié)果與其10及100倍稀釋后的樣本的結(jié)果相同，則表明沒有抑制

11、物的影響，如果不同，如原倍結(jié)果為零，而10及100倍稀釋后的樣本的結(jié)果為陽性，則表明樣本中PCR抑制物濃度較高?？捎闷?0及100倍稀釋后的樣本進(jìn)行定量。有幾個(gè)用戶發(fā)現(xiàn)過實(shí)驗(yàn)為陰性的樣本在其10及100倍稀釋后的樣本為陽性的，也許有更多用戶沒有進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)，得到了錯(cuò)誤的結(jié)論。因?yàn)闃颖綬NA的提取試劑中經(jīng)常有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，清洗不干凈就會(huì)影響到定量PCR反應(yīng)。三、 正式實(shí)驗(yàn)階段然后就可以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)了，只需要將每個(gè)樣本作三個(gè)或更多的重復(fù)即可以了。有抑制物的樣本先進(jìn)行稀釋，計(jì)算濃度時(shí)不要忘記就行了。最后就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析了，個(gè)別樣本中離群的數(shù)值可以刪除。Sybr Green法的注意事項(xiàng)

12、1、 最好按照上面提到策略進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以免造成不必要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，從而降低實(shí)驗(yàn)成本2、 Sybr Green I一般是先將母液用DMSO進(jìn)行稀釋100倍，最終的使用濃度為4000-10000分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀釋倍數(shù)不同，可通過實(shí)驗(yàn)來證明，但高濃度的Sybr Green I肯定會(huì)影響PCR反應(yīng)。另外用水稀釋后的Sybr Green I保存的時(shí)間很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反復(fù)凍融會(huì)影響性能，但原因不明。3、 在對(duì)引物濃度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進(jìn)行優(yōu)化后仍得不到滿意的結(jié)果，特別是引物二聚體很多時(shí)，可以考慮更換引物，因?yàn)橐锍杀镜停鴥?yōu)化實(shí)驗(yàn)成本很高

13、。4、 當(dāng)有少量引物二聚體影響熒光結(jié)果時(shí)，可以提高熒光讀板時(shí)的溫度來消除引物二聚體的影響，如將讀板時(shí)的溫度提高到82度，此時(shí)引物二聚體已經(jīng)解鏈而產(chǎn)物沒有解鏈。但引物二聚體濃度很高時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響PCR反應(yīng)，消除引物二聚體的影響也沒有用。5、 大家都知道進(jìn)行絕對(duì)定量需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，有些用戶認(rèn)為進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)就不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線了，可以通過2C（t）來計(jì)算，但這一計(jì)算是有條件的，即所有熒光定量PCR擴(kuò)增的效率都接近于100%，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。但大多數(shù)用戶并沒有進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)就直接用2C（t）來計(jì)算了。這是錯(cuò)誤的，會(huì)得到錯(cuò)誤結(jié)論。6、 無論是使用自配的試劑還是用商業(yè)的熒光定量試劑盒，最好買夠試劑，以免進(jìn)行

14、預(yù)實(shí)驗(yàn)或正式實(shí)驗(yàn)時(shí)沒有試劑而必需采用其他試劑，由于不同試劑的緩沖液成份有較大差別，如有的試劑中含有DMSO及Mg2+離子等，可能會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。7、 不要在管蓋上寫字，原因很明顯，但有些用戶習(xí)慣了寫字，后來再擦掉，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有些影響。8、 最好使用高質(zhì)量的PCR管，低質(zhì)量管的管間差可能會(huì)很大。9、 每次實(shí)驗(yàn)一定要有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，以免出現(xiàn)問題時(shí)找不到原因。10、 在樣本很珍貴時(shí)可以采用對(duì)樣本進(jìn)行稀釋的方式進(jìn)行定量。只要濃度不是太低，理論來講對(duì)稀釋是不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的。其他方法也可以采用類擬的策略，以節(jié)約成本，提高效率。想到的內(nèi)容就這些了，希望大家多批評(píng)指正。

15、反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 來源： 作者： 發(fā)布時(shí)間：2008-10-17 1. SG濃度：終濃度1:5,0001:100,000，一般為1:10,0001:70,0002. Primer濃度：終濃度50nM300nM固定摸板濃度的梯度實(shí)驗(yàn)不加摸板的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（NTC）有無非特異信號(hào)熔解曲線的分析是否單峰建議使用HPLC純化的引物3. MgCl2濃度降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物最低可至1.5nM同時(shí)做梯度實(shí)驗(yàn)和NTC對(duì)照4. 反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù)反應(yīng)溫度參考所用酶的種類退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間與常規(guī)PCR類似，擴(kuò)增片斷一般為200300bp5. TaqMan探針引物、探針設(shè)計(jì)：首先選

16、擇探針序列探針的Tm值為6870度，長(zhǎng)度不應(yīng)超過30堿基探針的5端不應(yīng)是G，G有可能會(huì)淬滅熒光素引物應(yīng)盡量靠近探針，擴(kuò)增片斷不超過400bp，通常為80150bp引物的Tm值為5960度，長(zhǎng)度約20堿基避免引物、探針之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)委托合成公司設(shè)計(jì)使用輔助軟件確定反應(yīng)參數(shù)一般為兩步法，94度1020s60度3060s （Taq酶的5外切酶活性在60度最強(qiáng)）通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度三步法， 72度45s優(yōu)化引物探針濃度目標(biāo)：最高的信號(hào)/背景比最小的Ct值引物濃度：50nM-900nM探針濃度：50nM-250nM通過多次實(shí)驗(yàn)確定各自的濃度和比例Real time PCR經(jīng)驗(yàn) 從RNA的提取到PCR

17、一 ：引物的設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，因?yàn)閞eal time pcr的檢測(cè)靈敏度比較高，所以相應(yīng)的對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道，還有幾點(diǎn)必須注意：1，引物的錯(cuò)配率（引物錯(cuò)配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進(jìn)去，結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差很大，重復(fù)性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR，引物同源性不高，只要兩條產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度相差足夠大，在電泳的時(shí)候能夠區(qū)分開就可以。real time PCR只有在熔解曲線的時(shí)候能分開，所以這就造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大，不可信）。3，引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子，不能在一個(gè)外顯子上（我們的實(shí)驗(yàn)是以cDNA為模板來擴(kuò)增的，如果有D

18、NA污染的話，因?yàn)镈NA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴(kuò)增。這對(duì)我們消除整個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差起很大的作用）。4，引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要盡可能設(shè)計(jì)在同一退火溫度，方便于以后同時(shí)擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費(fèi)模板，浪費(fèi)管家基因，所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)有利。5，注意引物設(shè)計(jì)好后的產(chǎn)物長(zhǎng)度。REAL TIME PCR的最佳產(chǎn)物長(zhǎng)度在150-250kb左右（書上說這樣可以增加熒光的敏感度，減少實(shí)驗(yàn)誤差，但是我對(duì)這個(gè)說法持懷疑態(tài)度。產(chǎn)物長(zhǎng)度越大，SYBR嵌入的越多，這樣才能夠保證最后的熒光值比較可信）。6，不同的管家基因擴(kuò)增

19、效率不同。所以在做整個(gè)實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)該做一次檢測(cè)擴(kuò)增效率的實(shí)驗(yàn)。如果擴(kuò)增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法來比較基因表達(dá)量的高低。二： 模板的要求歸根到底，REAL TIME pcr想要檢測(cè)的是目的基因表達(dá)量的高低，所以對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中模板的質(zhì)量要求必然很高，我以自己的一些經(jīng)驗(yàn)說一下操作過程中的一些關(guān)鍵點(diǎn)：1，用TRIZOL提取RNA有范圍要求。細(xì)胞數(shù)必須在一個(gè)范圍之內(nèi)才能提取出高質(zhì)量的RNA，所以我們?cè)谔崛∏氨仨氈兰?xì)胞數(shù)（一般6孔板中兩個(gè)孔就可以提取出RNA）。2，加入氯仿抽提過程中盡可能不要吸到中間層（中間層為基因組DNA，對(duì)上機(jī)做REAL TIME PCR很不利，會(huì)導(dǎo)致起始熒

20、光值很高，無法跑出完整的擴(kuò)增曲線）。3，提取完后用乙醇溶解要盡可能使得乙醇揮發(fā)掉，但是不要過分揮發(fā)。（乙醇沒有揮發(fā)干凈會(huì)對(duì)后續(xù)的擴(kuò)增效率有影響。在乙醇存在的情況下，DNA更加難溶，這就是醇沉的道理。但是過分揮發(fā)，RNA又不溶于水，會(huì)造成后續(xù)反轉(zhuǎn)錄量不高）。4，反轉(zhuǎn)錄過程的操作盡可能在冰上。我們用的是OLIGO DT18，為了盡可能的消除RNA之間的二聚體，我們將RNA和OLIGO DT18在一起70度變性10分鐘后，馬上冰浴2分鐘，再加入后續(xù)的MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一個(gè)小時(shí)完成延伸過程（也有的步驟上將RNA先70度變性10分鐘，再加入OLIGO DT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在變性完再加OLIGO DT18時(shí)，加的比較晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚體，導(dǎo)致前面的變性沒有意義）。5，反轉(zhuǎn)錄完后將cDNA -20度保存，盡可能不要反復(fù)凍融（可以以10UL為一個(gè)單位來分裝cDNA）。6，在加樣的過程中需要特別注意：（1）最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上，這樣可以消除不同管之間引物濃度的差異。（2）最后加模板的時(shí)候需要一把很準(zhǔn)確的移液器，以便確保每次加進(jìn)去的樣一致，注意不要沾管壁（大部分人說需要混勻，