淺析細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法及常見問題

1、精選精選ppt淺析細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法及常見淺析細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法及常見問題問題 精選精選ppt內(nèi)內(nèi) 容容v細(xì)菌內(nèi)毒素簡(jiǎn)介細(xì)菌內(nèi)毒素簡(jiǎn)介v細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法v常見問題及解決方案常見問題及解決方案精選精選ppt一、細(xì)一、細(xì) 菌菌 內(nèi)內(nèi) 毒毒 素素 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 介介v主要內(nèi)容主要內(nèi)容 來源來源 特性特性 與熱源的關(guān)系與熱源的關(guān)系 在藥檢中應(yīng)用在藥檢中應(yīng)用精選精選pptv主要來源主要來源 主要來自于革蘭氏陰性桿菌，當(dāng)細(xì)菌死亡或自主要來自于革蘭氏陰性桿菌，當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會(huì)釋放出內(nèi)毒素，其化學(xué)成分主要是脂多糖，溶后便會(huì)釋放出內(nèi)毒素，其化學(xué)成分主要是脂多糖，這是一種大分子物質(zhì)，分子量約為這

2、是一種大分子物質(zhì)，分子量約為106，其粒徑約，其粒徑約在在1 5納米納米 。 細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中含內(nèi)毒素的量為含內(nèi)毒素的量為1至至100EU/ml。精選精選pptv主要特性主要特性（實(shí)驗(yàn)器材處理方法）（實(shí)驗(yàn)器材處理方法）1.1.耐熱性耐熱性 一般在一般在100加熱加熱1小時(shí)無(wú)影響，小時(shí)無(wú)影響，120加熱加熱4小時(shí)能破壞小時(shí)能破壞98，180200干熱干熱2小時(shí)或小時(shí)或250干熱半小時(shí)干熱半小時(shí)才能完全破壞。才能完全破壞。 故故：注射劑的一般滅菌條件是不能破壞內(nèi)毒素的。注射劑的一般滅菌條件是不能破壞內(nèi)毒素的。2.2.不耐酸堿性不耐酸堿

3、性 內(nèi)毒素可被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和氧化劑破壞。內(nèi)毒素可被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和氧化劑破壞。 故：玻璃器皿用鉻酸洗液浸泡故：玻璃器皿用鉻酸洗液浸泡精選精選pptv主要特性主要特性（實(shí)驗(yàn)器材處理方法）（實(shí)驗(yàn)器材處理方法）3.3.水溶性與不揮發(fā)性水溶性與不揮發(fā)性 熱原能溶于水，本身不具揮發(fā)性，但能隨水蒸熱原能溶于水，本身不具揮發(fā)性，但能隨水蒸氣霧滴夾帶入蒸餾水中，造成污染。氣霧滴夾帶入蒸餾水中，造成污染。 故：不可用濕熱滅菌法處理實(shí)驗(yàn)器具故：不可用濕熱滅菌法處理實(shí)驗(yàn)器具精選精選pptv主要特性主要特性（去除內(nèi)毒素方法）（去除內(nèi)毒素方法）4.4.濾過性濾過性 原體積很小，約在原體積很小，約在1 15 nm5 nm之間，

4、故能通過除之間，故能通過除菌濾器而進(jìn)入濾液中，但不能通過石棉濾板，也不菌濾器而進(jìn)入濾液中，但不能通過石棉濾板，也不能通過半透膜。能通過半透膜。5.5.吸附性吸附性 能被活性炭吸附劑吸附。內(nèi)毒素在溶液中帶有能被活性炭吸附劑吸附。內(nèi)毒素在溶液中帶有一定的電荷，因而可被某些離子交換介質(zhì)吸附。一定的電荷，因而可被某些離子交換介質(zhì)吸附。精選精選pptv熱原熱原=內(nèi)毒素內(nèi)毒素 ？ 熱原指熱原指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì)，等使人體發(fā)熱的物質(zhì)，不僅僅是細(xì)菌內(nèi)毒素。不僅僅是細(xì)菌內(nèi)毒素。 但在藥檢的范疇，細(xì)菌內(nèi)毒素是主要的熱但在藥檢的范疇，細(xì)菌內(nèi)毒素是主要的熱原

5、物質(zhì)，可以說無(wú)內(nèi)毒素就無(wú)熱原，控制內(nèi)毒原物質(zhì)，可以說無(wú)內(nèi)毒素就無(wú)熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原素就是控制熱原。精選精選pptv熱原檢查方法簡(jiǎn)介熱原檢查方法簡(jiǎn)介 中國(guó)藥典中國(guó)藥典熱原檢查方法是采用家兔升溫法進(jìn)熱原檢查方法是采用家兔升溫法進(jìn)行檢查。行檢查。 將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。精選精選ppt熱原檢查法精選精選pptv與熱源對(duì)比內(nèi)毒素檢查法優(yōu)勢(shì)與熱源對(duì)比內(nèi)毒素檢查法優(yōu)勢(shì)v方便、快捷、經(jīng)濟(jì)；

6、方便、快捷、經(jīng)濟(jì)；v重現(xiàn)性好、靈敏度高；重現(xiàn)性好、靈敏度高；v避免抗原的產(chǎn)生，克服生物測(cè)定的誤差；避免抗原的產(chǎn)生，克服生物測(cè)定的誤差； 近年來已經(jīng)普遍采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，逐漸替代了熱源近年來已經(jīng)普遍采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，逐漸替代了熱源法法精選精選pptv在藥檢中的應(yīng)用在藥檢中的應(yīng)用 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查作為控制藥品質(zhì)量的一種方法，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查作為控制藥品質(zhì)量的一種方法，已經(jīng)廣泛的被世界各國(guó)藥典收載。已經(jīng)廣泛的被世界各國(guó)藥典收載。v成品檢查成品檢查藥品安全性檢查之一藥品安全性檢查之一 v半成品（生產(chǎn)過程）檢查半成品（生產(chǎn)過程）檢查事前質(zhì)控手段，避事前質(zhì)控手段，避免造成藥品成批報(bào)廢免造成藥品成批報(bào)廢

7、精選精選ppt二、二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法v中國(guó)藥典中國(guó)藥典批準(zhǔn)使用方法批準(zhǔn)使用方法：v供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。但當(dāng)測(cè)供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。但當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。v本節(jié)將著重介紹凝膠法的操作與有關(guān)原理。本節(jié)將著重介紹凝膠法的操作與有關(guān)原理。測(cè)定 方法凝膠法凝膠法 光度測(cè)定法光度測(cè)定法 濁度法濁度法 顯色基質(zhì)法顯色基質(zhì)法 精選精選ppt鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理內(nèi)毒素內(nèi)毒素C因子因子活化的活化的C因子因子凝膠凝膠B因子因子 凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶活化的活

8、化的B因子因子凝固蛋白原凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應(yīng)鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應(yīng)精選精選ppt名詞解釋名詞解釋1鱟及鱟試劑鱟及鱟試劑鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動(dòng)物鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動(dòng)物 門，在我國(guó)主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一門，在我國(guó)主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒

9、素濃度有關(guān)，是體的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測(cè)內(nèi)毒素的敏感試劑。外檢測(cè)內(nèi)毒素的敏感試劑。精選精選ppt精選精選ppt名詞解釋名詞解釋2國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品及工作標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品及工作標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品： （單位：（單位：EU/mlEU/ml） 自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)；效價(jià)；工作標(biāo)準(zhǔn)品：工作標(biāo)準(zhǔn)品： 經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度符經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度符復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽(yáng)性對(duì)照；復(fù)核、干擾試驗(yàn)及

10、各種陽(yáng)性對(duì)照；精選精選ppt名詞解釋名詞解釋3細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水凝膠法：凝膠法： 內(nèi)毒素含量小于內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml的滅菌注射用水；的滅菌注射用水； 故：滅菌注射用水故：滅菌注射用水細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 光度法：光度法： 內(nèi)毒素含量應(yīng)小于內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.005EU/ml0.005EU/ml；精選精選ppt細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)之凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)之凝膠法v實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序1、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計(jì)算樣品稀釋度、選擇鱟試劑靈敏度，計(jì)算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復(fù)核、鱟試劑靈敏

11、度復(fù)核4、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法）、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法）5、供試品細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè)、供試品細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè)精選精選pptv實(shí)驗(yàn)材料及用具實(shí)驗(yàn)材料及用具1、儀器、儀器名稱名稱要求要求天平天平感量感量0.1mg0.1mg以下以下電熱干燥箱電熱干燥箱300300恒溫水浴箱恒溫水浴箱37371 1 水銀或酒精溫度計(jì)水銀或酒精溫度計(jì)100 100 1 1 漩渦混合器漩渦混合器/ /計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)器60min60min1min1min2、器具、器具器具分類器具分類器具名稱器具名稱反應(yīng)試管反應(yīng)試管玻璃試管（外徑玻璃試管（外徑1075mm）、試管架、）、試管架、小三角瓶或磨口瓶小三角瓶或磨

12、口瓶移液器具移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無(wú)熱原吸頭刻度吸管及洗耳球或移液器及無(wú)熱原吸頭其他其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號(hào)筆封口膜、記號(hào)筆精選精選pptv試劑試劑1 1、鱟試劑：具有國(guó)家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號(hào)、鱟試劑：具有國(guó)家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號(hào)2 2、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品3 3、內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素檢查用水4 4、7575乙醇乙醇v常用英文縮寫常用英文縮寫B(tài)ETBET：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 BETBET水水：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 MVDMVD：供試品最大有效稀釋倍數(shù)：供試品最大有效稀釋倍數(shù) NCNC：

13、陰性對(duì)照：陰性對(duì)照MVCMVC：供試品最低有效濃度：供試品最低有效濃度 PCPC：陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：鱟試劑靈敏度：鱟試劑靈敏度 L L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值精選精選pptv靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：每批鱟試劑用于檢測(cè)前都必須進(jìn)行靈敏度靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：每批鱟試劑用于檢測(cè)前都必須進(jìn)行靈敏度復(fù)核。復(fù)核。目的目的是為了對(duì)試劑、檢測(cè)者的操作、環(huán)境條件、水平是為了對(duì)試劑、檢測(cè)者的操作、環(huán)境條件、水平條件進(jìn)行驗(yàn)證。以證實(shí)操作正常無(wú)誤，準(zhǔn)確可靠和結(jié)果可信。條件進(jìn)行驗(yàn)證。以證實(shí)操作正常無(wú)誤，準(zhǔn)確可靠和結(jié)果可信。 試驗(yàn)舉例：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為試驗(yàn)舉例：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為90EU/支；支； 待測(cè)鱟試劑

14、靈敏度待測(cè)鱟試劑靈敏度0.25EU/ml0.25EU/ml。1 1、制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁使粉、制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用7575酒精擦拭后啟開，酒精擦拭后啟開，加加1mlBET1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min15min后進(jìn)行稀釋，步驟如下后進(jìn)行稀釋，步驟如下( (箭頭下方為加入箭頭下方為加入BETBET水量水量) )：90EU/ml90EU/ml10EU/ml10EU/ml1EU/ml1EU/ml0.5EU/ml

15、0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.0625EU/ml0.2ml0.2ml1.6ml1.6ml0.2ml0.2ml1.8ml1.8ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml精選精選ppt0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml水水水水溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品水水水水水水水水9090EU/mlEU/ml1010EU/mlEU/ml1 1EU/mlEU/ml0.50.5EU/mlEU/ml0.250.25EU

16、/mlEU/ml0.1250.125EU/mlEU/ml0.06250.0625EU/mlEU/ml（2 ）（ ）（0.5 ） （0.25 ）精選精選ppt2 2、溶解鱟試劑：若鱟試劑為、溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml0.1ml裝量，則取裝量，則取1818支，每支加入支，每支加入0.1mlBET0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml0.1ml，則取若干支，則取若干支，按標(biāo)示量加入按標(biāo)示量加入 BETBET水溶解，再取水溶解，再取0.1ml0.1ml分裝于標(biāo)準(zhǔn)玻璃試管分裝于標(biāo)準(zhǔn)玻璃試管（10mm10mm75mm75mm），將試管按如下形狀排列。），將試管按如

17、下形狀排列。3 3、加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各、加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1ml0.1ml，第五列加入第五列加入BETBET水水0.1ml0.1ml。1 1222 23 30.50.54 40.250.25BETBET水水22220.50.50.50.50.250.250.250.25精選精選pptv反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動(dòng)反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動(dòng)混勻，置混勻，置37 水浴中保溫水浴中保溫60602min2min，將每管拿出緩，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)緩倒轉(zhuǎn)180180，凝膠不變形為，凝膠不變形為“”，凝膠不能保

18、持，凝膠不能保持完整為完整為“”。 當(dāng)當(dāng)2.02.0四支管都為陽(yáng)性，四支管都為陽(yáng)性，0.25四支管都為陰性時(shí)，四支管都為陰性時(shí)，試驗(yàn)成立，按下面底公式計(jì)算復(fù)核的靈敏度試驗(yàn)成立，按下面底公式計(jì)算復(fù)核的靈敏度c c ： c clglg-1-1(X/4)(X/4)（X:X:反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。）反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。） 當(dāng)當(dāng)0. 5c c 2.02.0時(shí)，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測(cè)時(shí)，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測(cè)時(shí)仍以標(biāo)示靈敏度時(shí)仍以標(biāo)示靈敏度為準(zhǔn)。為準(zhǔn)。精選精選ppt左側(cè)管旋轉(zhuǎn)左側(cè)管旋轉(zhuǎn)180凝膠不能保持完整為陰性，記為凝膠不能保持完整為陰性，記為“”；右側(cè)管旋轉(zhuǎn)；右側(cè)管旋轉(zhuǎn)180180凝膠不變形

19、為陽(yáng)性，記為凝膠不變形為陽(yáng)性，記為“”。精選精選ppt舉例：舉例：設(shè)待復(fù)核的鱟試劑標(biāo)示靈敏度設(shè)待復(fù)核的鱟試劑標(biāo)示靈敏度為為0.125EU/ml0.125EU/ml:平行平行管數(shù)管數(shù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（EU/mlEU/ml）NCNC反應(yīng)終反應(yīng)終點(diǎn)濃度點(diǎn)濃度C CX X(lgC)(lgC)0.250.250.1250.1250.060.060.030.031+-0.06-1.22-1.222+-0.125-0.903-0.9033+-/0.125-0.903-0.9034+-/0.125-0.903-0.903clg-1(X/4) lg-1（-1.22）（）（-0.903）（）

20、（ -1.22 ）（）（ -1.22 ）/4 0.104（EU/ml） cc在在0. 50. 52.02.0范圍內(nèi)，符合規(guī)定。范圍內(nèi)，符合規(guī)定。精選精選pptv方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn)供試品干擾預(yù)試驗(yàn)?zāi)康模耗康模?確證產(chǎn)品對(duì)方法是否存在干擾（抑制或增強(qiáng)），確證產(chǎn)品對(duì)方法是否存在干擾（抑制或增強(qiáng)），得到供試品的最大不干擾濃度或最小不干擾稀釋倍得到供試品的最大不干擾濃度或最小不干擾稀釋倍數(shù)，為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。數(shù)，為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。影響因素：影響因素： 新藥檢查方法建立；新藥檢查方法建立； 鱟試劑批號(hào)或來源的改變；鱟試劑批號(hào)或來源的改變； 檢品生產(chǎn)工藝，配方，成分的改變；檢品

21、生產(chǎn)工藝，配方，成分的改變； 檢品關(guān)鍵成分來源的改變；檢品關(guān)鍵成分來源的改變；精選精選ppt 方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn)供試品干擾預(yù)試驗(yàn)v供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計(jì)算 MVDCL/ L:供試品的內(nèi)毒素限值； C：供試品溶液的濃度； 當(dāng)L以 EU/ml表示時(shí)，C為1ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時(shí)，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C的值不是樣品的濃度，就是1)。精選精選ppt 方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn)供試品干擾預(yù)試驗(yàn)v內(nèi)毒素限值內(nèi)毒素限值(L)的確定的確定 藥典附錄有相應(yīng)計(jì)算公式，即當(dāng)今世界各國(guó)普遍采藥典附錄有相應(yīng)計(jì)算公式，即當(dāng)今

22、世界各國(guó)普遍采用的細(xì)菌內(nèi)毒素計(jì)算公式，即：用的細(xì)菌內(nèi)毒素計(jì)算公式，即：L=K/M，式中，式中K為為按規(guī)定給藥途徑，人每公斤體重每小時(shí)可以接受的按規(guī)定給藥途徑，人每公斤體重每小時(shí)可以接受的不產(chǎn)生任何不良反應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量（亦稱致熱不產(chǎn)生任何不良反應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量（亦稱致熱閾），它基本上是一固定值，藥典上對(duì)每一給藥途閾），它基本上是一固定值，藥典上對(duì)每一給藥途徑的徑的K值都有具體的規(guī)定。值都有具體的規(guī)定。M為按規(guī)定的給藥途徑，為按規(guī)定的給藥途徑，人每公斤體重每小時(shí)給藥的最大劑量。這一個(gè)值的人每公斤體重每小時(shí)給藥的最大劑量。這一個(gè)值的確定實(shí)際上才是計(jì)算限值的關(guān)鍵。確定實(shí)際上才是計(jì)算限值的關(guān)鍵。精

23、選精選ppt方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn)供試品干擾預(yù)試驗(yàn)（1）原則上一般根據(jù)藥品使用說明書或國(guó)家藥典委）原則上一般根據(jù)藥品使用說明書或國(guó)家藥典委員會(huì)編制的員會(huì)編制的臨床用藥須知臨床用藥須知來確定最大劑量。來確定最大劑量。 如如兒童用藥劑量大于成人用藥劑量，則以兒童劑量為兒童用藥劑量大于成人用藥劑量，則以兒童劑量為準(zhǔn)。準(zhǔn)。（2）為保證安全用藥，對(duì)于抗感染、抗腫瘤、治療）為保證安全用藥，對(duì)于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品、需聯(lián)合用藥的藥品藥心血管疾病等重癥用的藥品、需聯(lián)合用藥的藥品藥品，可根據(jù)計(jì)算值適當(dāng)調(diào)整，嚴(yán)格至計(jì)算限值的品，可根據(jù)計(jì)算值適當(dāng)調(diào)整，嚴(yán)格至計(jì)算限值的1/2或或

24、1/3。精選精選pptv方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾試驗(yàn)供試品干擾試驗(yàn) 目的：目的：驗(yàn)證預(yù)干擾中確定的濃度或倍數(shù)下的供驗(yàn)證預(yù)干擾中確定的濃度或倍數(shù)下的供 試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。 試驗(yàn)方法：試驗(yàn)方法：須選擇兩家以上的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)須選擇兩家以上的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn) 編號(hào)編號(hào)內(nèi)毒素濃度內(nèi)毒素濃度/ /配制配制內(nèi)毒素的溶內(nèi)毒素的溶液液稀釋稀釋用液用液稀釋稀釋倍數(shù)倍數(shù)所含內(nèi)毒所含內(nèi)毒素的濃度素的濃度平行平行管數(shù)管數(shù)A A無(wú)無(wú)/ /供試品溶液供試品溶液2 2B B2/2/供試品溶液供試品溶液供試品溶液供試品溶液1 12 24 48 822110

25、.50.50.250.254 44 44 44 4C C2/2/檢查用水檢查用水檢查用水檢查用水1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D無(wú)無(wú)/ /檢查用水檢查用水2 2精選精選pptv方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾試驗(yàn)供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果判定：結(jié)果判定： 如果有供試品和無(wú)供試品測(cè)得的鱟試劑靈敏度（如果有供試品和無(wú)供試品測(cè)得的鱟試劑靈敏度（c）均在均在0.5-2.0范圍內(nèi)時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下不干范圍內(nèi)時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾試驗(yàn)，否則需要對(duì)供試品做適當(dāng)處理。擾試驗(yàn)，否則需要對(duì)供試品做適當(dāng)處理。 干擾的排除：干擾的排除： 對(duì)供試品進(jìn)行更

26、大倍數(shù)的稀釋；對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋； 選擇靈敏度更高的鱟試劑；選擇靈敏度更高的鱟試劑； 其他適宜的方法其他適宜的方法 如過濾、中和、透析或加熱處理等排除干擾。如過濾、中和、透析或加熱處理等排除干擾。 精選精選pptv供試品細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè)供試品細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè) 檢測(cè)方法：檢測(cè)方法： 結(jié)果結(jié)果 判定判定 陰性陰性 陽(yáng)性陽(yáng)性 陽(yáng)性陽(yáng)性 陰性陰性編號(hào)編號(hào)內(nèi)毒素濃度內(nèi)毒素濃度/ /配制內(nèi)毒素的配制內(nèi)毒素的溶液溶液平行管數(shù)平行管數(shù) A A無(wú)無(wú)/ /供試品溶液供試品溶液2 2 B B2/2/供試品溶液供試品溶液2 2 C C2/2/檢查用水檢查用水2 2 D D無(wú)無(wú)/ /檢查用水檢查用水2

27、2 注：注：A 無(wú)干擾濃度供試品溶液；無(wú)干擾濃度供試品溶液；B 供試品陽(yáng)性對(duì)照；供試品陽(yáng)性對(duì)照；C 陽(yáng)性對(duì)照；陽(yáng)性對(duì)照；D 陰性對(duì)照。陰性對(duì)照。精選精選ppt三、常見問題及解決方案三、常見問題及解決方案1、實(shí)驗(yàn)前未復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏度、實(shí)驗(yàn)前未復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏度 鱟試劑靈敏度的改變或質(zhì)量不符合要求，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)鱟試劑靈敏度的改變或質(zhì)量不符合要求，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏2、實(shí)驗(yàn)器具的潔凈度不符合要求、實(shí)驗(yàn)器具的潔凈度不符合要求 一般用硫酸清潔液浸泡，用自來水沖洗干凈，再用新一般用硫酸清潔液浸泡，用自來水沖洗干凈，再用新鮮蒸餾水沖

28、洗三道，并干熱（鮮蒸餾水沖洗三道，并干熱（250）恒溫）恒溫1h即可。即可。實(shí)驗(yàn)用的玻璃器具必須嚴(yán)格無(wú)菌無(wú)熱原，建議不要使實(shí)驗(yàn)用的玻璃器具必須嚴(yán)格無(wú)菌無(wú)熱原，建議不要使用一次性塑料制品。用一次性塑料制品。精選精選ppt3、實(shí)驗(yàn)條件達(dá)不到要求、實(shí)驗(yàn)條件達(dá)不到要求 實(shí)驗(yàn)室要求潔凈，無(wú)塵?？諝饬魍?，若是空調(diào)室，實(shí)驗(yàn)室要求潔凈，無(wú)塵?？諝饬魍?，若是空調(diào)室，應(yīng)備有一臺(tái)超凈工作臺(tái)。應(yīng)備有一臺(tái)超凈工作臺(tái)。 4、溫度不符合要求、溫度不符合要求 實(shí)驗(yàn)室溫度為實(shí)驗(yàn)室溫度為252較好，恒溫水浴箱溫度為較好，恒溫水浴箱溫度為371為宜為宜。5、忽視樣品本身干擾、忽視樣品本身干擾 精選精選ppt 供試品若經(jīng)干擾試驗(yàn)證實(shí)

29、存在干擾因素，可采供試品若經(jīng)干擾試驗(yàn)證實(shí)存在干擾因素，可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個(gè)重要原用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個(gè)重要原則是則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。 (1).(1).供試品稀釋法供試品稀釋法 MVD=CL / MVD=CL / 鱟試劑靈敏度鱟試劑靈敏度()()越高越高( (數(shù)值越小數(shù)值越小) )，供試品的稀，供試品的稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)越大，干擾越小。越大，干擾越小。精選精選ppt (2). (2).物理方法物理方法 如加熱法如加熱法( (血液制品血液制品) )、冷析法、冷析法( (甘露醇甘露醇 ) ) (3). (3).化學(xué)方法化學(xué)方法 如調(diào)節(jié)如調(diào)節(jié)PHPH值值( (奎諾酮類奎諾酮類) )、調(diào)節(jié)金屬離子、調(diào)節(jié)金屬離子( (血液保血液保養(yǎng)液、養(yǎng)液、FDP)FDP) (4). (4).生物方法生物方法 如抗增液的使用，阻斷如抗增液的使用，阻斷G G因子反應(yīng)，防止假陽(yáng)性；因子反應(yīng)，防止假陽(yáng)性； (5).(5).其它方法其它方法 如過濾法、溶劑抽提等如過濾法、溶劑抽提等 精選精選ppt