消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)

1、消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)第一篇壓力蒸汽滅菌效果評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)1主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了壓力蒸汽滅菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及其評(píng)價(jià)滅菌效果的檢測(cè)方法。本方法適用于對(duì)壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的評(píng)價(jià)。2試齊1J本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未說(shuō)明規(guī)格者，均為分析純（ AR）,水為蒸儲(chǔ)水。2. 1 蛋白陳。2. 2葡萄糖。2. 3澳甲酚紫酒精溶液：取澳甲酚紫 2. 0g,溶于100mL95%乙醇中。2. 4澳甲酚紫蛋白陳水培養(yǎng)基配制：蛋白陳 10. 0g,葡萄糖5. 0g,溶于1000mL蒸 儲(chǔ)水中，調(diào)pH值至7. 07. 2,然后再加2%澳甲酚紫酒精溶液0. 6mL,搖勻后，按5m L/管，分裝包口，置壓力蒸汽滅

2、菌器中，于 115c滅菌40min后備用。3指小菌嗜熱脂肪桿菌芽胞（ATCC 7953或SSI K31）菌片，含菌量為5X1055M06cfu/片，1 21c下，殺滅90%微生物所需時(shí)間D121值為1. 31. 9min,殺滅時(shí)間（KT值）為0 19mi n,存活時(shí)間（ST值）為49min。4化學(xué)指示劑需用衛(wèi)生部批準(zhǔn)的化學(xué)指示劑。5技術(shù)要求壓力蒸汽滅菌器壓力，MPa/cm2溫度C火菌時(shí)間,min下排氣式0.070115400.10512130預(yù)真空式0.2101344-6國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局1995-12-15批準(zhǔn)1996-07-01實(shí)施6檢測(cè)方法6 1生物學(xué)指標(biāo)（用作壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的依據(jù)

3、）7 1 1 將嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片兩個(gè)分別放入滅菌小紙袋內(nèi)，置于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包中心部位。8 1 2 滅菌柜室內(nèi)，上、中層中央和排氣口處各放置一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包（由 3 件平紋長(zhǎng)袖手術(shù)衣，4塊小手術(shù)巾，2塊中手術(shù)巾，1塊大手術(shù)巾，30塊10cmK 10cm、8層紗布敷 料包裹成25cmK30cnriX30cm大?。?。手提壓力蒸汽滅菌器用通氣貯物盒 （22cnriX 13cnriX6cm） 代替標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包，盒內(nèi)盛滿(mǎn)中試管，指示菌片放于中心部位兩只滅菌試管內(nèi)（試管口用滅菌牛皮紙包封），將盒平放于手提壓力蒸汽滅菌器底部。9 1 3 經(jīng)一個(gè)滅菌周期后，在無(wú)菌條件下，取出標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包或通氣貯物盒中的指示菌片，投入

4、澳甲酚紫葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中，56c培養(yǎng)48h,觀(guān)察培養(yǎng)基顏色變化。10 2 化學(xué)指標(biāo)在物品包外用化學(xué)指示膠帶， 可作為物品是否經(jīng)過(guò)滅菌的處理標(biāo)志。 在物品包內(nèi)中心部 位用化學(xué)指示劑，可作為物品是否滅菌的參考標(biāo)志。7 結(jié)果判定及評(píng)價(jià)7 1 同次檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包或通氣貯物盒內(nèi)，每個(gè)指示菌片接種的溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基全部不變色， 判定為滅菌合格。 指示菌片之一接種的溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基由紫 色變?yōu)辄S色時(shí)，判定為滅菌不合格。11 2 化學(xué)指示劑的顏色變?yōu)榕c滅菌合格標(biāo)準(zhǔn)色相同時(shí)， 或熔化時(shí)作為滅菌合格的參考標(biāo)準(zhǔn)。第二篇 紫外線(xiàn)表面消毒效果評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)12 主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了物體表

5、面消毒用紫外線(xiàn)的波長(zhǎng)、 強(qiáng)度及評(píng)價(jià)其消毒效果的物理學(xué)指標(biāo)和生物學(xué)檢測(cè)方法。本方法適用于紫外線(xiàn)直接照射到的物體表面消毒效果評(píng)價(jià)。13 指示菌14 1 大腸桿菌（ 8099 或 ATCC 25922）。15 2 枯草桿菌黑色變種芽胞（ ATCC 9372）。16 物理學(xué)指標(biāo)10. 1在電壓220V時(shí)，普通30W直管型紫外線(xiàn)燈，在室溫為2025c的使用情況下，253. 7nm紫外線(xiàn)輻射強(qiáng)度（垂直1m處）應(yīng)學(xué)70仙W/cm210. 2在電壓220V時(shí)，高強(qiáng)度紫外線(xiàn)燈，在室溫為2025C的使用情況下，253. 7n m紫外線(xiàn)輻射強(qiáng)度（垂直1m處）應(yīng)200仙W/cm210 3 照射劑量按式（ 1）計(jì)算：1

6、）劑量（aW s/cm2=強(qiáng)度（W/cm2刈寸問(wèn)（s）11 檢測(cè)方法12 1 物理學(xué)檢測(cè)方法11. 1. 1燈管的紫外線(xiàn)強(qiáng)度（aW/cm2用中心波長(zhǎng)為253. 7nm的紫外線(xiàn)強(qiáng)度測(cè)定 儀（標(biāo)定有效期內(nèi)），在燈管垂直位置1m 處測(cè)定。11 1 2 在實(shí)際應(yīng)用中消毒表面的照射強(qiáng)度應(yīng)以燈管與消毒對(duì)象的實(shí)際距離測(cè)定。11 1 3 表面消毒接受的照射劑量，應(yīng)達(dá)殺滅目標(biāo)微生物所需。對(duì)大腸桿菌，照射劑量應(yīng)達(dá)到20000仙VW- s/cm2對(duì)枯草桿菌黑色變種芽胞應(yīng)達(dá)到100000仙VW- s/cm211 2 生物學(xué)檢測(cè)方法11 2 1 采用載體定量消毒試驗(yàn)。載體制備按本標(biāo)準(zhǔn)附錄 C 進(jìn)行。11 2 2 開(kāi)啟紫

7、外線(xiàn)燈 5min 后，將 8 個(gè)染菌玻片平放于滅菌器皿中，水平放于適當(dāng)距離照射，于4 個(gè)不同間隔時(shí)間各取出 2 個(gè)染菌玻片，分別投入2 個(gè)盛有 5mL 洗脫液（ 1吐溫 80， 1蛋白胨生理鹽水）試管中，振打 80 次。11 2 3 經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取0 5mL 洗脫液，作平板傾注，每個(gè)染菌玻片接種兩個(gè)，放37培養(yǎng)48h 作活菌計(jì)數(shù)。11 2 4 陽(yáng)性對(duì)照，除不作照射處理外，取2 個(gè)染菌玻片分別投入 2 個(gè)盛有 5mL 洗脫液中振打80 次，余按 4 2 3 進(jìn)行。11 2 5 計(jì)算殺滅率12 判定標(biāo)準(zhǔn)12. 1對(duì)指示菌殺滅率99 9%判為消毒合格。12 2 達(dá)物理學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，作為消毒合格的參

8、考標(biāo)準(zhǔn)。第三篇 液體消毒劑消毒效果評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)本方法具體規(guī)定了消毒劑消毒效果生物學(xué)檢測(cè)方法及其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本方法適用于消毒劑對(duì)各種物體的消毒效果評(píng)價(jià)。14 理化指標(biāo)將消毒劑置20 2水浴中，測(cè)定在使用濃度下殺滅指示微生物達(dá)到消毒或滅菌所需的最短時(shí)間（ min ）。15 指示微生物15 1 細(xì)菌15 1 1 細(xì)菌繁殖體：金黃色葡萄球菌（ ATCC 6538）、大腸桿菌（8099或 ATCC25922）。16 1 2 細(xì)菌芽胞：枯草桿菌黑色變種芽胞（ ATCC 9732）。17 2 真菌：白色念珠菌（ ATCC 10231）。18 3 乙型肝炎表面抗原：純化抗原（ 1 0mg/mL ）。16 檢測(cè)

9、方法16 1 中和試驗(yàn)（見(jiàn)附錄 A ）。16 2消毒劑定性消毒試驗(yàn)（見(jiàn)附錄B ）。16 3消毒劑定量消毒試驗(yàn)（見(jiàn)附錄C）。16 4消毒劑殺菌能量試驗(yàn)（見(jiàn)附錄D ）。19 5 乙型肝炎表面抗原（ HBsAg ）抗原性破壞試驗(yàn)（見(jiàn)附錄 E）。20 消毒效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)17. 1對(duì)細(xì)菌和真菌的殺滅率99 9%,對(duì)HBsAg,將檢測(cè)方法靈敏度104倍或5義104 倍（載體試驗(yàn)）的 HBsAg 抗原性破壞，可判為消毒合格。17 2 對(duì)枯草桿菌黑色變種芽胞全部殺滅，可判為滅菌合格。17 3 在實(shí)際應(yīng)用中消毒效果評(píng)價(jià)以有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)的最低濃度和最短時(shí)間為該消毒劑達(dá)到實(shí)用消毒所需的濃度和時(shí)間。附錄 A中和劑中和效

10、果試驗(yàn)（補(bǔ)充件）A1 內(nèi)容提要為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)消毒劑對(duì)微生物的殺滅作用，消毒試驗(yàn)中要求選擇適當(dāng)中和劑。所選中和劑不僅能及 時(shí)中止消毒劑的殺微生物作用，且中和劑本身及其與消毒劑的反應(yīng)產(chǎn)物（下稱(chēng)中和產(chǎn)物）尚需對(duì)微生物無(wú)抑制或殺滅作用，對(duì)培養(yǎng)基無(wú)不良影響。A2 培養(yǎng)基和試劑A2 1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 00g牛肉膏3 00g氯化鈉5 00g瓊脂15 00g蒸餾水1000 00mL制法：除瓊脂外，其他成分溶解于蒸儲(chǔ)水中，調(diào) pH至7. 27. 4,加入瓊脂后加熱溶解，過(guò)濾分裝，經(jīng) 121 、壓力蒸汽作用 30min ，滅菌后備用。A2. 2 0. 03mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7 . 27

11、. 6,下稱(chēng) PBS）。成分：磷酸氫二鈉2 84g磷酸二氫鉀1 36g蒸餾水1000 00mL制法：將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀溶解于蒸儲(chǔ)水中，pH為7. 27. 4,分裝，經(jīng)121 C、30min壓力蒸汽滅菌后備用。A3 器材A3 1 錐形燒瓶。A3 2 平皿（直徑9cm）。A3 3 量筒。A3 4 精密 pH 試紙。A3 5 無(wú)菌試管。A3 6 無(wú)菌刻度吸管（ 1 0， 5 0， 10 0mL）。A3 7 恒溫培養(yǎng)箱。A3 8 冰箱。A3 9 菌落計(jì)數(shù)器。A3 10 酒精燈。A4 中和劑（注明生產(chǎn)廠(chǎng)家，批號(hào)）A5 操作方法A5. 1 用PBS將指示菌制成 5X 1055X 106cfu/mL懸

12、液。A5 2 將消毒劑用滅菌蒸餾水配制成3 種不同濃度，在不加中和劑的情況下，測(cè)知該消毒劑 10min抑殺指示菌99 9以上的最低有效濃度。A5 3 取消毒劑 10min 抑殺指示菌的最低有效濃度與待選擇中和劑進(jìn)行試驗(yàn)， 選出中和劑種類(lèi)并依據(jù)等當(dāng)量中和原則，調(diào)整中和劑濃度，選出試驗(yàn)濃度的消毒劑使用中和劑的濃度。A5 4 中和劑選擇試驗(yàn)時(shí)，先將消毒劑 1 0mL 與中和劑溶液9 0mL 混合，制成中和產(chǎn)物溶液， 再按表A1 分組進(jìn)行。表 A1 中和劑選擇試驗(yàn)photo-2A6 中和試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告方法（如表A2 ）表 A2 中和試驗(yàn)結(jié)果舉例photo-33、 4 、 5 組間誤差率計(jì)算公式A7 判定

13、標(biāo)準(zhǔn)A7. 13、4、5組菌數(shù)相似，其誤差率W10%。A7 2 6 組無(wú)菌生長(zhǎng)。A7 3 2 組菌數(shù)明顯少于3、 4、 5 組。A7 4 1 組不長(zhǎng)菌或明顯少于2 組。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的中和劑表明可消除消毒劑對(duì)指示菌的作用，中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對(duì)指示菌無(wú)毒害，判定為該消毒劑的中和劑。A8 消毒試驗(yàn)用中和劑濃度的選擇按A5. 4步驟進(jìn)行，按 A7. 17. 4的標(biāo)準(zhǔn)判定。附錄 B消毒劑定性消毒試驗(yàn)(補(bǔ)充件)B1 內(nèi)容提要定性消毒試驗(yàn)是測(cè)定受消毒因子作用后的樣本有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的試驗(yàn)方法。用于對(duì)消毒因子滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細(xì)菌效果的初步評(píng)價(jià)。B2 培養(yǎng)基與試劑B2 1 普通肉湯培養(yǎng)基B2 1

14、 1 成分：蛋白胨 10 00g氯化鈉 5 00g肉浸液1000 00mLB2 1 2 制法：取蛋白胨、氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 至弱堿性，煮沸、濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7. 27. 4,壓力蒸汽滅菌備用。B2 2 試劑82 . 2. 1 稀釋液：含 1%蛋白月東的 0. 03mol/L PBS (pH7. 27. 4)。B2 2 2 滅菌蒸餾水。83 2 3 中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A 選擇。84 1 滅菌刻度吸管（ 1 0， 5 0， 10 0mL）。B3 2 滅菌試管。B3 3 滅菌三角燒瓶。B3 4 酒精燈。B3 5 恒溫水浴箱。83 6 恒溫培養(yǎng)箱。84 試驗(yàn)方法B4. 1

15、將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液配制成含菌量為5X 1055X 106cfu/mL的菌懸液。B4 2 將滅菌試管10 支排列于試管架上，標(biāo)記管號(hào)。B4 3 每個(gè)試管加滅菌蒸餾水2 5mL ，放20 2 水浴中。B4 4 于第 1 管內(nèi)加適當(dāng)濃度消毒液2 5mL ，混勻后取2 5mL 移入第 2 管，再次混勻，從第 2管中取 2 5mL 移入第 3 管，以此類(lèi)推至第9 管，混勻后棄去2 5mL ，第 10管中不加消毒液作對(duì)照。84. 5加菌懸液2. 5mL于各管中，混勻并記錄各管加菌時(shí)間，使菌藥混合液中含菌量均為105106cfu/mL 。84 6 各管分別于加菌后4 個(gè)不同間隔時(shí)間，取出 0 5

16、mL ，加入 4 5mL 中和劑內(nèi)，中和10min后，取出 0 5mL 加入 4 5mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯管內(nèi)。B4 7 將接種細(xì)菌的肉湯管放37培養(yǎng)48h ，觀(guān)察初步結(jié)果，無(wú)菌生長(zhǎng)管繼續(xù)培養(yǎng)至第7 天。B4 8 試驗(yàn)重復(fù) 5 次。B5 結(jié)果判定B5 1 若肉湯管混濁，則表示有菌生長(zhǎng)，記為陽(yáng)性，以（ + ）表示。B5 2 若培養(yǎng)至第7 天，肉湯管澄清，則表示無(wú)菌生長(zhǎng)，記為陰性，以（）表示。85 3 對(duì)難以判定的肉湯管， 取 0 1mL 接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板， 用滅菌 L 棒涂勻， 放 37培養(yǎng) 48h， 觀(guān)察菌落形態(tài)；并做涂片染色鏡檢，判斷是否有指示菌生長(zhǎng)。有指示菌生長(zhǎng)記為陽(yáng)性。B5 4 5 次試驗(yàn)，均

17、無(wú)指示菌生長(zhǎng)表示達(dá)到滅菌。附錄 C消毒劑定量消毒試驗(yàn)（補(bǔ)充件）C1 內(nèi)容提要定量消毒試驗(yàn)是測(cè)定受消毒因子作用后，樣本殘存微生物數(shù)量的試驗(yàn)方法，以殺滅率表示結(jié)果。用于對(duì)消毒劑殺滅效果的評(píng)價(jià)。C2 培養(yǎng)基與試劑C21普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按本標(biāo)準(zhǔn)A21制備。C22試劑C2.2.1稀釋液：含 1%蛋白月東的 0. 03mol/LPBS （pH7. 27. 4）。C22 2滅菌蒸餾水。C2 2 3 中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A 選擇。C2. 2. 4 0. 03mol/L PBS (pH7. 27. 4)。20 2水浴中。C2 2 5 洗脫液：含中和劑、 1蛋白胨、 0 1吐溫 80 的 PBS。C3器材C3

18、 1 滅菌刻度吸管（ 1 0， 5 0 ， 10 0mL ）。C32滅菌試管。C33滅菌三角燒瓶。C34滅菌平皿（直徑為 9cm）。C35恒溫水浴箱。C36恒溫培養(yǎng)箱。C37酒精燈。C38菌落計(jì)數(shù)器。C39微量進(jìn)樣器。C3. 10載體：根據(jù)需要及試驗(yàn)?zāi)康倪x用經(jīng)脫脂處理0. 5cmX1. 0cm大小的布片、紙片、玻片、橡膠片、塑料片、不銹鋼片或鋁片。C4 試驗(yàn)方法C4 1 定量懸液試驗(yàn)C4. 1. 1將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液稀釋成含菌量為5X1055X 106cfu/mL的菌懸液。C4 1 2 將消毒劑用滅菌蒸餾水稀釋成3 個(gè)不同濃度，各吸取4 5mL 分別加入三個(gè)試管內(nèi)，放C4 1 3待

19、試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，在三個(gè)試管中分別加入0 5mL 菌懸液（含菌量為5X 1055X106cfu/mL ）,混勻并開(kāi)始記時(shí)。C4 1 4 分別于 4 個(gè)不同間隔時(shí)間，各取0 5mL 菌液混合液移入 4 5mL 中和劑中混勻。C4 1 5 中和10min ，作適當(dāng)稀釋后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。C4. 1. 6陽(yáng)性對(duì)照以洗脫液代替消毒液，同時(shí)按 C4. 1. 2C4. 1. 5進(jìn)行。C4 1 7 按不同稀釋度推算出每個(gè)樣本存活菌數(shù)（ cfu/mL ），按式（ C1 ）計(jì)算殺滅率：C4 1 8 試驗(yàn)重復(fù) 5 次。C4 2 載體定量試驗(yàn)C4. 2. 1將滅菌載體平放于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)載體滴注定量菌液

20、（載體回收菌量達(dá)5X1055X106cfu/片），涂勻，放37c培養(yǎng)箱待干。應(yīng)用市售染菌載體時(shí)，回收菌量亦應(yīng)達(dá)5X 1055X106cfu/片）。C4 2 2 用滅菌蒸餾水將消毒劑稀釋成3 個(gè)不同濃度，各吸取5mL 分別加入三個(gè)試管內(nèi)，放20 2 水浴中。C4 2 3 待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，加入染菌載體，作用至規(guī)定時(shí)間，將染菌載體移入含中和劑的5mL洗脫液試管內(nèi)，中和10min,振打80次，適當(dāng)稀釋?zhuān)臃N兩個(gè)平板。放37c培養(yǎng)24 48h ，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。C4. 2. 4陽(yáng)性對(duì)照，以洗脫液代替消毒液按C4. 2. 2C4. 2. 3進(jìn)行。C5 結(jié)果判定C5. 1 5次試驗(yàn)的殺滅率均

21、R 99. 9%判為消毒合格。C5 2 對(duì)枯草桿菌黑色變種芽胞5 次試驗(yàn)均全部殺滅判為消毒合格。附錄 D有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)（補(bǔ)充件）D1 內(nèi)容提要有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)是測(cè)定消毒劑對(duì)有機(jī)物保護(hù)條件下的微生物的殺滅作用，以殺滅率表示之，其結(jié)果與該消毒劑定量消毒試驗(yàn)相比較，用于評(píng)價(jià)有機(jī)物對(duì)消毒劑的殺菌能力的影響。D2 培養(yǎng)基與試劑D2 1 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按本標(biāo)準(zhǔn)A2 1 制備。D2 2 試劑：D2 2 1 稀釋液：同 C2 2 1。D2 2 2 滅菌蒸餾水。D2 2 3中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A 進(jìn)行選擇。D2. 2. 4 0. 03mol/L 磷酸緩沖液（pH7 . 27. 4）（簡(jiǎn)稱(chēng) PBS）。D2 2

22、 5 洗脫液：含1蛋白胨，0 1吐溫80 的生理鹽水。D2 2 6 小牛血清加入菌懸液中，使其最終濃度為 10。D3 器材C3。D4 試驗(yàn)方法D4 1 實(shí)驗(yàn)前預(yù)先將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)， 用稀釋液稀釋?zhuān)?加入小牛血清， 使其最終含血清量為 10 ，含菌數(shù)為5X 1055X 106cfu/mL ,以此作為試驗(yàn)菌懸液。D4. 2 以下步驟同本標(biāo)準(zhǔn) C4. 1. 2C4. 1. 8。D5 結(jié)果判定D5 1 5 次試驗(yàn)的殺滅率均大于 99 9 所需最低濃度和最短時(shí)間， 判為該消毒劑在有機(jī)物存在下，可以達(dá)到消毒的有效濃度和時(shí)間。D5 2 此有效濃度和時(shí)間與定量消毒試驗(yàn)達(dá)到消毒的有效濃度和時(shí)間相同或相近， 判

23、為有機(jī)物對(duì)消毒劑殺菌作用無(wú)明顯影響。達(dá)到消毒最低有效濃度增加一倍以上或最短作用時(shí)間延長(zhǎng)一倍以上者可視為有明顯影響。附錄 E乙型肝炎表面抗原破壞試驗(yàn)（補(bǔ)充件）E1 內(nèi)容提要乙型肝炎表面抗原（ HBsAg ）破壞試驗(yàn)是以 HBsAg 的抗原活性為間接標(biāo)志，評(píng)價(jià)消毒因子對(duì)乙型肝炎病毒（ HBV ）滅活能力的試驗(yàn)方法。適用于評(píng)價(jià)化學(xué)消毒劑、紫外線(xiàn)對(duì)HBV 的消毒效果。E2 試劑E2 1 小牛血清（ 56 ， 30min 滅活）。E2. 2 0. 01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH7. 27. 4)。E2 3 純化 HBsAg （ 1 0mg/mL ）。E2. 4固相放射免疫分析法試劑，要求特

24、異性100%,精密性CVW15%,靈敏度V 1. 0ng/mL,線(xiàn)性 r0. 95。E2. 5 酶聯(lián)免疫吸附法試劑，要求特異性100%,精密性CVW15%,靈敏度w 3. 2ng/mL ,線(xiàn)性r0. 95。E3 器材E3. 1 吸量器：包括試管、吸管（0. 1, 1. 0, 5. 0和10. 0mL4種）和微量進(jìn)樣器（100. 0L）。E3 2 載體（直徑1 5cm 大小的不銹鋼片）。E3 3 免疫計(jì)數(shù)儀。E3 4 酶聯(lián)免疫測(cè)定儀。E3.5 低溫冰箱（一30c一70C）。E4 HBsAg 懸液的配制E4 1 取 0 01mol/LPBS （pH7 2c 7 4） 9 4mL 加入小牛血清0 6

25、mL ，配成含6小牛血清的懸液。再取該 PBS 9 0mL ，加入濃度為 1 0mg/mL 的純化 HBsAg 懸液 1 0mL ，使成含 5 4小牛血 清，HBsAg濃度為100g/mL的試驗(yàn)用 HBsAg懸液。E4 2 將試驗(yàn)用 HBsAg 懸液 1 0mL 盛裝入容量為 1 5mL 的玻璃安瓿中，封口，放 30c 70冰箱保存?zhèn)溆?。保存期為三個(gè)月。E5 HBsAg 的檢測(cè)方法E5 1 固相放射免疫分析法（ SPRIA ）。E5 2 酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）。E6 中和劑選擇在測(cè)定消毒劑對(duì)HBsAg 的破壞效果時(shí)，應(yīng)先選出適宜的中和劑及其使用濃度，再進(jìn)行破壞試驗(yàn)。所用中和劑：a 應(yīng)

26、能有效而及時(shí)中止消毒劑的殘余作用；b 中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對(duì)HBsAg的抗原活性沒(méi)有影響，亦不影響檢測(cè)方法對(duì) HBsAg 檢出的靈敏度。E6 1 將消毒劑用無(wú)菌蒸餾水配成不同濃度，取1 2mL 消毒液與 0 3mLHBsAg 懸液混勻，置20 2 水浴條件下，作用10min ，測(cè)定該消毒劑 10min 抑制或破壞HBsAg 抗原性的最低有效濃度。E6 2 取消毒劑 10min 抑制或破壞HBsAg 抗原性的最低有效濃度與待選中和劑進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)可按下列組另1J進(jìn)行：a.消毒液0. 9mL+HBsAg懸液0. 1mL; b.消毒液0. 4mL+HBsAg懸液0. 1mL作 用10min后

27、+含20%小牛血清的中和劑 0. 5mL; c.先取含20%小牛血清的中和劑 1mL與消毒液1mL, 混勻，作用1030min,制成中和產(chǎn)物溶液， 再行試驗(yàn)。中和產(chǎn)物溶液0. 9mL+HBsAg懸液0. 1mL; d.含 10%小牛血清的 PBS0.9mL+HBsAg懸液0.1mL；e.含10%小牛血清的中和劑 0.9mL+HBsAg懸液0.1mL; f.中和產(chǎn)物溶液 0. 9mL+PBs0. 1mL。經(jīng)檢測(cè)只有在 c、d、e組HBsAg活性的測(cè)定值相近（相差 10% 以下）并都明顯多于b 組， a 組 HBsAg 活性不能檢出或檢出活性明顯少于b 組， f 組陰性對(duì)照正常，方可證明所選中和劑

28、及其使用劑量是適宜的。E6 3 進(jìn)行消毒試驗(yàn)時(shí)，依據(jù)消毒劑與中和劑等當(dāng)量中和原則，適當(dāng)調(diào)整中和劑的用量。再次按E6 2 步驟測(cè)定中和效果后，方可進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。E7 破壞試驗(yàn)方法E7 1 懸液法懸液法指將HBsAg 在懸液中與消毒劑相互作用并進(jìn)行抗原性破壞效果觀(guān)察的試驗(yàn)方法。E7 1 1 HBsAg 懸液的濃度為檢測(cè)試劑靈敏度的 104 倍。如檢測(cè)試劑的靈敏度為 1ng/mL ， HBsAg 的濃度應(yīng)為10（ig/mL。E7. 1. 2 取含5%小牛血清的 PBS2. 7mL加到含0. 3mL濃度為100g/mL的HBsAg懸液中,混勻。E7 1 3 取小牛血清 20mL 加到含 80mL

29、 滅菌的中和劑溶液中，混勻。E7. 1. 4破壞試驗(yàn)：將預(yù)定消毒液濃度 1. 25倍的消毒液與 HBsAg懸液按4 ： 1比例混合，混合液容量不少于1 5mL 。然后置 20 2水浴條件下，作用達(dá)規(guī)定時(shí)間，即刻取0 3mL 混合液與等體積含20%小牛血清的中和劑混勻， 作用1030min,取樣測(cè)定殘留HBsAg的活性，每一樣本平行測(cè)定 2份, 每份0. 1mL,取其平均值，判定破壞效果。每種消毒劑觀(guān)察3個(gè)濃度，每一濃度觀(guān)察 4個(gè)作用時(shí)間。試驗(yàn)重復(fù) 5 次。E7 1 5 陽(yáng)性對(duì)照：取含20小牛血清的中和劑1mL ，加到含 1mL 試驗(yàn)用消毒液的試管中混勻，作用1030min,制成中和產(chǎn)物溶液。取

30、該中和產(chǎn)物溶液0. 9mL加入試驗(yàn)濃度的 HBsAg懸液0. 1mL取樣檢測(cè)，每一樣本檢測(cè) 3 份，每份 0 1mL ，取其平均值為陽(yáng)性對(duì)照值。E7 1 6 陰性對(duì)照：取含 20小牛血清的中和劑 1mL 加到含 1mL 試驗(yàn)用消毒液的試管中，混勻，作用1030min,取樣檢測(cè)，每一樣本檢測(cè)3份，每份0. 1mL取其平均值為陰性對(duì)照值。應(yīng)注意陰性對(duì)照不能用試劑盒的陰性對(duì)照樣本。E7 2 載體法載體法指將在載體表面的 HBsAg 與消毒因子相互作用，并進(jìn)行抗原性破壞效果觀(guān)察的試驗(yàn)方法。E7 2 1 HBsAg 載體的制備E7 2 1 1 載體為直徑1 5cm 大小的不銹鋼片，經(jīng)洗滌劑煮沸洗滌脫脂、壓力蒸汽滅菌備用。E7. 2. 1. 2 HBsAg懸液的濃度為檢測(cè)方法靈敏度的5X104倍。如靈敏度為 1ng/mL, HBsAg的濃度應(yīng)為50g/mL。E7 2 1 3 HBsAg 的污染方法為滴染法。滴染時(shí)，將滅菌載體平鋪于無(wú)菌平皿內(nèi)，用微量進(jìn)樣器吸取HBsAg懸液，滴注于載體中央，每個(gè)載體20 L。然后用L型白金絲將懸液涂布均勻，放 37c培養(yǎng)有f 4060min,待懸液干燥后進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。E7 2 2 抗原性破壞試驗(yàn)取污染HBsAg的載體，平放于無(wú)菌平皿內(nèi)，用吸管吸取預(yù)定濃