4食品中番瀉苷A、番瀉苷B和大黃素甲醚的測定

1、附件2食品中番瀉苜A、番瀉苜B和大黃素甲日迷的測定BJS 202117i 范圍本方法規(guī)左了食品含保健食品中番瀉昔A、番瀉昔B和大黃素甲空含量的高效液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜測泄方法.本方法適用于飲料、代用茶等食品及片劑、膠鋌、顆粒劑、口服液等劑型的保健食品中番 瀉昔A、番瀉昔B和大黃素甲日迷含量的測迫.2 原理試樣經(jīng)甲醇-甲酸彼溶液9:1超聲提取、離心、過濾后,濾液供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測泄,外標(biāo)法泄量.3 試劑和材料注：水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水.4 試劑1.1.1 甲酸HCOOH:色譜純.1.1.2 甲醇CH3OH:色譜純.1.1.3 甲酸鞍CH5NO2:色譜純.3.2 試劑配制3.

2、2.1 甲酸溶液0.1%;取甲酸3.1.1 l.OmL用水稀釋至1000mL.3.2.2 甲酸彼溶液(2mmoL/L):稱取甲酸彼(3.1.3) 0.13g (精確至O.Olg),溶于水并稀釋至1L.3.2.3 甲醇-甲酸彼溶液(9:1):取甲醇(3.1.2) 900mL,參加1 OOmL甲酸彼溶液(3.2.2),混勻.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)番瀉昔A、番瀉昔B和大黃素甲日迷的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對分 子量見附錄A表A.1.番瀉昔B和番瀉昔A的純度均95.0%,大黃素甲陋純度99.0%o 3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 3.4.1番瀉昔A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液(4Op0mL):準(zhǔn)確稱取番瀉昔 A (3

3、.3) 10.0mg(精確至0.000lg),置250mLS瓶中, 參加甲醇甲酸鞍溶液1) (3.2.3) 200mL,超聲(409)使溶解,冷卻至室 溫,用甲醇-甲酸彼溶液定容至刻度,搖勻,制成濃度為40pg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液,-20.C保存,保 存期3個(gè)月.3.4.2 番瀉昔B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液(40ng/mL):準(zhǔn)確稱取番瀉昔B (3.3) lO.Omg (精確至O.OOOlg),置250mL量瓶中, 參加甲醇甲酸錢溶液(9:1) (3.2.3) 200mL,使其溶解,用甲醇-甲酸鞍溶液 泄容至刻度,搖勻,制成濃度為 40Mg/niL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液,-20.C保存,保存期3個(gè)月.3.4.3 大黃素甲庭

4、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液(40諸mL):準(zhǔn)確稱取大黃素甲碰(3.3) lO.Omg (精確至0.000lg),置250mL量 瓶中,參加甲醇(3.1.2) 200mL,超聲(40*0使溶解,冷卻至室溫,用甲醇定容 至刻度,搖勻,制成濃度為 40 唧mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液,-20 ° C保存,存期3個(gè)月.3.4.4 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(lOpginL):分別準(zhǔn)確吸取番瀉昔 A、番瀉昔B和大黃素甲琵標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏 液(40加mL) 各2.5n】L,用甲醇-甲酸彼溶液v 9:1) (3.2.3)稀釋至10mL,搖勻,制成1 OpgiiiL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,-20.C 保存,保存期1個(gè)月.3.4.5 混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制

5、備：分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(10pg/niL) (3.4.4)適量,用 甲醇-甲酸彼溶液(9:1) (3.2.3)稀釋,搖勻,作為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,濃度依次為各化合 物0.25pg/mL、0.5pg/mL、1 Opg/mL 2.0pg,/mL、4.0pg/mL、&Opg/rnL ,臨用新制或依儀器響應(yīng)情況配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.或根據(jù)需要采用空白基質(zhì)提取液(5.1.3),配制適當(dāng)濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.4儀器和設(shè)備4.1 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電噴霧 ESI離子源.4.2 天平：感量分別為 0.0000lg和O.OOOlg.4.3 超聲波涓洗器.4.4 渦旋

6、混勻器.4.5 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速 >3000r/min o5分析步驟5.1 試樣制備5.1.1 固態(tài)試樣或半固態(tài)試樣取適量固態(tài)試樣代用茶及片劑、膠鋌內(nèi)容物、顆粒劑等保健食品混勻,研細(xì),或取適量半固態(tài)試樣軟膠鋌內(nèi)容物混勻,準(zhǔn)確稱取 l.Og 精確至0.001 g ,置lOOmLfi :瓶中,加 入甲醇-甲酸鞍溶 液9:1 3.2.3 80mL,渦旋混勻1 min,超聲40*0提取60min,冷卻至 室溫,用甲醇甲酸錢溶液9:1 定容至刻度,搖勻,以3000r/min離心5min,取適量上清液 過0.22 pm有機(jī)濾膜,取續(xù)濾液,待測.5.1.2 液態(tài)試樣取適量試樣飲料、口服液混勻,準(zhǔn)確量取l.

7、OmL,置100mL量瓶中,參加甲醇-甲酸 鞍溶液9:1 3.2.3 80mL,渦旋混勻lmin,超聲40*0提取60min,冷卻至室溫,定容至刻度,搖勻,以3OOOr/min 離心5min,取適量上清液過0.22pm有機(jī)濾膜,取續(xù)濾液,待測.5.1.3 空白基質(zhì)提取液稱取空白試樣適星,與試樣同法處理,制得空白基質(zhì)提取液.5.1.4 空白溶液不加試樣,與試樣同法處理,制得空白溶液.5.2 儀器參考條件5.2.1色譜參考條件a色譜柱：Cis 2.1x50mm, 1.8pm,或性能相當(dāng)者.b流動(dòng)相:A相為甲醇3.1.2, B相為0.1%甲酸溶液3.2.1 ,梯度洗脫程序見表1c流速：0.2mL/m

8、in .d柱溫：40.C?e進(jìn)樣量:2叫表1梯度洗脫程序表梯度時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%025751025751560401890102590102625752825755.2.2質(zhì)譜條件a離子源：電噴霧離子源 ESI源.b掃描方式：負(fù)離子掃描 ESI-.c檢測方式：多反響離子監(jiān)測MRM od枯燥氣、霧化氣、加熱氣等均為高純氮?dú)?使用前應(yīng)調(diào)肖相應(yīng)參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度到達(dá)檢測要求,枯燥氣流速、加熱氣流速、霧化氣流速、接口溫度、脫溶劑管溫度、加熱器溫度、碰撞能量等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最正確靈敏度,監(jiān)測離子對和壓量離子對等信息詳見附錄Bo5.3 定性測定根據(jù)超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件測左試樣

9、和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,記錄試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的色譜保存時(shí)間,當(dāng)試樣中檢出與某標(biāo)準(zhǔn)品色譜U金保存時(shí)間一致的色譜峰變 化范用在± 2.5%之內(nèi),弁且試樣色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對豐度比k的偏差不超過表2規(guī)定的范弗I,可以確龍?jiān)嚇又袡z出相應(yīng)化合物.表2定性確定時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度k>50%50 沁 >20%20 沁 >10%k<10%允許的最大偏差202530505.4 定量測定5.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液3.4.5分別按儀器參考條件5.2進(jìn)行測泄,得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜蚯而積.以混合標(biāo)準(zhǔn)

10、工作溶液的濃度為橫坐標(biāo),以定量離子的色譜峰的峰而積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.5.4.2 試樣溶液的測定將試樣溶液5.1.1-5.1.2 按儀器參考條件5.2進(jìn)行測左,得到樣品溶液中對應(yīng)組分的色譜峰而積.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中組分的濃度,平行測左次數(shù)不少于兩次.對照品色譜圖參見附錄 Co5.4.3 空白溶液的測定空白溶液5.1.4同試樣溶液測泄步驟操作.6結(jié)果計(jì)算將高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測得濃度代入下式計(jì)算含量：CXrX1Q0.x八m x 1000式中：X一試樣中各待測物的含量,單位為亳克每千克 mg/kg或mg/L :C一從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出的各待測物的濃度,單位為微克每亳升pg/mL ;V-樣

11、液最終泄容體積,單位為亳升 mL:m 一試樣的質(zhì)量或體積,單位為克(g或mL)；K一稀釋倍數(shù).計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保存三位有效 字.7精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果白絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%.8其他當(dāng)稱樣量為lg (精確至0.00lg )或ImL,定容體積為100mL時(shí),番瀉昔A的檢出限為怎量限為空白試驗(yàn)應(yīng)0.050nig/kg(mg/L),定量限為 0.200mg/kg(mg/L).番瀉昔 B 的檢出限為 0.050mg/kg(mg/L),0.15mg/kg(mg/L)o大黃素甲日迷的檢出限為0.089mg/kg(mg/L)

12、,宦呈:限 0.356mg/kg(mg/L)o無干擾.附錄A化合物相關(guān)信息表A.1番瀉昔A、番瀉昔B、大黃素甲醴標(biāo)準(zhǔn)樣品的中、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對分子量中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對分子量番瀉昔ASennoside A81-27-6C42H38O20862.75番瀉昔BSennoside B128-57-4CAzII.AOzo862.75大黃素甲醺Physcion521-61-9CJ6H12O5284.27附錄B質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件a離子源：電噴霧離子源ESI:b檢測方式：多反響監(jiān)測 MRM :c掃描方式：負(fù)離子掃描ESI ;d霧化氣流速：3.0L/min :e加熱

13、氣流速：lO.OL/min :f 枯燥氣流速：10.0L/min :g噴霧電壓：4.5kV;h接口 溫度:3OO*C :i脫溶劑管溫度：250 ° C;j加熱器溫度：400 ° C;k苴他質(zhì)譜參數(shù)見表表B化合物定性、定呈離子和質(zhì)譜分析參數(shù)序號(hào)化合物需稱電離方式母離子(m/z )子離子(m/z )碰撞能單V保存時(shí)間min 1番 7BESI-861.4386.2*4214.74699.229386.2*422番瀉甘AESI-861.415.87699.229240.1 *253大黃素甲日迷ESI-283321.09183.253?定屋離子附錄c7示準(zhǔn)色譜圖|: 15)40000

14、0 :300000 ;200000 ;10000O5.010.015.020.025.0min圖C番瀉昔B、番瀉昔A、大黃素甲酬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流色譜圖(1?番瀉昔伯2番瀉昔A; 3大黃素甲膜 以下同)1 : 861.4b>386.20300000-200000-(-)CE: 42.01 2JU5.0 10.015.020.025.0min圖C.2番瀉昔B、番瀉昔A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取定呈離子色譜圖100000-1QOOOO0750065000G25000 ：861,45>699.20(-) CL: 29.0I' I5.010.015020.025.0min圖C.3番瀉昔B、番瀉昔A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取定性離子色譜圖150000-10000050000min5.010.015.020.025.0圖C4大黃素甲日迷標(biāo)準(zhǔn)物