分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 基本技術(shù) 金光輝、李煒、鄭紅花、宋剛、石松林、劉迎福章喻軍、林筱Molecular Biology TimelineDNA discovered by F. Meischer18691910Genes on chromosomes; T.H. Morgan1941One gene-one enzyme, Beadle & Tatum1944DNA is genetic material; Avery, Mcleod& McCarty1953Structure of DNA; Watson, Crick, Franklin, Wilkins1961Discov

2、ery of mRNA; Brenner, Jacob & Meseleson1966Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana1972Recombinant DNA made in vitro; P. Berg1973DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. CohenDiscovery of reverse transcriptase; H. Temin19731977Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert1977Di

3、scovery of split genes; Sharp, Roberts et al.1982Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman20011986Creation of PCR; K. Mullis et al.Human Genome Project; Venter, Collins and many others目的和要求通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，1.掌握掌握該領(lǐng)域的基本知識(shí)、基本技能和基本方法;2.了解了解分子生物學(xué)這一新興基礎(chǔ)學(xué)科的研究發(fā)展、技術(shù)革新和最新成果;3. 對(duì)分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域、研究方法、臨床應(yīng)用等有完

4、整的認(rèn)識(shí)認(rèn)識(shí); 為今后從事科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)工作奠定基礎(chǔ)。 掌握實(shí)驗(yàn)操作中常用儀器儀器的使用和工作原理；學(xué)會(huì)研究中實(shí)驗(yàn)方法方法的選擇、原理和操作；學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)資料的收集、整理和；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理；學(xué)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析、整理和實(shí)實(shí)驗(yàn)報(bào)告驗(yàn)報(bào)告的正確書寫；了解最新研究動(dòng)向和技術(shù)。 通過實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)加深對(duì)分子生物學(xué)理論知識(shí)理論知識(shí)的理解，提高科學(xué)思維能力思維能力和分析問題、動(dòng)手解決問題的能力，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)扎實(shí)的科研作風(fēng)科研作風(fēng)。實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1實(shí)驗(yàn)前預(yù)習(xí)預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，熟悉實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、操作步驟以及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。2遵守課堂紀(jì)律，實(shí)驗(yàn)中認(rèn)真操作，保持室內(nèi)安靜安靜。3保持實(shí)驗(yàn)室和儀器整齊清潔

5、清潔。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，要及時(shí)清掃地板和整理臺(tái)面物品。實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)禁吸煙、隨地吐痰、亂扔紙屑、雜物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后值日生搞好實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)室清出的垃圾和試劑要分別倒（放）到指定的位置。離開實(shí)驗(yàn)室前必須切斷電源和關(guān)閉其他應(yīng)關(guān)閉的儀器設(shè)備。注意防火、防盜、防災(zāi)。注意清除安全隱患，提高安全意識(shí)，注意關(guān)水、關(guān)燈、關(guān)電、鎖門。4實(shí)驗(yàn)室有毒、易燃、易爆、腐蝕和貴重材料應(yīng)謹(jǐn)慎操作操作、定點(diǎn)存放，領(lǐng)用要登記，使用要記錄。嚴(yán)格按照說明規(guī)范操作各種儀器和使用各種材料和試劑。對(duì)于儀器、重要或危險(xiǎn)物品的操作， 必須經(jīng)他人指導(dǎo)、操作熟練后才允許獨(dú)自操作。對(duì)氫氣等易燃?xì)怏w和藥品應(yīng)遠(yuǎn)離火源。5實(shí)驗(yàn)室物品物品為實(shí)驗(yàn)專用，不得挪作它

6、用或占為私有。任何人未經(jīng)批準(zhǔn)，不得擅自將實(shí)驗(yàn)室的器材、藥品等拿回宿舍使用或存放。6. 愛護(hù)實(shí)驗(yàn)器材器材。損壞實(shí)驗(yàn)物品按規(guī)定進(jìn)行賠償。7實(shí)驗(yàn)室內(nèi)必須穿實(shí)驗(yàn)工作服實(shí)驗(yàn)工作服進(jìn)行操作。8實(shí)驗(yàn)物品和試劑等使用后必須放回原來位置位置。實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求一、實(shí)驗(yàn)操作要求一、實(shí)驗(yàn)操作要求1實(shí)驗(yàn)課前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，熟悉熟悉實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、操作步驟以及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。2實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)謹(jǐn)操作、仔細(xì)觀察、認(rèn)真實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)操作、仔細(xì)觀察、認(rèn)真實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄記錄。3準(zhǔn)確認(rèn)真完整清楚記錄記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)記錄需使用專用記錄本，不可使用單片紙或草稿記錄。4必須掌握操作步驟和實(shí)驗(yàn)流程后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

7、。二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求語(yǔ)言準(zhǔn)確精煉、表述流暢。2實(shí)驗(yàn)報(bào)告嚴(yán)格按照如下格式和內(nèi)容書寫。 實(shí)驗(yàn)編號(hào) 實(shí)驗(yàn)名稱 實(shí)驗(yàn)人、學(xué)號(hào)、實(shí)驗(yàn)組員、實(shí)驗(yàn)日期 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)材料 方法和步驟 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果討論和結(jié)論 實(shí)驗(yàn)思考題3在寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)，實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮響?yīng)按照該次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟寫出，要明確具體、有針對(duì)性。實(shí)驗(yàn)材料包括實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞或組織、重要的實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中應(yīng)包括全部實(shí)驗(yàn)過程中觀察到的現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的圖表要有圖名和表名，圖名位于圖下方，表名位于表格上方。圖表需大小合適、

8、標(biāo)注清楚。圖表內(nèi)容和所包含的信息必須在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中使用流暢簡(jiǎn)潔語(yǔ)言表達(dá)出來。結(jié)果討論和結(jié)論是對(duì)實(shí)驗(yàn)過程、實(shí)驗(yàn)方法步驟的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)體會(huì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)驗(yàn)異?，F(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)思考題的分析和對(duì)該次實(shí)驗(yàn)作出的總結(jié)和結(jié)論。 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程實(shí)驗(yàn)一 真核細(xì)胞染色體DNA的分離制備 DNA樣品的純化、定量和電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)三 堿變性法小量制備質(zhì)粒 DNA的限制性酶切 實(shí)驗(yàn)四 瓊脂糖凝膠中DNA片段的分離和回收 質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)五 真核細(xì)胞RNA的制備和逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)六 Western印跡（上）實(shí)驗(yàn)七 Western印跡（下）實(shí)驗(yàn)八 外源基因在大腸桿

9、菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)九 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)實(shí)驗(yàn)十 Northern印跡實(shí)驗(yàn)十一 Southern印跡考試 生物技術(shù)生物技術(shù)（biotechnology): 基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程和酶工程，新生物技術(shù)的核心是基因工程技術(shù)。新技術(shù)：基因操作技術(shù)、生物治療技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)、人類和其他生命體基因組工程、基因治療技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)、生物信息技術(shù)、生物芯片技術(shù)等。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：基因藥物、重組疫苗、生物芯片、生物反應(yīng)器、基因工程抗體、基因治療與細(xì)胞治療、組織工程、 轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、獸用生物制品、生物技術(shù)飼料、胚胎移植工程、基因工程微生物農(nóng)藥、環(huán)保、 海洋生

10、物技術(shù)，以及現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)發(fā)酵、制藥、輕工食品等傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造等領(lǐng)域。生物技術(shù)在世界各國(guó)已經(jīng)或正在成為新的產(chǎn)業(yè)生長(zhǎng)點(diǎn)。 基因工程技術(shù)上游技術(shù)（上游技術(shù)（upstream）基因工程下游技術(shù)下游技術(shù)（downstream）蛋白質(zhì)工程上游技術(shù)（上游技術(shù)（upstream）基因工程重組子的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建及高效表達(dá)基因工程上游技術(shù)基本過程 選擇載體 獲得目的基因 目的基因與載體的重組 重組載體的轉(zhuǎn)化 重組子的篩選與鑒定基因工程技術(shù)下游技術(shù)下游技術(shù)（downstream）蛋白質(zhì)工程工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確定新型生物反應(yīng)器的研制高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)分離純化的優(yōu)化控制生物反應(yīng)器等一系列儀器、儀表的設(shè)

11、計(jì)制造超濾、反滲透技術(shù)的應(yīng)用克?。寺。╟lone）:是指通過無(wú)性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體?；蚩寺。ɑ蚩寺。╣ene cloning）:指把一個(gè)生物體中的遺傳信息（基因片段）通過無(wú)性繁殖轉(zhuǎn)人另一個(gè)生物體內(nèi)的過程。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆?；蚩寺〖夹g(shù)基因克隆技術(shù): 包括基因的獲取、基因的重組、基因的克隆化和基因的表達(dá)等。DNA嵌合體（DNA chimera）：內(nèi)、外源DNA插入載體分子所形成的雜合分子（嵌合DNA）。重組（ recombination）：構(gòu)建DNA嵌合體分子（重組子）的過程。基因重組（基因重組

12、（gene recombination）:是將不同基因片段連接起來構(gòu)成一個(gè)新的DNA分子的過程。分子克?。╩olecular cloning）：重組體分子的無(wú)性 繁殖過程。基因工程基因工程（genetic engineering）、又稱為DNA重組技 術(shù)（recombinant DNA technique）或分子克?。╩olecular cloning）:特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)技術(shù)?；虿僮鳎╣ene manipulating）:指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基

13、本技術(shù) 核酸純化技術(shù)核酸純化技術(shù) 離心分離技術(shù)離心分離技術(shù) 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù) 核酸定量技術(shù)核酸定量技術(shù) 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 序列分析技術(shù)序列分析技術(shù) 蛋白表達(dá)檢測(cè)純化技術(shù)蛋白表達(dá)檢測(cè)純化技術(shù) 一 、核酸純化技術(shù)原 理 1. 核酸混合物成分: 結(jié)構(gòu)類：細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、其他 大分子：DNA、RNA、Protein、糖類、脂類等 小分子：氨基酸、小分子糖類和脂類、水、無(wú)機(jī)物等 2. 關(guān)鍵: DNA、RNA、Protein 3. 方案: Protein變性 苯酚：強(qiáng)變性 25 氯仿：弱變性 24 異戊醇：消泡分層 1方 法樣品等體積飽和苯酚10kb以上輕柔混勻；10kb以下振蕩離心（1

14、2000g）取上清核酸相核酸相Protein變性相變性相有機(jī)相有機(jī)相 4. 苯酚的處理：重蒸-飽和-pH 重蒸：去除醌類氧化物 飽和： 防止核酸損耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最適合 方法：蒸餾（183）0.1% 8-羥基喹啉-收集 （棕色瓶）-飽和與調(diào)pH7.8（Tris- HCl pH8.0）-0.2%-ME, 4 或-20 保存 8-羥基喹啉的作用：減少酚氧化、提供顏色（黃色）指 示、抑制RNA酶活力、螯合金屬離子抑制DNA 酶活性、提取RNA時(shí)與VRC作用使酚由黃變黑。二、 離心技術(shù)原 理離心力：離心力： F= F= 2 2r r RCFRCF=F/g = =F/g = 2 2r

15、/gr/g = =（2 2 N N）2 2r/gr/g =1.119 =1.1191010-5-5(N)(N)2 2r r g: g: 重力常數(shù)（重力常數(shù)（980cm/s980cm/s2 2 ） N: N: 轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)速（rpmrpm，revolation per minute)revolation per minute) N=1000 N=1000 （RCF/11.19r RCF/11.19r ）1/21/2浮力：浮力：K=m-mK=m-m0 0/ / (M:(M:物質(zhì)質(zhì)量，物質(zhì)質(zhì)量，：物體密度，：物體密度，0 0：介介質(zhì)密度）質(zhì)密度）沉降阻力：沉降阻力：f(dx/dt) f(dx/dt) （

16、f:f:摩擦系數(shù)，摩擦系數(shù)， x x：沉降速度，：沉降速度，t t：沉降時(shí)間）沉降時(shí)間）RCF=k+ f(dx/dt)RCF=k+ f(dx/dt)差速離心差速離心密度梯度離心密度梯度離心操 作 離心機(jī)分類： 普通 6000rpm 高速 10000-25000rpm 超速 30000-80000rpm 平衡 溫度-離心力-轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)頭：角轉(zhuǎn)、平轉(zhuǎn)、垂直轉(zhuǎn)三、 凝膠電泳技術(shù) 概 論 帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳. 1937年首創(chuàng)紙電泳技術(shù)后，電泳的種類和應(yīng)用在深度和廣度兩方面均迅速發(fā)展，已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。其中，凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，使它成

17、為分離、鑒定和提純核酸的首選的標(biāo)準(zhǔn)方法。原 理電泳法：電泳法：指帶電荷的樣品（蛋白質(zhì)、核酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。 電泳法可分為自由電泳（無(wú)支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。前者包括Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。凝膠電泳 以淀

18、粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。 瓊脂糖凝膠孔徑較大，對(duì)一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用，但適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等。應(yīng)用較廣，介紹如下： 等電點(diǎn)：DNA pI=6.0-7.0 支持介質(zhì)：瓊脂糖、PA 分離范圍：agarose：100bp60kb PA：5500bp F=q E F= 6r F= F, =q?E/ (6r) 泳動(dòng)率（電泳遷移率）：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度的泳動(dòng)速度 U= /E =q / (6 r) =

19、(d/t)/(V/L) （cm2/V ? S） 遷移率單位：10-5 （cm2/V ? S） 球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點(diǎn)的電泳遷移率。電泳影響因素 1. 1. 樣品樣品DNADNA物理性質(zhì)物理性質(zhì) 質(zhì)粒構(gòu)象：質(zhì)粒構(gòu)象： CCCCL L OCOC 線形：線形：1010M M正比正比1/U (U:1/U (U:泳動(dòng)率）泳動(dòng)率） 2. 2. 介質(zhì)性質(zhì)介質(zhì)性質(zhì) 1010U= U= 1010U U0 0-K-Kr rT T U U：泳動(dòng)率；：泳動(dòng)率；U U0 0：自由泳動(dòng)率；：自由泳動(dòng)率；KrKr

20、：介質(zhì)阻滯系數(shù)；：介質(zhì)阻滯系數(shù)； T T：凝膠濃度。：凝膠濃度。 3. 3. 電壓電壓：5v/cm, 5v/cm, 電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度：V/LV/L 4. 4. 緩沖液緩沖液 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度：0.020.020.2 (I0.2 (I( (CZCZn n)/2)/2） C C：溶液：溶液molmol濃度；濃度；Z Z：化合價(jià)；：化合價(jià)；n n：原子數(shù)目。：原子數(shù)目。 TAETAE、TBETBE、TPETPE5.5.電滲 在電場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲（electro-osmosis）。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使

21、溶液相對(duì)帶負(fù)電或正電。 如以濾紙作支持物時(shí)，紙上纖維素吸附OH-帶負(fù)電荷，與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+，帶正電荷移向負(fù)極，若質(zhì)點(diǎn)原來在電場(chǎng)中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點(diǎn)原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍 瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度線形線形DNA的最佳分辨范圍（的最佳分辨范圍（bp）0.5%1,00030,0000.7%800 12,0001.0%500 10,0001.2%400 7,0001.5%200 3,0002.0%50 2,000DNA片段長(zhǎng)度片段長(zhǎng)度Agar

22、ose濃度使用濃度使用Marker種類種類200 bp以下以下3%以上以上DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 200 bp700bp2%3%DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 700 bp1,500 bp1%2%-EcoT14 I digestDNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 1,500 bp5,000 bp 0.7%1% -EcoT14 I digestHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000 + 15,000 5,000 bp以上以上 0.7%