生理實驗設(shè)計：肉毒桿菌毒素對神經(jīng)-肌肉接頭處興奮傳遞的影響1

1、生理學(xué)實驗設(shè)計肉毒桿菌毒素對神經(jīng)-肌肉接頭的影響肉毒桿菌毒素對神經(jīng)一肌肉接頭處興奮傳遞的影響實驗設(shè)計實驗原理：神經(jīng)-肌肉接頭是由接頭前膜、接頭后膜和接頭間隙三部分組成。運動神經(jīng) 纖維到達(dá)骨骼肌細(xì)胞時，其末梢失去髓鞘，嵌入肌細(xì)胞膜。當(dāng)動作電位到達(dá)神經(jīng) 末梢時，接頭前膜的電壓門控 C§+通道打開，可引起大量C§+由細(xì)胞外進(jìn)入接頭 前膜，使接頭前膜將ACh釋放到接頭間隙。AChffi過接頭間隙到達(dá)接頭后膜（終 板膜）是，立即與終板膜上 ACh受體（膽堿受體）結(jié)合，使通道開放，允許 Na+ 和K+等通過（以NS為主），因而引起終板膜靜息電位減小，使終板膜去極化。一 次終板電位一般都

2、比相鄰肌細(xì)胞膜閾電位大 34倍，所以很容易引起鄰近肌細(xì) 胞膜爆發(fā)動作電位，引起骨骼肌細(xì)胞的興奮。含有神經(jīng)遞質(zhì)ACh的突觸小泡在突 觸前膜上錨定、融合，以及 ACh向突觸間隙釋放均需要一組 SNAR窿白的介導(dǎo)。 而肉毒桿菌毒素能特異性切割 SNAR窿白，阻止轉(zhuǎn)運小泡中ACh的釋放，阻斷神 經(jīng)傳遞，從而引起肌肉麻痹。 實驗?zāi)康模禾骄咳舛緱U菌毒素對神經(jīng)一肌肉接頭處興奮傳遞的影響。 實驗對象：牛蛙 實驗儀器和試劑：蛙手術(shù)器械一套（包括普通剪刀、直剪、眼科剪、眼科銀子、脊髓探針和玻 璃分針等）、蛙板、滴管、細(xì)線、平皿、腓腸肌固定屏蔽盒、BL-420生物功能實驗系統(tǒng)、1%桿菌毒素溶液（取0.1g肉毒桿菌毒

3、素加入9.9mL任氏液溶解，倒 入細(xì)口瓶待用）、乙酰膽堿溶液（任氏液配制）、任氏液。 實驗方法：1、坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的制備（1）破壞腦和脊髓：用左手握蛙，食指壓其頭部前端，拇指按壓背部，使頭稍微下俯，無名指和小指夾住蛙身。右手持探針從頭部沿正中線向尾端觸劃, 當(dāng)觸到凹陷處即枕骨大孔所在位置時，將探針垂直刺入，再將探針向前方插入顱 腔，左右攪動，以徹底搗毀腦。然后將探針退到枕骨大孔，但不拔出而是將其尖 轉(zhuǎn)向后插入脊髓管中，插進(jìn)椎管時可感到一格一格前進(jìn)的感覺，同時后肢失去緊 張性，多數(shù)情況下蛙出現(xiàn)尿失禁。若蛙四肢完全松軟，即表明腦與脊髓已完全破 壞。否則應(yīng)繼續(xù)搗毀至徹底破壞為止。(2)去除皮膚

4、和內(nèi)臟：用普通剪刀在薦尾關(guān)節(jié)以上 1cm處剪斷脊柱。用銀 子或左手掐住脊柱斷端，將皮膚和內(nèi)臟向下拉，一同除去。將剝離的后軀標(biāo)本放 在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中備用。(3)分離兩腿：將剝離的后軀標(biāo)本沿脊柱正中線剪為左、右兩半，并從恥 骨聯(lián)合中央剪斷，這樣后軀被分為左、右兩部分，將分開的兩腿浸于有任氏液的 培養(yǎng)皿中備用。(4)游離坐骨神經(jīng)：取一側(cè)后腿，腹側(cè)向上，用玻璃分針沿脊柱向后分離 坐骨神經(jīng)，去除坐骨神經(jīng)的小分支部分，再將后腿背側(cè)向上，剪斷梨狀肌及其附 近結(jié)締組織，用玻璃分針沿坐骨神經(jīng)溝分離出坐骨神經(jīng)的股骨至膝關(guān)節(jié)部分，保留股骨約1cm,剪斷其他組織，去除股骨附著肌肉。(5)完成標(biāo)本：剝離腓腸肌，在

5、其跟腱處系一條細(xì)線，保留細(xì)線，在跟腱 處剪斷。除去其他組織后，制成坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本。2、實驗裝置(1)將蛙離體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本固定在屏蔽盒中。(2)腓腸肌的跟腱結(jié)扎線固定在張力轉(zhuǎn)換器的張力環(huán)上。(3)坐骨神經(jīng)放在刺激引導(dǎo)電極上，保持神經(jīng)與電極接觸良好，刺激電極 與引導(dǎo)電極間的接觸電極接地，引導(dǎo)電極引導(dǎo)神經(jīng)干動作電位。(4)打開計算機(jī)，啟動BL-420生物功能實驗系統(tǒng)。3、實驗觀察(1)尋找最適刺激強(qiáng)度：進(jìn)入“刺激強(qiáng)度與反應(yīng)的關(guān)系”實驗?zāi)K，選擇 程控模式，設(shè)置參數(shù)為起始刺激0.02s，間隔1s,每次刺激的刺激強(qiáng)度增加0.01V。 開始出現(xiàn)收縮曲線的最小刺激強(qiáng)度為閾強(qiáng)度。隨著刺激強(qiáng)度的增

6、加，肌肉收縮產(chǎn)生的張力不斷增大到最大值，此時繼續(xù)增加刺激強(qiáng)度，肌肉收縮產(chǎn)生的張力不會 繼續(xù)增大。此時對應(yīng)的強(qiáng)度為最適刺激強(qiáng)度。(2)開啟計算機(jī)：單擊BL-420生物功能實驗系統(tǒng)菜單”實驗/常用生理學(xué) 實驗”，選擇“神經(jīng)-肌肉接頭興奮的傳遞和阻滯”。(3)刺激模式：采用單刺激和用刺激。(4)觀察正常的收縮活動：以最適刺激強(qiáng)度，用25s的主周期刺激坐骨神經(jīng)，觀察腓腸肌的收縮曲線，神經(jīng)干動作電位波形和刺激標(biāo)記以及三者之間的 時間關(guān)系。(5)阻滯劑的作用：在腓腸肌表面滴加肉毒桿菌毒素溶液，以最適刺激強(qiáng) 度，每隔30s刺激坐骨神經(jīng)一次，觀察肌肉收縮曲線，神經(jīng)干動作電位波形的變 化。(6)坐骨神經(jīng)-腓腸肌接頭的恢復(fù)：在腓腸肌上滴加乙酰膽堿溶液后對坐骨 神經(jīng)進(jìn)行刺激(參數(shù)與(4)相同)，觀察肌肉收縮曲線，神經(jīng)干動作電位波形的 變化。技術(shù)路線：蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備連接儀器比較收縮曲線得出結(jié)論預(yù)期結(jié)果：在腓腸肌上滴加肉毒桿菌毒素后，刺激坐骨神經(jīng)，肌肉的收縮反應(yīng)逐漸減弱 直至消失，之后再滴加乙酰膽堿溶液，再刺激坐骨神經(jīng)，肌肉恢復(fù)收縮。由此證 明肉毒桿菌毒素通過阻止突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放阻止。注意事項：1 .制備標(biāo)本時要避免損傷神經(jīng)和肌肉組織。2 .屏蔽盒的電極要求接地良好，防止干擾。3 .實驗中要保持標(biāo)