色譜法在藥品研發(fā)中的應(yīng)用及常見(jiàn)問(wèn)題分析

1、發(fā)布日期20061130欄目化藥藥物評(píng)價(jià)>>化藥質(zhì)量控制標(biāo)題色譜法在藥品研發(fā)中的應(yīng)用及常見(jiàn)問(wèn)題分析作者張哲峰部門正文內(nèi)容審評(píng)三部張哲峰摘要：色譜方法在藥物研發(fā)中占據(jù)重要地位，本文介紹了一些常用的色譜方法原理以及在藥物研發(fā)，尤其質(zhì)量控制中應(yīng)用的注意之處，并列舉了申報(bào)資料中色譜法應(yīng)用的一些常見(jiàn)問(wèn)題，以引起大家的關(guān)注。關(guān)鍵詞：色譜法類型常見(jiàn)問(wèn)題 色譜法是一種分離分析技術(shù)，通過(guò)將樣品中的組分分離，再逐個(gè)分析，因此是分析混合物、檢測(cè)化合物純度的有力手段，因而在藥物研發(fā)中廣為應(yīng)用，包括原料藥、中間體、制劑和生物體液中化合物的定性和定量，涉及的待測(cè)物包括手性或非手性藥物、過(guò)程雜質(zhì)、殘留溶媒、附加

2、劑（如防腐劑）、分解產(chǎn)物、從容器和密閉包裝或制造過(guò)程中帶入的雜質(zhì)、植物藥中的農(nóng)藥和代謝物等，包括制備工藝研究、中間體控制、質(zhì)控檢驗(yàn)、穩(wěn)定性及藥物動(dòng)力學(xué)研究等過(guò)程。因此，色譜方法在藥物研發(fā)中占據(jù)舉足輕重的地位。一、色譜法的幾種常見(jiàn)類型1、HPLC法：（1）手性液相色譜將“手性識(shí)別”或“手性環(huán)境”引入色譜系統(tǒng)中，以形成暫時(shí)非對(duì)映異構(gòu)體復(fù)合物，從而直接分離藥物對(duì)映體；或?qū)?duì)映體衍生化生成非對(duì)映體，而得以分離。即分離光學(xué)異構(gòu)體可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流動(dòng)相手性添加劑形成非對(duì)映體來(lái)實(shí)現(xiàn)。（2）離子交換色譜使用表面有離子交換基團(tuán)的離子交換劑作為固定相。帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)

3、（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽(yáng)離子的分離；帶正電荷的交換基團(tuán)（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹(shù)脂中的保留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而被相互分離?？捎胮H程序洗脫。（3）離子對(duì)/親和色譜常用反相離子對(duì)色譜，用緩沖液和加入的對(duì)離子（與被分離的樣品荷相反電荷）分離。分離受pH、離子強(qiáng)度、溫度、濃度和共存的有機(jī)溶劑類型的影響，親和色譜，一般用于大分子，使用配合體（共價(jià)結(jié)合在固體基質(zhì)上的生物活性分子），與其同類的抗原（分析介質(zhì)）反應(yīng)，生成可逆轉(zhuǎn)的復(fù)合物，通過(guò)改變緩沖條件洗脫。（4）正相色譜將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合到固定相惰性載體上，固定相極性流動(dòng)相極性。常用

4、固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。適于分離水溶性的極性、強(qiáng)極性化合物，此時(shí)較小極性的組分比較大極性組分更快地洗脫。（5） 反相色譜將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合到固定相惰性載體上，固定相極性流動(dòng)相極性。常用固定相：烷基、苯基等非極性有機(jī)分子，最常用ODS柱或C18柱，其極性很小，適于分離非機(jī)性、弱極性離子型樣品。是目前藥物研發(fā)中液相色譜的主要分離模式，通常用紫外檢測(cè)器，用水作基本溶劑，選擇性受溶劑強(qiáng)度、柱溫和pH的影響，一般來(lái)說(shuō)較大極性比較小極性組分洗脫更快。紫外檢測(cè)器可以用于各類液相色譜，這類檢測(cè)器要注意的是氘燈老化后的靈敏度降低，其靈敏度因儀器的設(shè)計(jì)和/或者

5、制造廠家的不同而異。用紫外檢測(cè)器和反相HPLC組合得到的色譜圖不一定能真實(shí)的反映實(shí)際情況，原因是：極性比目標(biāo)化合物大得多的化合物可能被掩蓋（在溶劑前沿或死體積時(shí)同時(shí)洗脫）；極性比目標(biāo)化合物小得多的化合物洗脫出來(lái)晚，甚至保留在柱上。為避免此情況發(fā)生，最好使用梯度洗脫法。無(wú)紫外吸收或在檢測(cè)波長(zhǎng)處吸收相差較大的多種化合物，有時(shí)在某一檢測(cè)波長(zhǎng)處不能被檢出，因?yàn)橥ǔＶ挥靡粋€(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)。為避免此情況發(fā)生，可改用其它類型檢測(cè)器，如示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相許可時(shí)，最好使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。（6） 分子排阻色譜以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯酰胺等）作固定相，依據(jù)樣品分子量大小達(dá)到分離目的。大分子不進(jìn)入凝

6、膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進(jìn)入大部分凝膠孔洞，在柱中被滯留，后被洗脫。根據(jù)樣品性質(zhì)可分為兩類：凝膠過(guò)濾（GFC）用于分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖；凝膠滲透（GPC）用于分析脂溶性樣品，如測(cè)定高聚物的分子量。SEC主要依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，因此與樣品、流動(dòng)相間的相互作用無(wú)關(guān)，因此不采用改變流動(dòng)相的組成來(lái)改善分離度。2、 氣相色譜（GC）氣相色譜基于揮發(fā)性樣品由作為流動(dòng)相的載氣運(yùn)載，通過(guò)色譜柱內(nèi)的固定相時(shí)發(fā)生吸附和解吸附過(guò)程進(jìn)行分離。通常GC分析的樣品是低分子量、易揮發(fā)、高溫穩(wěn)定的化合物。藥物和藥物制劑中的殘留溶劑適于GC分析。常用的檢

7、測(cè)器有用于含碳化合物的火焰離子化檢測(cè)器（FID），用于鹵化物的電子捕獲檢測(cè)器（ECD），用于含硫或磷化合物的火焰光度檢測(cè)器（FPD），以及用于含氮或磷化合物的氮磷檢測(cè)器（NPD）。填充柱已多被毛細(xì)管取代來(lái)改進(jìn)分離度和分析時(shí)間，分析物位置與HPLC一樣，用保留時(shí)間（Rt）表示。3、薄層色譜（TLC）薄層色譜是一種最簡(jiǎn)便普通的色譜技術(shù)，系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層，待點(diǎn)樣、展開(kāi)后，與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖作對(duì)比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定（已少用）的方法。對(duì)于本身沒(méi)有顏色的化合物，檢出技術(shù)包括熒光、紫外和噴霧顯色劑。分析物在薄層板上的位置用Rf值（

8、化合物的展開(kāi)距離與溶劑前沿的比值）來(lái)表示。三種方法中，薄層色譜最普通，因?yàn)楸影迳纤械慕M分都可用適宜的檢測(cè)技術(shù)檢出，但通常不如HPLC準(zhǔn)確和靈敏。雖然選用適宜的檢測(cè)技術(shù)，TLC法能見(jiàn)到分析的“全圖”（whole picture）,但分析變異比HPLC大。二、色譜法在藥物研發(fā)中的一般應(yīng)用TLC法主要用于藥物的定性鑒別，可從斑點(diǎn)的位置（Rf值）與顏色兩方面對(duì)藥物進(jìn)行定性，優(yōu)于HPLC和GC法（只能從色譜峰保留時(shí)間把握藥物的定性性質(zhì)），定量時(shí)僅用于有關(guān)物質(zhì)的限度檢測(cè)（半定量），結(jié)合不同原理的檢視技術(shù)，TLC法能見(jiàn)到分析的“全圖”（whole picture）,使各有關(guān)物質(zhì)斑點(diǎn)均可顯示，但變異比HP

9、LC法大；HPLC和GC法的主要優(yōu)勢(shì)為定量，但如果運(yùn)用得當(dāng)，尤其在含量測(cè)定或有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下已采用本法的情況下，利用對(duì)照品與供試品保留時(shí)間相同的特性作為鑒別依據(jù)，既不必專門實(shí)驗(yàn)又增加了鑒別的專屬性，是非?？扇〉?。由于分離分析的定量?jī)?yōu)勢(shì)，HPLC或GC法成為新藥研發(fā)不可缺少的手段，尤其生物樣品中藥物的定量，HPLC或GC法為最常用的分析手段。1、定性鑒別色譜法對(duì)同系物或具有相同母核藥物（尤其制劑）的鑒別具有光譜法和化學(xué)法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但方法專屬性須經(jīng)充分驗(yàn)證，確保結(jié)構(gòu)相近化合物或最難分離物質(zhì)對(duì)在擬定色譜條件下能良好分離。申報(bào)資料所用鑒別法的色譜條件多數(shù)與有關(guān)物質(zhì)、含量測(cè)定一致，實(shí)際上，在后兩者的方

10、法學(xué)研究中，多以合成中間體、起始原料以及降解產(chǎn)物考察其專屬性，但在鑒別中，則以能夠與結(jié)構(gòu)相似的同類藥物良好分離為主要考慮，故在專屬性驗(yàn)證中宜得到體現(xiàn)。但在實(shí)際操作中有時(shí)遇到同一物質(zhì)在完全相同的色譜系統(tǒng)中保留時(shí)間不一致的情況，藥典中對(duì)保留時(shí)間（斑點(diǎn)位置）的一致性未予具體規(guī)定。對(duì)此，可采用如下措施：（1） 注意色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，流動(dòng)相（展開(kāi)劑）與固定相相匹配，在C18柱的反相色譜系統(tǒng)中，流動(dòng)相有機(jī)溶劑比例不低于5，避免C18鏈的隨機(jī)卷曲將造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定導(dǎo)致組份保留值波動(dòng)的現(xiàn)象；TLC的色譜展開(kāi)要適中，使主斑點(diǎn)的Rf值在0.20.7間。（2） 操作中另配制一供試品與對(duì)照品等量混合的溶液，進(jìn)樣（點(diǎn)

11、樣）后出現(xiàn)單一色譜峰（斑點(diǎn)）作為鑒別依據(jù)，以彌補(bǔ)該法之不足。2、有關(guān)物質(zhì)檢查2.1TLC法因設(shè)備和操作簡(jiǎn)便、檢視（顯斑）方法多而較常用，但由于其變異性大，應(yīng)充分驗(yàn)證系統(tǒng)的適用性，使各斑點(diǎn)Rf值在0.20.7之間，并應(yīng)分離清晰。新版歐洲藥典提出了斑點(diǎn)分離度計(jì)算公式：Rs=1.18(RF2-RF1)/h1+h2(Rs:分離度，：溶劑前沿，RF2、RF1：比移值，h1、h2：斑點(diǎn)寬)，可積累經(jīng)驗(yàn)予以采納。雜質(zhì)檢測(cè)可用對(duì)照品比較法或自身對(duì)照法，前者用于已知雜質(zhì)控制并需雜質(zhì)對(duì)照品，也可兩種方法結(jié)合應(yīng)用，自身對(duì)照法應(yīng)注意雜質(zhì)斑點(diǎn)與主成分斑點(diǎn)色調(diào)應(yīng)一致，具有可比性，必要時(shí)可選用熒光薄層板，利用熒光熄滅法檢視

12、，或兩種檢視方法結(jié)合應(yīng)用。結(jié)果的判斷，除控制雜質(zhì)的斑點(diǎn)數(shù)與限度外，也可采用兩種以上不同濃度的對(duì)照溶液分別比較。如某藥品，用自身稀釋成1.5%和0.5%兩種濃度的對(duì)照液，供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，不得多于3個(gè)，允許1個(gè)超過(guò)0.5%，但不得過(guò)1.5%，其余雜質(zhì)斑點(diǎn)均不得過(guò)0.5%作限量要求。在TLC法的方法學(xué)研究中，可配制多個(gè)展開(kāi)劑系統(tǒng)及不同的吸附劑，進(jìn)行幾種組合的試驗(yàn)，將主成分與已知的中間體、副產(chǎn)物、降解物或異構(gòu)體斑點(diǎn)的顏色及分離情況進(jìn)行對(duì)比，確定最佳色譜系統(tǒng)。同時(shí)要采用適宜的稀溶液驗(yàn)證其靈敏度，確定合適的檢視方法，處理好靈敏度與雜質(zhì)限度的關(guān)系。并通過(guò)適當(dāng)改變展開(kāi)劑比例及pH值，考察檢測(cè)方法的耐用性。

13、由于影響TLC法重現(xiàn)性因素較多，如薄層板質(zhì)量、點(diǎn)樣技術(shù)、展開(kāi)室溫濕度等都可能影響色譜分離度或靈敏度，需在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)分離度和靈敏度做出明確要求，如：實(shí)驗(yàn)時(shí)，除供試液、對(duì)照液點(diǎn)樣外，主藥與另一結(jié)構(gòu)相近化合物（最難分離物質(zhì)對(duì)）混合溶液，以及另一低于標(biāo)準(zhǔn)限度的對(duì)照溶液同時(shí)點(diǎn)樣，要求混合溶液應(yīng)顯示分離良好的斑點(diǎn)，后者應(yīng)顯示清晰斑點(diǎn)，以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。2.2根據(jù)藥物的理化性質(zhì)，HPLC法首選C18柱；流動(dòng)相首選甲醇水系統(tǒng)，必要時(shí)加入某種溶劑如乙腈或少量酸堿溶液、緩沖液等，以硅膠為載體的鍵合固定相填充劑適用pH28的流動(dòng)相，pH大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解，此時(shí)應(yīng)選用包覆聚合物填充劑、高純硅膠為載體并

14、具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、非硅膠填充劑或有機(jī)無(wú)機(jī)雜化填充劑等耐堿填充劑；pH小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落，此時(shí)應(yīng)選用有機(jī)無(wú)機(jī)雜化填充劑、具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或而異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠等耐酸填充劑；如分離不好可選用其它類型柱和流動(dòng)相，對(duì)某些品種需用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求時(shí)，可注明適用的牌號(hào)；檢測(cè)器首選UV檢測(cè)器，流動(dòng)相合適時(shí)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可能更好，可積極研究，成熟時(shí)予以采用。 采用的定量方法有：（1）雜質(zhì)對(duì)照品法，即外標(biāo)法。僅限于對(duì)已知雜質(zhì)的控制，如采用該法，則應(yīng)注意對(duì)該對(duì)照品進(jìn)行定性研究，并制訂其質(zhì)量要求。（2）加校正因子的主成分

15、自身對(duì)照法，即以主成分作對(duì)照的內(nèi)標(biāo)法，校正因子可在檢測(cè)時(shí)測(cè)定，但需提供雜質(zhì)對(duì)照品，也可在建立方法時(shí)將測(cè)得的校正因子載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，供以后常規(guī)檢驗(yàn)使用，無(wú)需長(zhǎng)期提供雜質(zhì)對(duì)照品，但也僅適于已知雜質(zhì)的控制。（3）不加校正因子的主成分自身對(duì)照法，實(shí)質(zhì)上也是以主成分作對(duì)照的內(nèi)標(biāo)法，但其前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子相同，適用于具有與主成分相同或類似發(fā)色團(tuán)的雜質(zhì)，因一般情況下，有關(guān)物質(zhì)與主成分具有相似的分子結(jié)構(gòu)，此法不致發(fā)生太大誤差。（4）峰面積歸一法，簡(jiǎn)便快捷，但因各雜質(zhì)響應(yīng)因子不一定相同、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍、儀器對(duì)微量雜質(zhì)和常量主成分的積分精度及準(zhǔn)確度不同等因素，可產(chǎn)生較大的誤差。一

16、般情況下，校正因子在0.91.1時(shí)可不予校正，即3法，校正因子在0.55.0以外時(shí)，應(yīng)改變檢測(cè)波長(zhǎng)使在該范圍內(nèi)，如無(wú)法調(diào)節(jié)，應(yīng)采用（1）法；由于有關(guān)物質(zhì)中有已知的亦有未知的雜質(zhì)，故采用（1）（3）法或（2）（3）法比較理想，同時(shí)控制產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)；使用（3）法時(shí)，應(yīng)在考察已知有關(guān)物質(zhì)的校正因子（應(yīng)位于0.55.0以內(nèi)）或結(jié)合二極管陣列檢測(cè)結(jié)果（主成分與各有關(guān)物質(zhì)的UV吸收偏差應(yīng)不大）后采用，也可根據(jù)物料平衡原理（含量測(cè)定值與有關(guān)物質(zhì)值的和與供試品理論總量的偏差）驗(yàn)證方法是否可行； 一般不主張?jiān)谫|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用（4）法，但在對(duì)映體雜質(zhì)的檢測(cè)中是一個(gè)簡(jiǎn)捷的方法，也可用于穩(wěn)定性研究中對(duì)雜質(zhì)

17、變化的監(jiān)測(cè)。3、含量測(cè)定：色譜法按外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法以峰高或峰面積進(jìn)行定量。內(nèi)標(biāo)法用于GC和HPLC減小測(cè)定誤差，曾經(jīng)起到很好的作用，特別是在GC中，進(jìn)樣量小，內(nèi)標(biāo)法能顯著提高定量精度，隨著現(xiàn)代分析儀器的發(fā)展，原手動(dòng)進(jìn)樣已被定量環(huán)或自動(dòng)化程度高的進(jìn)樣器所取代，內(nèi)標(biāo)法的應(yīng)用受到挑戰(zhàn)，尤其在HPLC中，由于進(jìn)樣量大，外標(biāo)法已具有很好的進(jìn)樣精度，加入內(nèi)標(biāo)，有時(shí)反而對(duì)分析不利，有研究者曾隨機(jī)選取藥典中八個(gè)內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量的藥品進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)法均不能提高分析精度，實(shí)際上，內(nèi)標(biāo)法使分析誤差與經(jīng)常校準(zhǔn)的外標(biāo)法相比增加了2倍，說(shuō)明測(cè)定兩個(gè)峰比測(cè)定一個(gè)峰引入的誤差要大。一般情況下，如下情況適合于使用內(nèi)標(biāo)法：

18、復(fù)雜的樣品制備過(guò)程，如多次提取；低濃度的樣品（靈敏度是確定的），如藥代動(dòng)力學(xué)的研究；在樣品分析中預(yù)計(jì)是很寬的濃度范圍，如藥代動(dòng)力學(xué)研究。外標(biāo)法多用于原料驗(yàn)收、成品質(zhì)控、穩(wěn)定性和TLC法，內(nèi)標(biāo)法多生物體液和GC法。需要注意的是，在外標(biāo)法中，保持供試品濃度與對(duì)照品濃度相近可以改善方法的準(zhǔn)確性。峰高定量?jī)H在峰高隨樣品量呈線性變化時(shí)使用，當(dāng)峰形不正或色譜柱超載時(shí)，峰高法會(huì)出現(xiàn)較大誤差，由于峰高測(cè)量受相鄰重疊峰的干擾較小，故比峰面積定量更為準(zhǔn)確，如BP中慶大霉素C組份檢測(cè)明確要求峰高定量。峰面積定量的好處是其精度受儀器參數(shù)變化的影響較小，對(duì)不是高斯分布的峰形也能較好定量，但其準(zhǔn)確度受相鄰峰重疊的影響。一

19、般情況下，為得到較好的精確度，宜用峰面積定量；為最大限度地排除其它組份的干擾，則多用峰高定量。痕量分析中多用峰高法定量。三、申報(bào)資料中幾種常見(jiàn)問(wèn)題1、方法靈敏度不夠定量限高于雜質(zhì)限度 例1.有關(guān)物質(zhì)檢查法的定量限為0.75ng，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定雜質(zhì)限度不得過(guò)1.0%，折算為0.5ng，表明此法不能有效檢測(cè)產(chǎn)品雜質(zhì)，需重新建立有效的雜質(zhì)檢測(cè)方法。2、檢測(cè)方法缺乏互補(bǔ)性例2.某藥品有關(guān)物質(zhì)研究中顯示，合成中重要中間體N環(huán)己基5（4氯丁基）1，2，3，4四氮唑在檢測(cè)波長(zhǎng)處無(wú)吸收，故建立的有關(guān)物質(zhì)檢查方法無(wú)法檢測(cè)該物質(zhì)。需建立該中間體適宜的檢測(cè)方法，考察其在產(chǎn)品中的殘留情況，視情況訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。例3.提供的有

20、關(guān)物質(zhì)檢查方法不能檢測(cè)中間體，請(qǐng)制訂合適的中間體檢測(cè)方法（如TLC法等），并提供方法學(xué)研究資料，考察其在產(chǎn)品中的殘留情況，視情況訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 3、強(qiáng)制降解忽視藥物的敏感條件例4.對(duì)乙酰氨基酚水解后極易受到氧化破壞，需補(bǔ)充考察本品氧化破壞后主成分與降解物的分離情況，以驗(yàn)證有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的可行性。 4、強(qiáng)制降解條件過(guò)于劇烈，無(wú)法判斷主峰與降解產(chǎn)物的分離情況例5.樣品經(jīng)堿解、氧化破壞后，主藥頭孢特侖匹酯被完全破壞，無(wú)法說(shuō)明其降解物與主峰的分離情況，需調(diào)整降解條件的劇烈程度，考察主峰與降解產(chǎn)物的分離情況。5、供試液制備處理欠妥，不能如實(shí)反映產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)情況例6.某藥品有關(guān)物質(zhì)檢查中供試液制備經(jīng)過(guò)了

21、堿化、萃取等復(fù)雜過(guò)程，是否會(huì)引起產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)的變化而影響檢出結(jié)果，需說(shuō)明或改進(jìn)供試液制備方法。 例7.為提高供試液中主藥濃度，其制備經(jīng)過(guò)了固相萃取過(guò)程，測(cè)定結(jié)果難以如實(shí)反映產(chǎn)品中雜質(zhì)情況，建議改用其他合適方法。6、檢測(cè)波長(zhǎng)缺乏針對(duì)性例8.從提供的UV圖譜可見(jiàn)，氫溴酸右美沙芬具有很強(qiáng)的末端吸收，220nm附近的吸收強(qiáng)度遠(yuǎn)高于278nm波長(zhǎng)處，需提供同一份加速破壞樣品分別用該兩波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)的色譜圖，并比較其雜質(zhì)峰的個(gè)數(shù)及峰面積，以確定合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。7、忽視合成中間體、粗品在方法專屬性驗(yàn)證中的作用例9.某藥品在合成中，可產(chǎn)生其產(chǎn)品或中間體的順式異構(gòu)體等副產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)相似難以分離，需考察在擬定色譜條件下，主成分與各中間體、副產(chǎn)物的分離情況，必要時(shí)在系統(tǒng)適應(yīng)性驗(yàn)證中規(guī)定最難分離物質(zhì)對(duì)的分離度要求，以確保色譜系統(tǒng)的有效性。8、積分時(shí)間不充分，不能有效檢出