色譜分析第7章毛細(xì)管電泳

1、LOGO第第7 7章章 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳Capillary Electrophoresis內(nèi)容提要內(nèi)容提要 概述概述 HPCE的基本原理的基本原理電泳、淌度、電滲電泳、淌度、電滲 毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀 毛細(xì)管電泳的分類毛細(xì)管電泳的分類毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE)毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳 (CITP)毛細(xì)管膠束電動色譜毛細(xì)管膠束電動色譜 (MEKC)毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳 (CGE)毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦 (CIEF)2概述概述毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳(capillary electrophresis, CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳，又稱高效毛細(xì)管電泳(high p

2、erformance capillary electrophresis, HPCE)以毛細(xì)管毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電高壓直流電場場為驅(qū)動力，以樣品的多種特性多種特性(電荷、電荷、大小、等電點、極性、親和行為、相大小、等電點、極性、親和行為、相分配特性等分配特性等)為根據(jù)的液相微分離分析微分離分析技術(shù)。3發(fā)展簡史發(fā)展簡史1981 75m內(nèi)徑的毛細(xì)管1984 毛細(xì)管膠束電動色譜1987 毛細(xì)管等電聚焦1988-1989 CE商品儀器1989 第一屆國際毛細(xì)管電泳會議4概述概述分離的一般過程分離的一般過程分離方法分離方法 萃取、沉淀結(jié)晶、升華蒸餾、過濾、降沉、離心、色譜、電泳、篩分分離的特點分

3、離的特點 混合的逆過程 需外力的推動 不同組分差速運動過程5概述概述數(shù)學(xué)描述數(shù)學(xué)描述差速運動過程差速運動過程定時分離定時分離 L = vtR 例如 薄層色譜定長分離定長分離 tR = L/v 例如 HPLCGCCE6概述概述電泳電泳(electrophoresis, EP) 在電解質(zhì)溶電解質(zhì)溶液中液中，帶電離子在電場電場作用下，向著與其電性相反相反的電極移動，稱為電泳。1807年年，由俄國莫斯科大學(xué)的斐迪南弗雷德里克羅伊斯最早發(fā)現(xiàn)。7概述概述利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)電泳技術(shù)。1936年，瑞典學(xué)者蒂塞利烏斯設(shè)計制造了移動界面電泳儀 ，分離了馬血清白蛋白的3種球

4、蛋白，創(chuàng)建了電泳技術(shù)。獲1948年諾貝爾化學(xué)獎。8概述概述由經(jīng)典電泳到高效毛細(xì)管電泳由經(jīng)典電泳到高效毛細(xì)管電泳經(jīng)典電泳經(jīng)典電泳 操作繁瑣；分離效率低，無法與其它分離方法相比1981年年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進行分析，柱效理論塔板數(shù)高達40萬/米，開創(chuàng)高效毛細(xì)管電泳時代。從此電泳發(fā)生根本變革，發(fā)展成為可以和HPLC、GC相媲美的分析技術(shù)。9概述概述 毛細(xì)管毛細(xì)管 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 電極電極 檢測器檢測器 電極電極 試樣試樣 緩沖液緩沖液 緩沖液緩沖液 高壓電源高壓電源 (可高至可高至30KV) 主要部件主要部件 高壓電源、毛細(xì)管、檢測器和緩高壓電源、毛細(xì)管、檢

5、測器和緩沖液貯瓶沖液貯瓶10概述概述技術(shù)改進技術(shù)改進 采用0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管 采用高達數(shù)千伏的電壓兩者互相促進兩者互相促進 毛細(xì)管的采用可使產(chǎn)生的熱量較快的散發(fā)，大大減少溫度效應(yīng)，從而使電壓可以很高 高電壓可使電場推動力增大，進一步使柱子直徑變小，柱長增加通常，通常，HPCE的柱效高于的柱效高于HPLC11概述概述與與HPLC相比，相比，HPCE具有以下優(yōu)點具有以下優(yōu)點 柱效高柱效高(105至至107理論塔板理論塔板)，靈敏度高靈敏度高(10-19 mol) 所需樣品量少所需樣品量少(10-9 L) 分析快速分析快速(幾十秒幾十秒)、分析成本低分析成本低 儀器簡單，操作方便，容易實現(xiàn)自動

6、化儀器簡單，操作方便，容易實現(xiàn)自動化不足不足 由于樣品進樣量少，HPCE一般不適用于一般不適用于樣品的分離制備；重現(xiàn)性不如樣品的分離制備；重現(xiàn)性不如HPLC。12概述概述電泳電泳與與電滲電滲電泳電泳 electrophoresis 是指在是指在電解質(zhì)溶液電解質(zhì)溶液中，中，帶電粒子在帶電粒子在電場電場作用下，以不同的速度向所作用下，以不同的速度向所帶電荷帶電荷相反相反的方向發(fā)生遷移的電動現(xiàn)象。的方向發(fā)生遷移的電動現(xiàn)象。電滲電滲 (eletroosmosis) 是指在電場作用下，毛是指在電場作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。HPC

7、EHPCE的基本原理的基本原理13電泳涉及的基本概念電泳涉及的基本概念有效長度有效長度 Ld(cm) 毛細(xì)管的入口端到檢測器窗口的距離。遷移時間遷移時間 tm (min) 指一種溶質(zhì)從毛細(xì)管的入口端到達檢測窗口的時間。電泳遷移時間是一個可直接通過儀器測量的量。遷移速度遷移速度(v = Ld/tm) 遷移速度不同是電泳分離的基礎(chǔ)14HPCEHPCE的基本原理的基本原理帶電粒子以速度帶電粒子以速度v在電場中移動，受到大小在電場中移動，受到大小相等、方向相反的相等、方向相反的電場推動力電場推動力和和摩擦阻力摩擦阻力的作用。的作用。 電場力：電場力：FE = qE , 摩擦阻力摩擦阻力: F = fv

8、故故: qE = fv對于球形離子對于球形離子, f = 6r (-介質(zhì)粘度介質(zhì)粘度; r-半徑半徑)遷移速度遷移速度: v = qE/f = q/(6r)*E 若若 = q/(6r), 遷移速率遷移速率v與與直接相關(guān)直接相關(guān) 15HPCEHPCE的基本原理的基本原理淌度淌度 單位電場(E)下的電泳速度(v)稱為淌度，也稱為電遷移率。絕對淌度絕對淌度0em 在無限稀釋無限稀釋溶液中所測得的淌度。 毛細(xì)管有效長度毛細(xì)管有效長度遷移時間遷移時間毛細(xì)管總長度毛細(xì)管總長度電壓電壓淌度淌度 mobility = q/(6r), v = E淌度淌度 0em= v/E0em = v/(V/L) = (Ld/

9、tm)/(V/L) 16表征電泳速度表征電泳速度淌度淌度 mobility17有效淌度有效淌度em 由于活度活度特別是酸堿度酸堿度的不同，樣品分子的解離度不同，電荷也將發(fā)生變化，所表現(xiàn)出的淌度會小于絕對淌度，稱為有效淌度。淌度的含義淌度的含義(電泳速度的影響因素電泳速度的影響因素) ： 離子所帶電荷越多，解離度越大，體積越離子所帶電荷越多，解離度越大，體積越小，溶液的粘度越小則電泳速度越快。小，溶液的粘度越小則電泳速度越快。em = q/(6r)18電滲電滲 eletroosmosis1. 毛細(xì)管的材質(zhì)為石英毛細(xì)管的材質(zhì)為石英(二氧化硅二氧化硅)，在，在pH3的條的條件下，表面帶有件下，表面帶

10、有負(fù)電荷負(fù)電荷。2. 相應(yīng)的，相應(yīng)的，液體中正離子被液體中正離子被石英層負(fù)電荷吸引與石英層負(fù)電荷吸引與之相接觸。上述正離子在電場作用下之相接觸。上述正離子在電場作用下向負(fù)極移向負(fù)極移動動，最終，最終推動溶劑分子同向運動。推動溶劑分子同向運動。 電滲電滲 (eletroosmosis) 是指在電場作用下，毛細(xì)是指在電場作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動液體沿固體表面移動的現(xiàn)的現(xiàn)象。象。 電滲流電滲流(electroosmotic flow, EOF) 在電場作用在電場作用下，溶劑化了的陽離子，沿滑動面與緊密層作下，溶劑化了的陽離子，沿滑動面與緊密層作相對運動，攜帶

11、著溶劑一起向陰極遷移，便形相對運動，攜帶著溶劑一起向陰極遷移，便形成了電滲流成了電滲流。電滲流電滲流方向方向樣品分子樣品分子泳動方向泳動方向電滲流的作用特點電滲流的作用特點1. 使液體沿毛細(xì)管壁均勻移動；使液體沿毛細(xì)管壁均勻移動；2. 使攜帶不同電性的分子均向負(fù)極移動、中使攜帶不同電性的分子均向負(fù)極移動、中性分子也隨著電滲流一起移動。性分子也隨著電滲流一起移動。帶負(fù)電荷樣品的電泳模式帶負(fù)電荷樣品的電泳模式1920電滲流的作用特點電滲流的作用特點電滲流電滲流塞流塞流譜帶窄，柱效高譜帶窄，柱效高HPLC層流層流譜帶寬，柱效低譜帶寬，柱效低電滲流的表示方法電滲流的表示方法 電滲流的大小可用電滲淌度電

12、滲流的大小可用電滲淌度(eo) 或電滲流系或電滲流系數(shù)表示數(shù)表示 eo = veo/E = Ld/(teo*E)21影響電滲流的因素影響電滲流的因素電滲流速度電滲流速度 毛細(xì)管毛細(xì)管有效長度有效長度電滲流電滲流流出時間流出時間 電場強度電場強度 221. 與與電場強度電場強度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度一定時，正比于一定時，正比于工作電壓工作電壓；2. 與與毛細(xì)管材料毛細(xì)管材料有關(guān)，不同材料表面有關(guān)，不同材料表面電荷特性不同，產(chǎn)生電滲流大小不電荷特性不同，產(chǎn)生電滲流大小不同。同。3. 與與電解質(zhì)的電解質(zhì)的pH值值、緩沖液的組成緩沖液的組成和和離子強度離子強度有關(guān)有關(guān)影響電滲流的因素

13、影響電滲流的因素23改變電滲流的方法改變電滲流的方法1. 改變外加徑向電場改變外加徑向電場2. 改變緩沖液的成分和濃度改變緩沖液的成分和濃度3. 改變緩沖液的改變緩沖液的pH4. 加入添加劑加入添加劑大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷，電滲流流向陽極。5. 改變溫度改變溫度 (通過改變粘度發(fā)揮作用通過改變粘度發(fā)揮作用)帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)溶液中的遷移速度等于電泳電泳和電滲流電滲流二者的矢量和矢量和。在典型的毛細(xì)管電泳分離中，若有電滲存在典型的毛細(xì)管電泳分離中，若有電滲存在，在，離子的洗脫順序離子的洗脫順序是是: : 首先是最快的陽離子，緊接著是依次減慢的首先

14、是最快的陽離子，緊接著是依次減慢的陽離子；陽離子； ( (+ = 電滲流電滲流 + +ef ) ) 然后是全部的中性分子在一個區(qū)域出現(xiàn)；然后是全部的中性分子在一個區(qū)域出現(xiàn)；( ( 0 =電滲流電滲流 ) ) 最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快的陰離子。的陰離子。 ( (- = 電滲流電滲流 - -ef ) )24電滲流對遷移速率影響電滲流對遷移速率影響 電泳過程中，伴隨著電滲現(xiàn)象電泳過程中，伴隨著電滲現(xiàn)象 電滲流的速度比電泳速度電滲流的速度比電泳速度快快5-7倍倍 利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子一一起帶向同一方向產(chǎn)

15、生起帶向同一方向產(chǎn)生差速遷移差速遷移，在一次電，在一次電泳操作中同時完成正、負(fù)離子的分離分析。泳操作中同時完成正、負(fù)離子的分離分析。 電滲流是毛細(xì)管電泳分離的重要參數(shù)，控電滲流是毛細(xì)管電泳分離的重要參數(shù)，控制制電滲流的大小和方向電滲流的大小和方向，可提高毛細(xì)管電，可提高毛細(xì)管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。 25小結(jié)：電滲流的意義小結(jié)：電滲流的意義遷移時間遷移時間 t = L/v = L/(*E) = L2/(*V)柱效可以用理論塔板數(shù)柱效可以用理論塔板數(shù)n表示表示 n = ( em+ eo)V/(2D) n = 5.54(t/W )2 t為某一電泳峰的遷移時間為

16、某一電泳峰的遷移時間 W為電泳峰的半高峰寬為電泳峰的半高峰寬 理論塔板高度理論塔板高度 H = L/n 26HPCEHPCE的重要參數(shù)的重要參數(shù)電壓越高電壓越高, t越小越小電壓越高電壓越高, n越大越大分離度分離度電泳中兩峰的分離度電泳中兩峰的分離度(Rs)，也稱為分辨率，它表示了也稱為分辨率，它表示了淌度相近的組淌度相近的組分分分開的能力，可表達為分開的能力，可表達為-相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差; 平平-兩者的平均速度兩者的平均速度/平平-分離選擇性分離選擇性; n-柱效柱效tm1、tm2 分別為兩個組份的遷移時間分別為兩個組份的遷移時間W 為峰底的寬度為峰底的寬度 27

17、HPCEHPCE的重要參數(shù)的重要參數(shù)Rs = (n1/2/4)(/平平)Rs = 2(tm2-tm1)/(W1+W2)28影響分離效率的因素影響分離效率的因素區(qū)帶展寬區(qū)帶展寬1.縱向擴散縱向擴散 在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬2 = 2Dt 縱向擴散由擴散系數(shù)擴散系數(shù)和遷移時間遷移時間決定。 大分子的擴散系數(shù)小，可獲得更高的分離大分子的擴散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率。效率。2. 進樣進樣 進樣長度越大，譜帶展寬，內(nèi)徑越細(xì)越明顯 需根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適的進樣方法以減少進樣長度。影響分離效率的因素影響分離效率的因素區(qū)帶展寬區(qū)帶展寬3. 焦耳熱與溫度梯度焦耳熱與溫度梯度 電泳過程產(chǎn)生焦耳熱，在

18、毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度(中心溫度高，則溶液粘度下降，速度加快)，破壞了塞流。 改善方法改善方法 減小毛細(xì)管內(nèi)徑；改善散熱4. 溶質(zhì)與管壁的相互作用溶質(zhì)與管壁的相互作用 存在吸附與疏水作用，導(dǎo)致譜帶展寬。 細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管利于散熱，但由于比表面積大，吸附尤其嚴(yán)重。 改善方法改善方法 加入兩性離子以抑制吸附 毛細(xì)管毛細(xì)管 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 電極電極 檢測器檢測器 電極電極 試樣試樣 緩沖液緩沖液 緩沖液緩沖液 高壓電源高壓電源 (可高至可高至30KV) 主要部件主要部件 高壓電源、毛細(xì)管、檢測器和緩高壓電源、毛細(xì)管、檢測器和緩沖液貯瓶沖液貯瓶30毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管毛細(xì)管 毛細(xì)管是CE的核心

19、部件之一。早期研究集中在毛細(xì)管直徑、長度、形狀和材料方面，目前集中在管壁目前集中在管壁的改性和各種柱的制的改性和各種柱的制備。備。 管壁改性主要是消消除吸附除吸附和控制電滲流控制電滲流，通常采用動態(tài)修飾動態(tài)修飾和表面涂層表面涂層兩類方法。 HPCE對檢測器靈敏度要求相當(dāng)高，故檢測是CE中的關(guān)鍵問題。迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜未用于HPCE外，其它檢測手段均已用于HPCE。檢測器檢測器 類型類型 檢測限檢測限/mol 特點特點紫外紫外-可見可見 10-1310-15 加二極管陣列，光譜信息加二極管陣列，光譜信息 熒光熒光 10-1510-17 靈敏度高，樣品需衍生靈敏度高，樣品需衍生激光

20、誘導(dǎo)熒光激光誘導(dǎo)熒光 10-1810-20 靈敏度極高，樣品需衍生靈敏度極高，樣品需衍生 電導(dǎo)電導(dǎo) 10-1810-19 離子靈敏，需專用的裝置離子靈敏，需專用的裝置毛細(xì)管電泳的分類毛細(xì)管電泳的分類毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳 CZE 毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳 CITP 毛細(xì)管膠束電動色譜毛細(xì)管膠束電動色譜(MECC)毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳 CGE 毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦 CIEF 33 CZE分離機理是基于各被分離物質(zhì)的凈電凈電荷與其質(zhì)量比荷與其質(zhì)量比(荷質(zhì)比荷質(zhì)比)間的差異。CZE常用介質(zhì)為電解質(zhì)水溶液電解質(zhì)水溶液，根據(jù)情況可加入不同有機溶劑或其它添加劑。迄今CZE仍是應(yīng)用

21、最多的模式，應(yīng)用范圍包括氨基酸、肽、蛋白、離子、對映體拆分和其它帶電物質(zhì)的分離。34毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳 CZECZE35-+0tm (min)36CZECZE電泳出峰順序電泳出峰順序以被分離物質(zhì)的荷質(zhì)比荷質(zhì)比間的差異產(chǎn)生分離效果。對于正電荷正電荷，荷質(zhì)比越大，t越??；對于負(fù)負(fù)電荷電荷，荷質(zhì)比越大，t越大。所有中性物質(zhì)中性物質(zhì)的遷移率均與介質(zhì)相同，因此無法分離無法分離。37CZECZE的分離特點的分離特點離子淌度離子淌度 與其所帶電荷電荷q成正比，與粒子半徑粒子半徑r和溶液黏溶液黏度度成反比電滲流電滲流EOF pH值越高，EOF越大 鹽濃度越高，EOF越小 溫度升高，EOF加快，擴散快，分離效率降低38CZECZE