臨床免疫學(xué)重點(diǎn)整理

1、抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？乖贵w間的結(jié)合力涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強(qiáng)，它是在水溶液中兩個(gè)疏水基團(tuán)相互接觸，由于對(duì)水分子的排斥而趨向聚集的力。 親和性（affinity）：是指抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與一個(gè)相應(yīng)抗原表位（AD）之間的結(jié)合強(qiáng)度，取決于兩者空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)程度。親合力（avidity）：是指一個(gè)完整抗體分子的抗原結(jié)合部位與若干相應(yīng)抗原表位之間的結(jié)合強(qiáng)度，它與親和性、抗體的結(jié)合價(jià)、抗原的有效AD數(shù)目有關(guān)。 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：特異性、可逆性、比例性、階段性。帶現(xiàn)象（zone phenomeno

2、n）：一種抗原-抗體反應(yīng)的現(xiàn)象。在凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)中，由于抗體過?；蚩乖^剩，抗原與抗體結(jié)合但不能形成大的復(fù)合物，從而不出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)現(xiàn)象?？贵w過量稱為前帶，抗原過量稱為后帶。 免疫原（immunogen）：是指能誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的抗原。免疫佐劑（immuno adjustvant）：簡(jiǎn)稱佐劑，是指某些預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。 半抗原（hapten）：又稱不完全抗原，是指僅具有與抗體結(jié)合的能力(抗原性)，而單獨(dú)不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生（無免疫原性）的物質(zhì)。當(dāng)半抗原與蛋白質(zhì)載體結(jié)合后即可成為完全

3、抗原。載體（carrier）：結(jié)合后能給予半抗原以免疫原性的物質(zhì)。載體效應(yīng)：初次免疫與再次免疫時(shí)，只有使半抗原結(jié)合在同一載體上，才能使機(jī)體產(chǎn)生對(duì)半抗原的免疫應(yīng)答，該現(xiàn)象稱為。 單克隆抗體（McAB）：將單個(gè)B細(xì)胞分離出來，加以增殖形成一個(gè)克隆群落，該B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一表位、結(jié)構(gòu)相同、功能均一的抗體，即。多克隆抗體（PcAb）：天然抗原分子中常含多種不同抗原特異性的抗原表位，以該抗原物質(zhì)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活，產(chǎn)生含有針對(duì)不同抗原表位的免疫球蛋白，即基因工程抗體（GEAb）：是利用DNA重組及蛋白工程技術(shù)，從基因水平對(duì)編碼抗體的基因進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)?/p>

4、受體細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。 雜交瘤技術(shù)【原理】以聚乙二醇（PEG）為細(xì)胞融合劑，使免疫后能產(chǎn)生抗體的小鼠脾細(xì)胞與能在體外長(zhǎng)期繁殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，通過次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷 （HAT）選擇性培養(yǎng)基的作用，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化），最終獲得機(jī)能產(chǎn)生所需單克隆抗體又能長(zhǎng)期體外繁殖的雜交瘤細(xì)胞系。將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，可從小鼠腹水中得到高效價(jià)的單克隆抗體。（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞理想骨髓瘤細(xì)胞的條件：細(xì)胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株本身不產(chǎn)生免疫球蛋白或細(xì)胞因子；該細(xì)胞是HGPRT或TK的缺陷株；能與

5、B細(xì)胞融合成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞；融合率高。目前最常用的是NS-1和SP2/O細(xì)胞株（二）免疫脾細(xì)胞多采用與骨髓瘤細(xì)胞同源的純系BALB/c小鼠；免疫途徑多為腹腔內(nèi)或皮內(nèi)多點(diǎn)注射法。若抗原微量，可用脾臟內(nèi)直接注射法進(jìn)行免疫。細(xì)胞性抗原不需加佐劑，可溶性抗原需加完全弗氏佐劑。（三）細(xì)胞融合是產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作細(xì)胞融合劑，濃度3050 %之間，基本方法是將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:2 1:10比例混合，加入PEG，誘導(dǎo)兩種細(xì)胞融合，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，再加入培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG融合液，直至失去融合作用，融合細(xì)胞形成具有兩個(gè)或多個(gè)核的異核

6、體，最終產(chǎn)生雜交細(xì)胞。（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞合成DNA有兩條途徑：一條為生物合成途徑，可被葉酸拮抗物（氨基蝶呤）阻斷；另一條為替代途徑，葉酸代謝受阻時(shí)，細(xì)胞通過HGPRT和TK，利用核苷酸前體物合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。HAT培養(yǎng)液含三種成分：次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后，只有具備兩親本 細(xì)胞雙重特性的雜交瘤細(xì)胞能長(zhǎng)期生存并產(chǎn)生抗體，成為制造單克隆抗體的細(xì)胞源。細(xì)胞類型正常培養(yǎng)細(xì)胞TK缺陷細(xì)胞HGPRT缺陷細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞正常培養(yǎng)基 + + + +HAT培養(yǎng)基 + - 

7、;- +  凝集反應(yīng)（agglutination reaction）：是指細(xì)菌和紅細(xì)胞或紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）的顆粒性載體與相應(yīng)抗體（或抗原）特異性結(jié)合后，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。直接：在適當(dāng)電解質(zhì)參與下，細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原直接與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為。間接：可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體（如正常人O型紅細(xì)胞、細(xì)菌、膠乳顆粒等）的表面，然后與相應(yīng)抗體（抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為。其敏感度高于直接凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)。 正向間接

8、凝集反應(yīng)：用可溶性抗原致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的待檢抗體。反向間接凝集反應(yīng)：用特異性抗體致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的待檢抗原。間接凝集抑制反應(yīng)：用抗原致敏的載體顆粒及相應(yīng)的抗體作為診斷試劑，檢測(cè)標(biāo)本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。 間接血凝試驗(yàn)：是以紅細(xì)胞為載體的間接凝集試驗(yàn)，即用已知的抗原（或抗體）致敏紅細(xì)胞，與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體（或抗原）特異結(jié)合，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。膠乳凝集抑制試驗(yàn)（LAT）：將抗原（或抗體）致敏膠乳顆粒，直接與待檢標(biāo)本中的抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應(yīng)。（常用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳） 直接coombs試驗(yàn)：將抗人球蛋白試劑直接加到表面結(jié)合抗體的受檢紅細(xì)胞中，即可見

9、細(xì)胞凝集。用于檢測(cè)吸附于紅細(xì)胞表面的不完全抗體。（如HDN、AIHA）間接coombs試驗(yàn)：將受檢血清和具有相應(yīng)抗原性的紅細(xì)胞相結(jié)合，再加入抗人球蛋白抗體即可出現(xiàn)可見的紅細(xì)胞凝集。用于檢測(cè)血清中游離的不完全抗體。 沉淀反應(yīng)（precipitation reaction）：是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)可見的沉淀現(xiàn)象。 免疫濁度測(cè)定：是應(yīng)用抗原抗體結(jié)合在液體中形成的免疫復(fù)合物干擾光線可用儀器檢測(cè)的特點(diǎn)，將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器與自動(dòng)分析檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對(duì)各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定的技術(shù)。鉤狀效應(yīng)（h

10、igh dose hook effect）：免疫濁度測(cè)定，抗原過量導(dǎo)致形成的免疫復(fù)合物（IC）分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少。 單向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)：是先將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測(cè)的抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。環(huán)的直徑或面積的大小與抗原含量正相關(guān)。常用于IgG/A/M、補(bǔ)體 C3/C4等血漿蛋白的測(cè)定。雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)：是將抗原核抗體加在同一瓊脂板的對(duì)應(yīng)孔中，各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在濃度比例恰當(dāng)處形成沉淀線。沉淀線靠近抗原孔，說明抗體濃度較大；靠近抗體孔則說明抗原濃度大。形成的沉淀線彎向分子量大的一方。（待測(cè)物為兩種抗原）兩條沉淀線互

11、相吻合相連，兩抗原中存在相同表位；兩條沉淀線交叉，說明兩抗原完全不同；兩條沉淀線相切，提示兩抗原之間有部分相同。 對(duì)流免疫電泳（CIEP）：實(shí)質(zhì)上是雙擴(kuò)和電泳的結(jié)合。在pH8.6的堿性緩沖液瓊脂中進(jìn)行電泳，分子量小、等電點(diǎn)低、帶有較多負(fù)電荷的Ag泳向陽極，而Ab球蛋白等電點(diǎn)偏高（約為6-7），在pH8.6時(shí)帶負(fù)電荷較少，加上分子量較大，泳動(dòng)慢，受電滲（指電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)）干擾后向陰極倒退，這樣抗原抗體作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，在較短時(shí)間內(nèi)即可相遇，在孔間兩者分子比例合適的地方形成沉淀線。（抗原加在-級(jí)，抗體加在+級(jí)）抗原濃度越高，沉淀線越接近抗體孔，甚至超過抗體孔。本法簡(jiǎn)便快速，靈

12、敏度是雙擴(kuò)的816倍，可檢出蛋白質(zhì)濃度達(dá)g/ml，常用于Ag/Ab的性質(zhì)/效價(jià)/純度測(cè)定。 火箭免疫電泳（RIE）：實(shí)質(zhì)上是單擴(kuò)和電泳的結(jié)合。是將抗體混合于瓊脂中，電泳時(shí)，抗體不移動(dòng)，抗原由負(fù)極向正極移動(dòng)，并隨抗原濃度的下降，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)也逐漸變窄，抗原抗體免疫復(fù)合物形成的沉淀西安也越來越窄，形成一個(gè)火箭狀的不溶性復(fù)合物沉淀峰?？贵w濃度一定時(shí)，沉淀峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。其靈敏度可達(dá)ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。 免疫電泳（IEP）：將待測(cè)標(biāo)本（蛋白質(zhì)抗原）置于瓊脂凝膠中電泳，樣品中各蛋白成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，被分成肉眼不可見的若干區(qū)帶。然后沿與

13、電泳方向開一平行的抗體槽并加入抗血清，置室溫或37度使兩者擴(kuò)散。18-24h后，各區(qū)帶蛋白與相應(yīng)的Ab在相應(yīng)的位置上形成弧形沉淀線。Ag越多，沉淀線越靠近Ab槽，其沉淀線越粗，可做細(xì)微的蛋白質(zhì)組分分析，僅為定性實(shí)驗(yàn)。 免疫固定電泳（IFE）：實(shí)質(zhì)是區(qū)帶電泳和沉淀反應(yīng)相結(jié)合。先將血清蛋白質(zhì)置于瓊脂凝膠中進(jìn)行區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清加于凝膠表面的泳道上，經(jīng)過孵育，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透、擴(kuò)散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，洗脫游離的抗體，形成的抗原抗體復(fù)合物則保留在凝膠中。經(jīng)氨基黑，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)被著色，根據(jù)電泳移動(dòng)距離分離單克隆組分，可對(duì)各類Ig及

14、其輕鏈進(jìn)行分型。最常用于M蛋白的鑒定。  放射性核素：具有放射性的核素，在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化變?yōu)榱硪环N（放射性）核素，并同時(shí)釋放射線。這一轉(zhuǎn)變過程稱為放射性衰變。 放射化學(xué)純度：指在標(biāo)記物中結(jié)合在抗原（或抗體）上的放射活性占該標(biāo)記物總放射活性的百分比。比放射活性：是指單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含的放射性活度，或每分子抗原（或抗體）平均所結(jié)合的放射性原子數(shù)目。 放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（待測(cè)/標(biāo)準(zhǔn)抗原）同時(shí)和限量特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，通過測(cè)定放射性核素標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物的放射性活度，經(jīng)相應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系推算待

15、測(cè)抗原的含量。免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性標(biāo)記的抗體來測(cè)定樣品中抗原的方法，所用的標(biāo)記抗體是過量的，抗原全部是非標(biāo)記的。待測(cè)抗原與過量標(biāo)記抗體結(jié)合反應(yīng)形成標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物及游離的標(biāo)記抗體，測(cè)定的是標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物的量.  熒光免疫技術(shù)：是將抗原抗體反應(yīng)與熒光技術(shù)相結(jié)合而建立的一種免疫熒光技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性。 熒光抗體技術(shù)（FAT）：以熒光素標(biāo)記抗體對(duì)抗原進(jìn)行定位染色，并借助熒光顯微鏡觀察標(biāo)本片上熒光染色的形態(tài)，從而判斷是否存在待測(cè)抗原，這種技術(shù)就是。熒光抗體染色方法：直接法（簡(jiǎn)便快速特異性強(qiáng)，但敏感性不如間接法，一種熒光抗體只能

16、檢測(cè)一種抗原）、間接法（敏感性比直接法高510倍，一種熒光二抗可檢測(cè)多種抗原/抗體，但容易產(chǎn)生非特異性熒光）、雙標(biāo)記法（用于檢測(cè)同一標(biāo)本中的兩種抗原） 熒光：熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為。發(fā)射光譜：是指固定激發(fā)光波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的譜圖激發(fā)光譜：是指固定檢測(cè)發(fā)射光（熒光）波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射樣品得到的熒光的譜圖。熒光效率：是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（

17、激發(fā)光強(qiáng)度）熒光猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱的現(xiàn)象。只有那些能產(chǎn)生明顯熒光的有機(jī)化合物才能作為熒光色素。 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA）：是以鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，并與時(shí)間分辨測(cè)定技術(shù)相結(jié)合而建立起來的一種新型非放射性微量分析技術(shù)。它具有靈敏度高、發(fā)光穩(wěn)定、熒光壽命長(zhǎng)、自然熒光干擾少、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，已在臨床檢測(cè)中廣泛使用。【基本原理】1、時(shí)間分辨：通常各種組織、蛋白或其他化合物，在激發(fā)光照射下都能發(fā)出一定波長(zhǎng)的自發(fā)熒光，這些熒光是非特異性的，會(huì)干擾熒光免疫測(cè)定，影響其特異性和靈敏度，但它們的熒光壽命常較短（110 ns），最長(zhǎng)不超過20ns

18、。而鑭系元素螯合物的熒光壽命較長(zhǎng)（101000 s），因此，在檢測(cè)時(shí)可在短壽命本底自發(fā)熒光完全衰變后，再測(cè)定鑭系元素螯合物的特異性熒光信號(hào)，可有效降低本底熒光的干擾，故稱為時(shí)間分辨。這是本技術(shù)具有高靈敏度的原因之一。2、stokes位移：即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長(zhǎng)差。鑭系元素stokes位移大（通常為273nm），激發(fā)/發(fā)射光譜不重疊，用簡(jiǎn)單的濾光片就能把激發(fā)光和發(fā)射光分開，可消除激發(fā)光散射引起的干擾。3、發(fā)射光譜和激發(fā)光譜：鑭系元素發(fā)射光譜帶較窄，多在613nm±10nm，利用615nm±5nm的濾光片只允許此波段的發(fā)射光通過，可排除其余波長(zhǎng)的熒光。生物樣品的本底熒光波長(zhǎng)

19、通常在350600 nm，故在615nm±5nm波段內(nèi)，來自生物樣品的熒光干擾極少，可有效降低本底熒光。鑭系元素的激發(fā)光譜則較寬，通常為300350 nm，非常有利于增加激發(fā)能，提高檢測(cè)的靈敏度。4、熒光標(biāo)記物的相對(duì)比活性：測(cè)定Eu3+螯合物發(fā)射熒光采用的激發(fā)光源為脈沖氙燈，其工作頻率為1000次/秒，由光導(dǎo)纖維閃光管的控制系統(tǒng)。比活性是指單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)標(biāo)記分子可被探測(cè)到的信號(hào)量。在測(cè)量時(shí)間內(nèi)，Eu3+可被反復(fù)激發(fā)，每次激發(fā)后，他可很快由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，發(fā)射熒光；然后又可被重新激發(fā)，如此每秒可有1000次激發(fā)，這就大大提高了熒光標(biāo)記物的比活性。5、信號(hào)增強(qiáng)：免疫反應(yīng)完成后，形成Eu3

20、+標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，其在弱堿性溶液中的激發(fā)熒光信號(hào)較弱，加入酸性增強(qiáng)液可使Eu3+標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物的pH降至23，Eu3+從復(fù)合物上完全解離，游離的Eu3+可被增強(qiáng)液中的螯合劑所螯合，在協(xié)同劑等成分的作用下，與增強(qiáng)液中的-二酮體生成以Eu3+為核心的保護(hù)性膠態(tài)分子團(tuán)，它是具有高強(qiáng)度熒光的穩(wěn)定螯合物，信號(hào)的增強(qiáng)效果可達(dá)上百萬倍。（二）標(biāo)記物和標(biāo)記方法1、標(biāo)記物：用于本技術(shù)測(cè)定的標(biāo)記物是鑭系元素，其中銪（Eu3+）和鋱（Tb3+）的熒光壽命特別長(zhǎng)且熒光強(qiáng)度高，多用這兩元素作為標(biāo)記物，其中Eu3+最為常用。鑭系元素在游離狀態(tài)下的熒光相對(duì)較弱，與螯合劑如-萘甲酰三氟丙酮（-NTA）等形成螯合物

21、后，可使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。螯合物的熒光壽命與配體有關(guān)。2、標(biāo)記方法：需利用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑，一端與鑭系元素離子結(jié)合，另一端與抗原或抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合，形成鑭系元素離子-螯合劑-抗原（或抗體）復(fù)合物。常用的雙功能螯合劑有1-（對(duì)-苯偶氮）-EDTA、異硫氰酸苯基-EDTA、異硫氰酸苯甲基-DTTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等，此法可允許每個(gè)蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記多個(gè)Eu3+而不影響其生物學(xué)活性和穩(wěn)定性。螯合劑可先螯合Eu3+，再連接蛋白質(zhì)（一步法），或先連接蛋白質(zhì)，再螯合Eu3+（兩步法）。針對(duì)小分子半抗原，則需先將半抗原與大分子蛋白載體（牛血清白蛋白，多聚賴氨酸等）連接，再標(biāo)記Eu3+。

22、（三）方法類型1、雙抗體夾心法：將待檢抗原與固相抗體結(jié)合，再與Eu3+標(biāo)記抗體結(jié)合，形成固相抗體 - 待測(cè)抗原 - Eu3+標(biāo)記抗體 復(fù)合物，在酸性增強(qiáng)液的作用下，復(fù)合物中的Eu3+從免疫復(fù)合物上解離并形成螯合物，在340nm激發(fā)光照射下，游離出的Eu3+螯合物可發(fā)射613nm的熒光。經(jīng)時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀測(cè)定并推算出待檢抗原的含量。2、固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法：將待檢抗原和Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液，測(cè)定熒光強(qiáng)度，所得熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量負(fù)相關(guān)。3、固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法：與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法類似，只是第一步改成將待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體。（

23、四）方法評(píng)價(jià)1、優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢出下限為10-18mol/L（普通熒光免疫計(jì)數(shù)僅為10-8mol/L）。分析范圍寬，可達(dá)45個(gè)數(shù)量級(jí)。標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，有效使用期長(zhǎng)。測(cè)量快速，易于自動(dòng)化。本法在靈敏度、穩(wěn)定性和測(cè)量自動(dòng)化程度等方面均可與RIA相媲美，是超微量物質(zhì)分析方法中最有發(fā)展前途的一項(xiàng)技術(shù)。2、缺點(diǎn)：易受環(huán)境、試劑和容器中鑭系元素離子的污染，使檢測(cè)本底增高。  酶免疫技術(shù)：是將酶高效催化反應(yīng)的專一性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。是將酶與抗原或抗體結(jié)合成酶標(biāo)記結(jié)合物（酶標(biāo)抗原/抗體），酶標(biāo)結(jié)合物既保留了抗原/抗體的免疫學(xué)活性，同時(shí)也保留了酶對(duì)底物的催

24、化活性。在酶標(biāo)記抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)完成后，加入酶作用的相應(yīng)底物，通過酶催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定。常用的酶：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）、-半乳糖苷酶（-Gal）常用的底物：HRP有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。ALP為對(duì)-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。-Gal為4-甲基傘形酮-D半乳糖苷（4MUG）常用的標(biāo)記方法：交聯(lián)法（戊二醛）和直接法（改良過碘酸鈉法）固相載體的選擇：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜載體包被（coating）：將抗體或抗原結(jié)合在固相載體上的過程。封閉（blocking）：用1%5%

25、的牛血清蛋白或5%20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附的干擾。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）【基本原理】把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗體）；將抗原或抗體與酶連接成酶標(biāo)記抗原或抗體（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根

26、據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（一）ELISA檢測(cè)抗原的方法主要有：1、雙抗體夾心法：適用于至少兩個(gè)抗原決定簇（AD）的Ag。先將特異性抗體與固相載體結(jié)合，形成固相抗體，加入待測(cè)標(biāo)本并溫育，使標(biāo)本中的抗原與固相抗體充分反應(yīng)，形成固相抗體抗原復(fù)合物，洗滌去除其他游離成分；然后加入酶標(biāo)記抗體并溫育，使固相抗體抗原復(fù)合物與酶標(biāo)記抗體結(jié)合，形成 固相抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體 復(fù)合物，為“雙抗體夾心”；洗滌去除游離酶標(biāo)記抗體。加入底物，固相載體結(jié)合的酶可催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物的顯色程度進(jìn)行抗原的定性或定量檢測(cè)。臨床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人絨毛膜促性腺激素HCG等

27、項(xiàng)目的檢測(cè)。2、雙位點(diǎn)一步法：該法是針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同且空間距離較遠(yuǎn)的抗原決定簇，分別制備兩種單克隆抗體，在包被時(shí)使用一種單抗，酶標(biāo)記時(shí)使用另一種單抗。測(cè)定時(shí)將含待測(cè)抗原標(biāo)本和酶標(biāo)記抗體同時(shí)加入反應(yīng)體系，兩種抗體分別與不同的抗原決定簇結(jié)合，只進(jìn)行一次溫育，在洗滌后即可加底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。擔(dān)當(dāng)待測(cè)抗原濃度過高時(shí)，可出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。）3、競(jìng)爭(zhēng)法：適用于小分子Ag或半抗原（只有一個(gè)AD）。先用特異性抗體包被固相載體，然后同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)記的抗原，待測(cè)樣本中的抗原與酶標(biāo)記抗原 競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的特異性抗體結(jié)合，溫育一段時(shí)間后洗滌，加入底

28、物顯色。（二）ELISA檢測(cè)抗體的方法主要有：1、間接法：檢測(cè)Ab最常用的方法。常用酶標(biāo)記羊抗人IgG。2、雙抗原夾心法：靈敏度和特異性高于間接法，原理類似雙抗體夾心法，操作步驟也基本相同，也可采用一步法，但一般不會(huì)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。臨床上乙型肝炎表面抗體HBsAb的測(cè)定常用此法。3、競(jìng)爭(zhēng)法：當(dāng)相應(yīng)抗原材料中含有難以去除的雜質(zhì)，不易得到足夠的純化抗原或抗原性質(zhì)不穩(wěn)定時(shí)，可采用此方法。主要用于測(cè)定HBcAb和HBeAb。原理見下：（1）HBcAb的競(jìng)爭(zhēng)法：先將核心抗原包被在固相載體上形成固相抗原，然后加入待測(cè)標(biāo)本和酶標(biāo)記的特異性核心抗體，此時(shí)待測(cè)標(biāo)本中的HBcAb與酶標(biāo)記HBcAb競(jìng)爭(zhēng)性地與固相載體

29、上的核心抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)標(biāo)本中的HBcAb的含量負(fù)相關(guān)。（2）HBeAb的競(jìng)爭(zhēng)法：先將HBeAb包被在固相載體上形成固相抗體，同時(shí)加入待測(cè)標(biāo)本和中和抗原HBeAg，此時(shí)待測(cè)標(biāo)本中的HBeAb和固相抗體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合中和抗原HBeAg，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)記的HBeAb，酶標(biāo)記抗體與結(jié)合于固相抗體上的特異性抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色強(qiáng)弱與待測(cè)標(biāo)本中HBeAb的含量呈負(fù)相關(guān)。4、捕獲法：又稱反向間接法，主要用于血清中特定Ig類別的測(cè)定，最常用于病原體急性感染診斷中IgM型抗體檢測(cè)。原理：首先將針對(duì)IgM的第二抗體包被于固相載體形成固相抗體，加入待測(cè)標(biāo)

30、本后，標(biāo)本中所有的IgM（特異/非特異）即可被固相抗體捕獲。第二步加入特異性抗原，其與固相載體上捕獲的IgM特異性抗體結(jié)合，再加入針對(duì)特異性抗原的酶標(biāo)記抗體，形成 固相抗人鏈IgM-抗原-酶標(biāo)記抗體 復(fù)合物，最后加入底物顯色，即可對(duì)待測(cè)標(biāo)本中抗原特異性IgM進(jìn)行定性或定量測(cè)定。此法臨床上常用于病原體急性感染的實(shí)驗(yàn)室診斷，如急性甲肝時(shí)可檢測(cè)HAV-IgM抗體，急性乙型肝炎時(shí)可檢測(cè)抗HBc-IgM抗體。  發(fā)光免疫分析（CLIA）：是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。兼有高靈敏性和高特異性。 發(fā)光：分子/原子中的電子吸

31、收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并施放光子的過程?；瘜W(xué)發(fā)光：伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。發(fā)光效率：又稱化學(xué)發(fā)光反應(yīng)量子產(chǎn)率，是指發(fā)光劑在反應(yīng)中的發(fā)光分子數(shù)與參加反應(yīng)的分子數(shù)之比，取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率。 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)可分為均相反應(yīng)（不需分離）和非均相反應(yīng)（需要分離）非均相分離方式有：固相分離、過濾分離、珠式分離、順磁性顆粒分離?！净瘜W(xué)發(fā)光劑】直接化學(xué)發(fā)光劑：魯米諾和吖啶酯（常用）間接化學(xué)發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物【標(biāo)記技術(shù)】常用標(biāo)記方法：碳二亞胺縮

32、合法、過碘酸鈉氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法影響標(biāo)記的因素：發(fā)光劑的選擇、被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)、標(biāo)記方法的選擇、原料比、標(biāo)記率、溫度、純化與保存。 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）【原理】：是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（ALP）來標(biāo)記抗體（或抗原），與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體 復(fù)合物，經(jīng)洗滌后加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。【特點(diǎn)】：屬酶免疫測(cè)定范疇，測(cè)定過程與ELIS

33、A類似，僅最后一步酶反應(yīng)的底物改為發(fā)光劑、測(cè)定的儀器改為光信號(hào)檢測(cè)儀；酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定；酶催化魯米諾、AMPPD等發(fā)光劑發(fā)出的光穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，便于記錄和測(cè)定。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）【原理】是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程）。在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體 復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)入流動(dòng)室，同時(shí)注入TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在點(diǎn)擊下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)

34、本緩沖液被沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。光信號(hào)由安裝在流動(dòng)室上方的光信號(hào)檢測(cè)器檢測(cè)，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比?！咎攸c(diǎn)】：三聯(lián)吡啶釕在電場(chǎng)中因不斷得到三丙胺提供的電子，可周而復(fù)始的發(fā)光，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，信號(hào)強(qiáng)度高，容易測(cè)定、控制；三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原或抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)記物的理化特性；試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好。    生物素（B）又稱維生素H ，分子式為C10H16O3N2S，等電點(diǎn)（pI）為3.5。生物素結(jié)構(gòu)中，I 環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結(jié)合的主要部位；II 環(huán)為噻吩環(huán)，

35、含有一個(gè)戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標(biāo)記抗體或其他分子的唯一結(jié)構(gòu)。抗體分子經(jīng)生物素化后，其結(jié)合抗原的活性不受影響。多種酶經(jīng)生物素化后，其催化能力保持不變或稍有降低。 生物素-親合素系統(tǒng)【特點(diǎn)】：高特異性、高敏感性、穩(wěn)定強(qiáng)、實(shí)用性強(qiáng) 【應(yīng)用】：在標(biāo)記免疫技術(shù)中可應(yīng)用于標(biāo)記信號(hào)放大環(huán)節(jié)，也可用于固相包被（或分離）環(huán)節(jié)  一、應(yīng)用于固相載體的包被環(huán)節(jié)鏈霉親合素（親合素）為弱酸性蛋白，可以吸附在固相載體（聚苯乙烯微孔板或納米微球）表面，形成鏈霉親合素包被固相載體；利用生物素標(biāo)記抗原（或抗體），使待包被的抗原（抗體）通過生物素與固相材料表面的鏈霉親合素結(jié)合，實(shí)現(xiàn)間接包被。

36、此種包被模式不但可增加抗原（或抗體）包被數(shù)量，也可減少空間位阻效應(yīng)，提高抗原（或抗體）的利用效率。此外，若固相材料不與生物素化抗原（或抗體）結(jié)合，待生物素化抗原（或抗體）與待檢抗體（或抗原）反應(yīng)后，再加入鏈霉親合素預(yù)包被磁性納米微球，含有生物素的免疫復(fù)合物可結(jié)合在固相載體表面，達(dá)到同樣的分離效果。二、應(yīng)用于檢測(cè)系統(tǒng)的信號(hào)放大生物素-親合素系統(tǒng)用于檢測(cè)信號(hào)放大，可提高標(biāo)記免疫分析的敏感性?；痉绞接?生物素-親合素-生物素 模式（BAB）和 生物素-親合素 模式（BA）或標(biāo)記親合素模式。如將生物素標(biāo)記在第一抗體上稱為直接法，如生物素標(biāo)記在第二抗體上稱為間接法。生物素-親合素-生物素模式的特點(diǎn)是生

37、物素標(biāo)記分子（如生物素標(biāo)記抗體/酶蛋白），以游離親合素為橋，連接 抗原-抗體 和信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)；由于一個(gè)親合素分子能同時(shí)結(jié)合4個(gè)生物素，且一個(gè)生物素大分子可標(biāo)記多個(gè)生物素而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，提升檢測(cè)敏感性。實(shí)際應(yīng)用中的ABC法：預(yù)先按一定比例將親合素與生物素標(biāo)記示蹤物質(zhì)（如生物素標(biāo)記ALP）混合，形成可溶性的 親合素-生物素化酶標(biāo) 復(fù)合物，同時(shí)確保預(yù)留一定位點(diǎn)與生物素化的抗體（或抗原）結(jié)合。此種方法能減少操作步驟，又能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作（有商品化的試劑）。將ABC法應(yīng)用于雙抗體夾心ELISA中，形成ABC-ELISA，為常用方法。  固相膜免疫分析技術(shù)：是以微孔膜作為固相載體，利

38、用液體可以流過微孔膜也可以通過毛細(xì)管作用在膜上向前移行的特性，以酶標(biāo)記或各種有色微粒子（如彩色膠乳、膠體金或膠體硒等）標(biāo)記抗體或抗原作為標(biāo)記物，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行抗原或抗體檢測(cè)的快速檢驗(yàn)方法。膠體金免疫技術(shù)：是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。膠體金：也稱金溶膠，是金鹽被還原為金原子后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成（內(nèi)層為負(fù)離子層AuCl2-，外層是帶正電荷的H+）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，故稱膠體金。免疫金：是指膠體金與抗原或抗體等大分子物

39、質(zhì)的結(jié)合物。其制備過程實(shí)質(zhì)上是抗體蛋白等大分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。（一）斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA）【原理】是在以硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上，故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測(cè)目的（一般5min左右完成）陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。本法簡(jiǎn)化了操作步驟，達(dá)到簡(jiǎn)便的目的，已成為“床旁檢測(cè)（POCT）”的主要方法之一?！痉椒愋汀浚?#160; 雙抗體夾心法：將抗體包被在硝酸纖維素膜中央，滴加待檢標(biāo)本，若標(biāo)本中有待測(cè)抗原則在滲濾過程中與膜上抗體結(jié)合，然后

40、滴加膠體金標(biāo)記抗體，加洗滌液洗滌后，陽性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。間接法：將抗原包被在硝酸纖維素膜上，依次滴加待測(cè)標(biāo)本、洗滌液和膠體金標(biāo)記抗人IgG抗體，再加洗滌液洗滌， 陽性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。本法因受非目的IgG的干擾，易產(chǎn)生假陽性，臨床上較少使用。（二）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（DICA）【原理】是將膠體金標(biāo)記和蛋白質(zhì)層析 技術(shù)相結(jié)合的，以硝酸纖維素膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。在DICA中，滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體末的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層析一般，在移動(dòng)過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域

41、而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！痉椒愋汀浚弘p抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法（三）臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)1、特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，無需特殊儀器設(shè)備，試劑穩(wěn)定、便于保存等特點(diǎn)。2、靈敏度問題：靈敏度不及酶標(biāo)法和酶發(fā)光免疫測(cè)定法，臨床應(yīng)用中應(yīng)引起高度重視。3、臨床應(yīng)用：臨床只能作為定性/半定量 試驗(yàn)，目前主要應(yīng)用于正常體液中不存在的物質(zhì)（如傳染病抗原和抗體以及毒品類藥物）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如人絨毛膜促性腺激素HCG）。 斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）【原理】與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于斑點(diǎn)-ELISA所用載體為對(duì)

42、蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)吸附力（近100%）的硝酸纖維素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。【技術(shù)要點(diǎn)】1、抗原包被膜：加少量（12L）抗原于膜上。由于NC膜吸附力強(qiáng)，故需在包被后進(jìn)行封閉。2、抗原抗體反應(yīng)：滴加樣品血清，其中的待檢抗體即與NC膜上抗原結(jié)合；洗滌后再滴加酶標(biāo)二抗。3、顯色反應(yīng)：滴加能形成不溶有色沉淀的底物溶液（如HRP標(biāo)記物，常用二氨基聯(lián)苯胺）；陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點(diǎn)?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】斑點(diǎn)-ELISA的優(yōu)點(diǎn)為：NC膜吸附蛋白力強(qiáng)，微量抗原吸附完全，故檢出靈敏度可較普通ELISA高68倍；試劑用量較ELISA約節(jié)約10倍；操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判斷不需特殊設(shè)

43、備條件；吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果的NC膜可長(zhǎng)期保存（-20可長(zhǎng)達(dá)半年），不影響其活性。 免疫印跡試驗(yàn)（IBT）亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法（EITB），通常又稱Western-blot?！驹怼渴且环N將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析相結(jié)合的技術(shù)，具有分析容量大、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種常用方法，如組織抗原的定性定量檢測(cè)、多肽分子的質(zhì)量測(cè)定及病毒的抗體或抗原檢測(cè)等。【技術(shù)要點(diǎn)】1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極涌動(dòng)，分子量越小，涌動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見

44、（只有染色后才顯出電泳區(qū)帶）。2、電轉(zhuǎn)移：將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（12A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離效果肉眼仍不可見。3、酶免疫定位：將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨。并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】1、抗體的性質(zhì)：影響本試驗(yàn)成敗的一個(gè)主要因素是抗原分子中可被抗體時(shí)別的

45、表位的性質(zhì)。只有那些能識(shí)別耐變形表位的抗體可與抗原結(jié)合，所以在該試驗(yàn)中常選用多克隆抗體。2、IBT的靈敏度：一種是在電泳之前應(yīng)用免疫沉淀法將抗原進(jìn)行純化和濃縮。其他方法都是針對(duì)增強(qiáng)信號(hào)本身設(shè)計(jì)的，包括使用信號(hào)更好和更強(qiáng)的熒光實(shí)際或使條帶局部酶的活性增強(qiáng)等。3、IBT法在臨床應(yīng)用中存在一定局限性。PS：本試驗(yàn)是HIV/AIDS的確診試驗(yàn)。 非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色 首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，通過免疫學(xué)反應(yīng)將抗酶抗體與組織抗原聯(lián)系在一起。該方法避免了酶標(biāo)記時(shí)對(duì)抗體的損傷，同時(shí)也提高了方法的敏感性【技術(shù)類型】（一）酶橋法 抗酶抗體作為第三抗體

46、，通過橋抗體（第二抗體）將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體連接，形成酶聯(lián)的 抗原-抗體 復(fù)合物，加底物顯色。本法較酶標(biāo)法的敏感性有所提高，但操作分四步較為復(fù)雜。（二）過氧化物酶抗過氧化物酶酶（PAP）法是在酶橋法的基礎(chǔ)上加以改良。本法首先將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶組成可溶性復(fù)合物（PAP復(fù)合物）。該復(fù)合物由兩個(gè)抗酶抗體和三個(gè)過氧化物酶分子組成，呈五角形結(jié)構(gòu)，非常穩(wěn)定。通過橋抗體（第二抗體），將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來，此時(shí)要求特異性第一抗體與第三抗體的動(dòng)物種屬相同與酶橋法相比，PAP法操作簡(jiǎn)便，分三步；PAP復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，避免了酶橋法中標(biāo)記易脫落的弊端

47、；敏感性高；背景著色淡，因?yàn)榧词箻蚵?lián)抗體存在有非特異性抗體的可能，但因其與第一抗體并非同種屬，故不能與抗酶抗體結(jié)合。并且，如果抗酶抗體中存在著非抗酶抗體，當(dāng)其與橋抗體或組織成分結(jié)合時(shí)，由于其不能與酶結(jié)合，也不會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。（三）雙橋PAP法該法建立在PAP法的基礎(chǔ)上。其基本原理是在PAP法中通過兩次連接橋抗體和PAP復(fù)合物而建立起來的，通過雙橋可結(jié)合更多的PAP復(fù)合物于抗原分子上，以增強(qiáng)敏感性。這種放大方式重復(fù)使用橋抗體，使橋抗體與PAP復(fù)合物中抗酶抗體的未飽和Fc段結(jié)合，或橋抗體與特異性第一抗體未飽和的Fc段結(jié)合。如此對(duì)抗原有明顯放大作用，對(duì)于組織細(xì)胞微量抗原的檢測(cè)又實(shí)用價(jià)值。（四）堿

48、性磷酸酶抗堿性磷酸酶法（APAAP）法因部分組織細(xì)胞內(nèi)含內(nèi)源性過氧化物酶，限制了HRP的廣泛應(yīng)用，需選用其他酶免疫組織化學(xué)反應(yīng)。本法是用堿性磷酸酶（ALP）代替HRP建立的堿性磷酸酶（ALP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡(jiǎn)稱APAAP。其技術(shù)要點(diǎn)與PAP法相似。【常用酶及顯色底物】最常用的是辣根過氧化物酶（HRP），常用的供氫體有二氨基聯(lián)苯胺（DAB），反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色其他有：氨基乙基卡巴唑（AEC），反應(yīng)產(chǎn)物為橘紅色；4-氯-1-萘酚，反應(yīng)產(chǎn)物為灰藍(lán)色。堿性磷酸酶為磷酸酯的水解酶，可通過兩種反應(yīng)顯色：偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，最終與重氮化合物作用生成不溶沉淀，如快藍(lán)為深藍(lán)色，快紅為紅色。靛藍(lán)四唑反應(yīng)，最終

49、形成紫藍(lán)色不溶沉淀。其他標(biāo)記酶還有葡萄糖氧化酶（GO）、-半乳糖酶等；前者底物為葡萄糖，配以NBT和PMS，呈藍(lán)色沉淀。對(duì)含有豐富內(nèi)源性過氧化物酶的組織切片（如淋巴/腫瘤組織），首選ALP標(biāo)記的免疫組織化學(xué)方法（但HRP比ALP染色結(jié)果的保存時(shí)間長(zhǎng)）。GO存在敏感性不高、顯色底物不易保存等缺點(diǎn)。ALP和HRP結(jié)合可進(jìn)行雙重或三重免疫組織化學(xué)標(biāo)記。  流式細(xì)胞術(shù)（FCM）：是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確地對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。  【工作原理】采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克

50、隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行分析處理，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。因而能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞上獲取多種參數(shù)資料，保證對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的分析。一、細(xì)胞分析原理1、樣品進(jìn)入流動(dòng)室：將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，沿流動(dòng)室的軸心向下流動(dòng)。2、鞘液的作用：流動(dòng)室軸心至外壁的鞘液也向下流動(dòng)，形成包繞細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點(diǎn)稱為測(cè)量

51、區(qū)。3、信號(hào)的產(chǎn)生與接收：染色的細(xì)胞在測(cè)量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射。這些信號(hào)分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞大小和核酸含量等指標(biāo)。二、細(xì)胞分選原理當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場(chǎng)時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。見上圖，前向散射光（線性、對(duì)數(shù)）FS：反映顆粒的大小，側(cè)向散射光（線性、對(duì)數(shù)）SS：反映顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、表面的光滑程度。熒光（線性、對(duì)數(shù)、峰值）FL：反映顆粒被染上熒光

52、部分?jǐn)?shù)量的多少。見上圖，橫軸反映FS的強(qiáng)弱，縱軸反映SS的強(qiáng)弱。根據(jù)細(xì)胞大小和結(jié)構(gòu)的不同，外周血白細(xì)胞在本圖上可被明顯地區(qū)分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）：包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其比重在1.0751.090，而紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞比重在1.092左右。分離淋巴細(xì)胞以密度1.077±0.001的分層液為佳。Ficoll分離液法主要用于分離PBMCs，是一種單次差速密度梯度離心法。聚蔗糖-泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液，商品名Ficoll。分離時(shí)先將分層液置試管底層，然后將肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液做適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液的上面，使兩者

53、形成一個(gè)清晰的界面。水平式離心后，離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶：由于紅細(xì)胞和粒細(xì)胞比重大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞在Ficoll液中凝聚成串而沉于管底，血小板則因密度小而懸浮于血漿中，只有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面之中，呈白膜狀為白膜層。吸取該層細(xì)胞，經(jīng)洗滌離心重懸即為單個(gè)核細(xì)胞。本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95%，淋巴細(xì)胞約占9095 %，細(xì)胞收率可達(dá)80%以上，但室溫超過25時(shí)可影響細(xì)胞收率。  輔助性T細(xì)胞的典型表面標(biāo)志：CD3+CD4+CD8-。（Th1主要分泌IL-2，IFN-或TNF-等輔助細(xì)胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)；Th2主

54、要分泌IL-4/5/6/10等輔助體液免疫、參與速發(fā)型超敏反應(yīng)）細(xì)胞毒性T細(xì)胞的典型表面標(biāo)志是CD3+CD4-CD8+。（CD3+CD8+CD30-可認(rèn)定為Tc1細(xì)胞；CD3+CD8+CD30+可認(rèn)定為Tc2）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：自然存在的，其典型標(biāo)志為CD4+CD25+Foxp3+ （最重要的分子標(biāo)記是一種轉(zhuǎn)錄因子Foxp3） 成熟B細(xì)胞均表達(dá)CD19，B1細(xì)胞CD19+CD5+，B2細(xì)胞CD19+CD5-NK細(xì)胞的典型標(biāo)志：CD3-CD16+CD56+。單核-巨噬細(xì)胞的典型表面標(biāo)志為CD14。人成熟DC的主要特征表面標(biāo)志為CD1a、CD11c和CD83，但不表達(dá)MPS、T/B/NK細(xì)胞

55、的典型表面標(biāo)志（CD14/3/19和CD20/16/56）。 T細(xì)胞增殖試驗(yàn)有：形態(tài)學(xué)檢查法，3H-TdR摻入法、MTT比色法 溶血空斑實(shí)驗(yàn)（PFC）：將經(jīng)SRBC免疫過的小鼠脾細(xì)胞與一定量的SRBC混合，在補(bǔ)體參與下，使抗體形成細(xì)胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細(xì)胞溶解，形成肉眼可見的溶血空斑，每一個(gè)空斑中央含一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細(xì)胞數(shù)目。  細(xì)胞因子（CK）：是由機(jī)體活化的免疫細(xì)胞及某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，通過結(jié)合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)（有旁分泌、自分泌、內(nèi)分泌）。細(xì)胞粘附分子（CAM）：是由細(xì)胞產(chǎn)生、介導(dǎo)細(xì)胞與

56、細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的分子。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELISPOT）：在包被有待測(cè)CK抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，在有或無刺激物存在的條件下培養(yǎng)后，待測(cè)細(xì)胞向其周圍分泌細(xì)胞因子，并被板上的特異性抗體捕獲。洗去細(xì)胞后用酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別做直接法和間接法。所選底物應(yīng)在酶促反應(yīng)后形成不溶性產(chǎn)物。一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞因子量相關(guān)。目前在細(xì)胞因子檢測(cè)方面應(yīng)用較多的是IFN-的測(cè)定。  免疫球蛋白(Ig)：是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白?？煞譃榉置谛秃湍ば蛢深?。（現(xiàn)在認(rèn)為，Ig與Ab沒有什么區(qū)別）臨

57、床上常用速率散射免疫比濁法檢測(cè)Ig。 免疫球蛋白測(cè)定的臨床意義一、血液免疫球蛋白測(cè)定的臨床意義（一）年齡，年齡不同其血液中的Ig含量有一定變化，新生兒可由母體獲得通過胎盤轉(zhuǎn)移來的IgG，故血液中含量較高，接近成人水平。嬰幼兒體液免疫功能尚不成熟，Ig含量低于成人，各年齡段的正常參考區(qū)間見教材。需要注意的是，血液Ig隨年齡、性別、血型、種族及測(cè)定方法不同而有差別，各實(shí)驗(yàn)室需要建立自己的參考值范圍。（二）多克隆高Ig血癥肝臟疾病如慢性活動(dòng)性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、隱匿性肝硬化等患者的血清中，三種免疫球蛋白均可升高。慢性細(xì)菌性感染如結(jié)核、麻風(fēng)、慢性支氣管炎等血中IgG可升高。宮內(nèi)感染時(shí)臍

58、帶血或出生后的新生兒血清中IgM含量可增高。自身免疫性疾病時(shí)三種Ig均可升高，如SLE患者以IgG/A升高較為多見，類風(fēng)濕性性關(guān)節(jié)炎患者以IgM升高為主。（三）單克隆Ig升高主要是指患者血清中某一類Ig含量顯著增多，大多在30g/L以上，這種異常增多的Ig理化性質(zhì)十分一致，稱為單克隆蛋白（MP）即M蛋白。此類異常增多的Ig多無免疫活性，故又稱為副蛋白，由它所致的疾病稱為免疫增殖性疾病，如多發(fā)性骨髓瘤MM、巨球蛋白血癥、惡性淋巴瘤、重鏈/輕鏈病等。（四）低免疫球蛋白血癥1、先天性：主要見與體液免疫缺陷病和聯(lián)合免疫缺陷病。一種情況是Ig全缺，如Bruton無Ig血癥，血中IgG常1g/L，IgA/M含量也明顯降低，為正常成人的1%。另一種情況是三種Ig缺一種到兩種，如IgA缺乏患者，易發(fā)生反復(fù)呼吸道感染；IgG缺乏患者，易發(fā)生化膿性感染；IgM缺乏患者，易發(fā)生革蘭陰性菌敗血癥。2、獲得性：患者血清中IgG常5g/L，引起的原因很多。大量蛋白丟失的疾?。ㄈ鐭齻兠撔云ぱ?、胃病綜合癥等）、淋巴系統(tǒng)腫瘤（如淋巴