AmpC酶的研究進展

1、1AmpCAmpC酶的研究進展酶的研究進展葉葉 英英1 1 研究研究AmpCAmpC酶的科學(xué)意義酶的科學(xué)意義2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因與表達4 AmpC酶的發(fā)展簡史5 AmpC酶的檢測6 產(chǎn)AmpC酶菌的治療與預(yù)防 開發(fā)一種新抗生素需要10年 需花費5-10億美元 一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年時間后抗生素時代已經(jīng)來臨？！后抗生素時代已經(jīng)來臨？！攜帶NDM-1的超級大腸埃希菌細菌耐藥的主要機制細菌耐藥的主要機制滅活酶產(chǎn)生滅活酶產(chǎn)生孔蛋白改變孔蛋白改變主動外排主動外排其他機制其他機制靶點改變靶點改變滅活酶種類滅活酶種類v -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶v氨基糖苷類鈍化酶氨基糖苷類鈍化酶: 磷酸轉(zhuǎn)

2、移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶v氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶v其它：磷霉素、紅霉素乙?；钙渌毫酌顾亍⒓t霉素乙?；?林可霉素、克林霉素乙?；傅攘挚擅顾亍⒖肆置顾匾阴；傅?- -內(nèi)酰胺酶：最主要的滅活酶內(nèi)酰胺酶：最主要的滅活酶v目前已發(fā)現(xiàn)目前已發(fā)現(xiàn)300多種多種v新的種類不斷出現(xiàn)新的種類不斷出現(xiàn)v對對 -內(nèi)酰胺抗生素造成嚴重威脅內(nèi)酰胺抗生素造成嚴重威脅臨床關(guān)注的重要臨床關(guān)注的重要 - -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶v超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)v高產(chǎn)頭孢菌素酶(AmpC酶)v碳青霉烯類酶(Ambler B類 金屬酶; Ambler A,D類 -內(nèi)酰胺酶)1 研究

3、AmpC酶的科學(xué)意義2 AmpC2 AmpC酶的生化特性酶的生化特性3 AmpC酶的基因與表達4 AmpC酶的發(fā)展簡史5 AmpC酶的檢測6 產(chǎn)AmpC酶菌的治療與預(yù)防AmpC酶的定義酶的定義v是由革蘭陰性細菌(腸桿菌科細菌,銅綠假單胞菌等)的染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的一類內(nèi)酰胺酶，屬Bush分類（底物譜分類法）Group 1，Ambler分類（分子結(jié)構(gòu)分類法）Class Cv首選作用底物是頭孢菌素、且不被克拉維酸所抑制, 因此在國內(nèi)又稱作頭孢菌素酶。v因可被某些內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)生,又稱誘導(dǎo)酶。AmpCAmpC酶生化特性酶生化特性v相對分子量(Mr)介于38-42 KDa。v滅活-內(nèi)酰胺酶抑制

4、劑，如對克拉維酸等不敏感.v正在研究開發(fā)的硼酸類抑制劑 BRL42715、 RO48-1265、RO48-1220對其有較強的抑制作用。AmpCAmpC酶生化特性酶生化特性v對青霉素類抗生素除氮脒青霉素（美西林）或脒基青霉素（替莫西林）外均耐藥。v對多種三代頭孢菌素和單環(huán)類抗生素耐藥。v對頭霉素類耐藥。v對第四代頭孢菌素一般表現(xiàn)為敏感。v對碳青霉烯類抗生素敏感。但細菌高產(chǎn)AmpC酶結(jié)合外膜孔蛋白缺失可導(dǎo)致對其耐藥。產(chǎn)產(chǎn)ESBL與與AmpC的耐藥譜差別的耐藥譜差別 ESBL AmpC 耐藥譜耐藥譜多重多重 多重多重v對三代頭孢對三代頭孢多耐藥多耐藥 耐藥耐藥v頭孢吡肟頭孢吡肟多敏感多敏感 敏感敏

5、感v哌酮哌酮/舒巴坦舒巴坦大多敏感大多敏感 耐藥耐藥v哌拉哌拉/他唑巴坦他唑巴坦大多敏感大多敏感 耐藥耐藥v頭霉素頭霉素大多敏感大多敏感 耐藥耐藥v碳青霉烯類碳青霉烯類敏感敏感 敏感敏感產(chǎn)產(chǎn)AmpCAmpC酶細菌感染的患者死亡率顯著升高酶細菌感染的患者死亡率顯著升高32%15%P=0.03死亡率死亡率% %非耐藥菌非耐藥菌產(chǎn)產(chǎn)AmpCAmpC酶耐藥菌酶耐藥菌產(chǎn)產(chǎn)AmpCAmpC酶腸桿菌屬感染患者死亡率是非耐藥菌感染患者的酶腸桿菌屬感染患者死亡率是非耐藥菌感染患者的2 2倍倍1 研究AmpC酶的科學(xué)意義2 AmpC酶的生化特性3 AmpC3 AmpC酶的基因與表達酶的基因與表達4 AmpC酶的發(fā)

6、展簡史5 AmpC酶的檢測6 產(chǎn)AmpC酶菌的治療與預(yù)防AmpC酶的基因構(gòu)成酶的基因構(gòu)成v由5個不連鎖基因即 ampC、ampR、ampD、ampE 和ampG組成vampC是AmpC酶的結(jié)構(gòu)基因，編碼產(chǎn)生AmpC酶蛋白v基因ampR、ampD、ampE、ampG 是AmpC酶的調(diào)節(jié)基因，參與調(diào)控AmpC酶的合成過程。AmpC酶的基因構(gòu)成酶的基因構(gòu)成vampR是AmpC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬于LysR調(diào)節(jié)子家族。AmpR在非誘導(dǎo)狀態(tài)下作為ampC轉(zhuǎn)錄的抑制因子，而在誘導(dǎo)狀態(tài)下作為轉(zhuǎn)錄激活因子存在。vampD是AmpC表達的負調(diào)控基因，位于遠處染色體上，參與肽聚糖代謝。ampD的基因序列與AmpC酶

7、的表現(xiàn)型密切相關(guān)。AmpC酶的基因構(gòu)成酶的基因構(gòu)成vAmpE蛋白充當一個感受器，協(xié)助ampD完成對ampC的阻遏作用，在整個調(diào)節(jié)系統(tǒng)中居次要地位。 vampG編碼轉(zhuǎn)膜蛋白AmpG,具有透性酶活性，感受肽聚糖量的變化，在AmpC酶的表達中起著向胞漿內(nèi)傳遞誘導(dǎo)信號的作用。染色體染色體AmpC酶表達類型酶表達類型（1）誘導(dǎo)高產(chǎn)型: 低基礎(chǔ)水平和高誘導(dǎo)產(chǎn)生（2）持續(xù)高產(chǎn)型: 高基礎(chǔ)水平持續(xù)表達， 亦稱：穩(wěn)定的去阻遏表達型（3）持續(xù)低產(chǎn)型: 低基礎(chǔ)水平持續(xù)表達（1 1）誘導(dǎo)高產(chǎn)型）誘導(dǎo)高產(chǎn)型 當有誘導(dǎo)作用的內(nèi)酰胺類抗生素存在的條件下,AmpC酶的產(chǎn)量明顯增加,增加的范圍在1001000倍之間。（2）持續(xù)

8、高產(chǎn)型）持續(xù)高產(chǎn)型 原因為去阻遏突變,即調(diào)控基因之一的ampD基因發(fā)生突變,產(chǎn)生有缺陷的AmpD蛋白,不能與AmpR調(diào)控蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,AmpR蛋白即以激活子狀態(tài)發(fā)揮激活作用,引起AmpC酶的大量表達。（3) 持續(xù)低產(chǎn)型持續(xù)低產(chǎn)型 部分產(chǎn)AmpC酶的菌株持續(xù)低水平的產(chǎn)生AmpC酶,其原因可能是缺乏ampR基因或ampR基因發(fā)生突變,產(chǎn)生有缺陷的AmpR蛋白,不能在無內(nèi)酰胺類存在的條件下起到抑制子的作用,也不能在有內(nèi)酰胺類存在的條件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持續(xù)低水平表達。1 研究AmpC酶的科學(xué)意義2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因與表達4 AmpC4 AmpC酶的發(fā)展

9、簡史酶的發(fā)展簡史5 AmpC酶的檢測6 產(chǎn)AmpC酶菌的治療與預(yù)防AmpC的發(fā)展簡史的發(fā)展簡史v20世紀90年代前，為染色體型。v90年代后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒型，呈持續(xù)高表達,并在同種和 不同種細菌間水平播散，造成更嚴重的耐藥性。v質(zhì)粒型AmpC種類在不斷增加，目前已達50余種。v產(chǎn)質(zhì)粒型AmpC酶細菌：沒有或具有不健全AmpC染色體的細菌種屬具有健全AmpC染色體的細菌。質(zhì)粒質(zhì)粒AmpC酶流行背景酶流行背景v1989年Bauenfeind等報道了質(zhì)粒AmpC酶CMY-1， 但沒有提供其生化特征。v第一個公認的質(zhì)粒AmpC酶是1988年在美國普羅維登斯一家醫(yī)院由Papanicolaou等從肺炎克雷伯菌中

10、發(fā)現(xiàn)的MIR-1。v從此以每年發(fā)現(xiàn)13個新質(zhì)粒的速度增加。質(zhì)粒質(zhì)粒AmpC酶的世界流行狀況酶的世界流行狀況非洲非洲ACC-1，CMY-4亞洲亞洲MOX-1，DHA-1，ACT-1 , FOX-2，CMY-I/2/6/7/8/9/10/11/15/16/18/21/21/22/26歐洲歐洲BIL-1，CMY-2/3/4/5/12/13，DHA-1/2，F(xiàn)OX-2/4，LAT-1/3/4，MOX-2，ACC-1美洲美洲MIR-1，ACT-I，F(xiàn)OX-1/2/5/6/8/10，CMY-2/3/4/5/19/20/23/24/25我國我國pAmpC酶的檢測狀況酶的檢測狀況北京協(xié)和醫(yī)院北京協(xié)和醫(yī)院ACT

11、-1， CMY-2首都醫(yī)科大學(xué)首都醫(yī)科大學(xué)DHA-1，CMY-2中山醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)科大學(xué)DHA-1,ACT-1,CMY-2浙江醫(yī)科大學(xué)浙江醫(yī)科大學(xué)DHA-1，CMY-2/4/11上海市傳染病醫(yī)院上海市傳染病醫(yī)院安徽醫(yī)科大學(xué)安徽醫(yī)科大學(xué)DHA-I， CMY-2DHA-1，ACT-1/2，CMY-2，MOX-4，ACT-6pAmpC酶的來源酶的來源v系統(tǒng)進化樹研究表明：pAmpC酶和某些菌屬的染色體AmpC酶有著高度的同源關(guān)系。v根據(jù)和不同菌屬的染色體AmpC酶的同源關(guān)系，pAmpC酶可分為以下5組：pAmpC酶的分類酶的分類弗氏枸櫞酸桿菌組弗氏枸櫞酸桿菌組LAT-1/2/3/4、CMY-2/3/

12、4/5/6/7/9、BIL-1陰溝腸桿菌群組陰溝腸桿菌群組MIR-1、ACT-1氣單胞菌屬組氣單胞菌屬組MOX-1/2、FOX-1/2/3/4/5/6、CMY-1/8/11摩根摩根菌組摩根摩根菌組DHA-1/2蜂房哈夫尼菌組蜂房哈夫尼菌組ACC-1pAmpC酶的來源途徑推測酶的來源途徑推測v推測質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因是來源于染色體的，目前大量的線索表明可能是通過整合子實現(xiàn)的。v整合子(Integron)是近來新發(fā)現(xiàn)的能將耐藥基因傳遞給其他細菌同時還能接受其他細菌的耐藥基因，是細菌遺傳進化天然克隆和表達系統(tǒng)。1 研究AmpC酶的科學(xué)意義2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因與表達4 Am

13、pC酶的發(fā)展簡史5 AmpC5 AmpC酶的檢測酶的檢測6 產(chǎn)AmpC酶菌的治療與預(yù)防 AmpC酶的檢測方法酶的檢測方法v表型檢測v基因檢測vpAmpC酶確認需分兩步: (1) 明確是否為高產(chǎn)AmpC酶 (2) 是否為質(zhì)粒介導(dǎo): 通過質(zhì)粒接合實 驗、Southern雜交證實 AmpC酶的檢測方法酶的檢測方法 表型檢測方法: 頭孢西丁敏感實驗 頭孢西丁三維試驗 頭孢西丁敏感試驗頭孢西丁敏感試驗v操作：按操作：按CLSI標準操作標準操作v判斷：判斷：K-B法法16g/ml為為 耐藥耐藥 v意義：耐意義：耐FOX的菌株有可能產(chǎn)生的菌株有可能產(chǎn)生AmpC酶酶v缺點：特異性差缺點：特異性差頭孢西丁三維試

14、驗頭孢西丁三維試驗 將0.5麥氏單位大腸埃希菌ATCC25922菌液涂布于M-H平板上，取30g頭孢西丁紙片置于平皿中心，用刀片在離紙片邊緣5mm處放射狀地由里向外切割一道狹縫，取40微升受試菌酶粗提取物由里向外加入狹縫內(nèi)，盡量避免酶液溢出狹縫。將MH平板放入35孵箱過夜。頭孢西丁三維試驗頭孢西丁三維試驗 結(jié)果判斷：結(jié)果判斷： 出現(xiàn)出現(xiàn)ATCC25922箭頭樣生長，箭頭樣生長， 為三維試驗陽性。為三維試驗陽性。 是目前公認的檢測是目前公認的檢測 高產(chǎn)高產(chǎn)AmpC酶的經(jīng)典方法。酶的經(jīng)典方法。AmpC酶的檢測方法酶的檢測方法 基因檢測法: 1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 2 核酸雜交(Southern

15、 blot) 3 核苷酸序列分析法:是診斷最可靠和發(fā) 現(xiàn)新酶的方法 AmpC酶的檢測方法酶的檢測方法 方法雖多，但至目前CLSI仍未制定臨床篩選AmpC酶的標準，隨著產(chǎn)AmpC酶的革蘭陰性桿菌引起的耐藥性在臨床上越來越受到重視，需要建立一種快速、簡便的方法常規(guī)篩選AmpC酶，任務(wù)任重而道遠。1 研究AmpC酶的科學(xué)意義2 AmpC酶的生化特性3 AmpC酶的基因與表達4 AmpC酶的發(fā)展簡史5 AmpC酶的檢測6 6 產(chǎn)產(chǎn)AmpCAmpC酶菌的治療與預(yù)防酶菌的治療與預(yù)防藥物治療藥物治療給予抗菌治療后給予抗菌治療后因為敏感菌株的因為敏感菌株的相繼死亡，突變相繼死亡，突變菌株被選擇出來菌株被選擇出

16、來耐藥的克隆耐藥的克隆在過去曾是在過去曾是敏感的菌落敏感的菌落中生長中生長在治療過程中在治療過程中耐藥成為臨床耐藥成為臨床表現(xiàn)表現(xiàn)敏感菌落中存敏感菌落中存在著自發(fā)的突在著自發(fā)的突變菌株變菌株耐藥是選擇出來的耐藥是選擇出來的不宜使用第三代頭孢不宜使用第三代頭孢 三代頭孢菌素是AmpC酶的弱誘導(dǎo)劑，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的低水平的AmpC酶不足以導(dǎo)致對三代頭孢菌素的耐藥，而在AmpC基因陽性菌株中使用三代頭孢菌素，可能會篩選出高產(chǎn)AmpC酶的耐藥株，導(dǎo)致耐藥菌流行。因此: 合理使用三代頭孢菌素是減少 高產(chǎn)AmpC酶突變株引發(fā)耐藥的關(guān)鍵。 不應(yīng)用不應(yīng)用-內(nèi)酰胺酶復(fù)合制劑內(nèi)酰胺酶復(fù)合制劑v克拉維酸不抑制AmpC酶

17、，反而為強誘導(dǎo)劑;v舒巴坦和三唑巴坦的抑制效果也非常有限；v故-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑不應(yīng)用于 治療高產(chǎn)AmpC酶耐藥株感染。第四代頭孢菌素第四代頭孢菌素v 對AmpC酶親和力較低（較高的Km值）v 能快速地通過細菌的外膜屏障與PBP結(jié)合 頭孢吡肟等四代頭孢是優(yōu)先選用的抗生素頭孢吡肟等四代頭孢是優(yōu)先選用的抗生素。碳青霉烯類抗生素碳青霉烯類抗生素 亞胺培南，美羅培南等。盡管它們是AmpC酶的強誘導(dǎo)劑，但它們對AmpC酶高度穩(wěn)定，能在誘導(dǎo)產(chǎn)生足量的AmpC酶之前快速地殺死細菌。同時亦能用于治療產(chǎn)ESBL腸桿菌屬細菌引起的醫(yī)院感染。 降階梯治療降階梯治療-嚴重細菌感染新策略嚴重細菌感染新策略v第四

18、代頭孢菌素有明顯的抗菌活性；v碳青霉烯類療效最好（尤其合并ESBLs時）；v可根據(jù)藥敏選用氨基糖苷類和喹諾酮類；v不宜使用三代頭孢菌素及其復(fù)合制劑。高產(chǎn)高產(chǎn)AmpC酶耐藥菌的治療總結(jié)酶耐藥菌的治療總結(jié)ARPAC(Antibiotic Resistance Prevention And Control)歐洲醫(yī)院調(diào)查歐洲醫(yī)院調(diào)查 FM MacKenzie， Scotland抗菌藥使用策略抗菌藥使用策略耐藥性調(diào)查耐藥性調(diào)查抗菌藥使用調(diào)查抗菌藥使用調(diào)查感染控制策略感染控制策略 致力于：少用抗菌藥致力于：少用抗菌藥 低的耐藥率低的耐藥率 病原菌的低播散率病原菌的低播散率合理應(yīng)用抗菌藥物，減少選擇壓力合理應(yīng)用抗菌藥物，減少選擇壓力 陰溝腸桿菌等可表現(xiàn)為AmpC低水平持續(xù)表達，三代頭孢菌素是弱誘導(dǎo)劑，ampD基因自發(fā)突變率為10-5