貴大分子研究生考試題庫

1、一、名詞解釋1Gene and Genome 基因和基因組基因：能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和RNA的DNA序列，是決定遺傳性狀的功能單位?；蚪M：細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。2. Signal peptide 信號(hào)肽在蛋白質(zhì)合成過程中N 端有1536 個(gè)氨基酸殘基的肽段，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜。3. Opening Reading Frame 開放式閱讀框是結(jié)構(gòu)基因的正常核替酸序列，從起始密碼子到終止密碼子的閱讀框可編碼完整的多敗鏈，其問不存在使翻譯中斷的終止密碼子。4. Sense strain 有意鏈雙鏈DNA中與mRNA序列相同，編碼蛋白質(zhì)的那條DNA鏈。 5. Expressed

2、 sequence tag(EST) 表達(dá)序列標(biāo)簽從互補(bǔ)DNA(cDNA)分子所測(cè)得部分序列的短段DNA(通常300500bp)。從cDNA文庫所得到的許多表達(dá)序列標(biāo)簽集合組成表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，代表在一定的發(fā)育時(shí)期或特定的環(huán)境條件下，特定的組織細(xì)胞基因表達(dá)的序列。6. Microarray 基因芯片DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可獲得樣品的遺傳信息。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。7. Genomics and RNomics RNom

3、ics：RNA組學(xué)，既是核糖核酸組學(xué)，研究所有RNA的不同時(shí)空表達(dá)譜及其生物學(xué)意義。Genomics：基因組學(xué)，研究基因組的結(jié)構(gòu)與功能的學(xué)科，主要包括DNA的核苷酸序列、遺傳信息含量、基因組織和基因數(shù)目等8. RNAi RNA干涉RNA干擾，利用雙鏈小RNA分子高效、特異的降解細(xì)胞內(nèi)同源RNA，從而阻斷體內(nèi)靶基因的表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。9. MicroRNA 微小分子RNAMicroRNA，是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體，經(jīng)過Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子（21-23個(gè)核苷酸）。10. intron and exon 內(nèi)含子和外顯子內(nèi)含子，在不連續(xù)基因中無編碼功能的區(qū)

4、段（在初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA加工產(chǎn)生成熟的mRNA時(shí)，被切除的非編碼序列是內(nèi)含子）外顯子，在不連續(xù)基因中有編碼功能的區(qū)段（在初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA加工產(chǎn)生成熟的mRNA時(shí)，留下的編碼序列是外顯子）二、簡答題1病毒、原核生物基因組與真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？ 種類單一；單倍體基因組：每個(gè)基因組在病毒中只出現(xiàn)一次；形式多樣；大小不一；基因重疊；動(dòng)物/細(xì)菌病毒與真核/原核基因相似：內(nèi)含子；具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因；基因編碼區(qū)無間隔：通過宿主及病毒本身酶切；無帽狀結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)基因沒有翻譯起始序列。2、原核基因組的特點(diǎn)：為一條環(huán)狀雙鏈DNA；只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；具有操縱子結(jié)構(gòu)；絕大部分為單拷貝；可表達(dá)基因約

5、50%，大于真核生物小于病毒；基因一般是連續(xù)的，無內(nèi)含子；重復(fù)序列很少。3、真核基因組的特點(diǎn)：真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)；真核基因?yàn)閱雾樂醋樱?xì)菌和病毒的結(jié)構(gòu)基因多為多順反子；基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)；真核基因多為不連續(xù)的斷裂基因，由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌而成；存在大量的重復(fù)序列；功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族；存在可移動(dòng)的遺傳因素；體細(xì)胞為雙倍體，而精子和卵子為單倍體。2舉例說明差示篩選組織特異cDNA的方法制備兩種細(xì)胞群體，目的基因在其中一種細(xì)胞中表達(dá)或高表達(dá)，在另一種細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，然

6、后通過雜交對(duì)比找到目的基因。 例如：在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)與正常細(xì)胞表達(dá)水平不同的mRNA，因此，可以通過差示雜交篩選出與腫瘤相關(guān)的基因。也可利用誘導(dǎo)的方法，篩選出誘導(dǎo)表達(dá)的基因。3分別寫出6種以上RNA的功能轉(zhuǎn)運(yùn)RNA tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸 核蛋白體RNA rRNA 核蛋白體組成成 信使RNA mRNA 蛋白質(zhì)合成模板 不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前體 小核RNA snRNA 參與hnRNA的剪接 小胞漿RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組成成分 反義RNA anRNA/micRNA 對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用 核 酶 Riboz

7、yme RNA 有酶活性的RNA4以你將要開展的分子生物學(xué)研究為例，如何撰寫開題報(bào)告？5舉出分子生物學(xué)研究中常用的工具酶及良好載體的條件工具酶連接酶：DNA連接酶：T4DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶RNA連接酶聚合酶：DNA聚合酶：1、 依賴于DNA的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶 、Klenovo酶、T4 DNA聚合酶、天然的T7 DNA聚合酶、經(jīng)修飾的T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶2、 不依賴于DNA的DNA聚合酶（末端轉(zhuǎn)移酶）3、 依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）RNA聚合酶：依賴于DNA的RNA聚合酶、不依賴于DNA的RNA聚合酶（Poly（A）聚合酶）激酶、磷

8、酸酶：堿性磷酸酶、T4多核苷酸激酶核酸酶：核酸外切酶：1、 單鏈53和35核酸外切酶（exo）2、 雙鏈53末端外切酶：噬菌體核酸外切酶、T7基因6核酸外切酶3、 雙鏈35核酸外切酶（exo）核酸內(nèi)切酶：Bal 31核酸酶、核酸酶S1、綠豆核酸酶、微球菌核酸酶脫氧核糖核酸酶（DNase I）核糖核酸酶（RNase）：核糖核酸酶A（RNaseA）、核糖核酸酶H（RNaseH）、核糖核酸T1（RNaseT1）其他常用酶：DNa甲基化酶DNA結(jié)合蛋白：單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）、RecA蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶I良好載體的條件：4、寫出至少6種以上RNA的功能？RNA的分類細(xì)胞核和胞液線粒體功能核蛋白體RN

9、ArRNAmt tRNA核蛋白體組成成分信使RNAmRNAmt mRNA蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運(yùn)RNAtRNAmt tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前體小核RNAsnRNA參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)小胞漿RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組成成分注：原核細(xì)胞不含后3種RNA5、 分子生物學(xué)研究中常用的工具酶及良好載體的條件？答：（1）、常用的工具酶1、 限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA 分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。2、 DNA 連接酶：將兩段DNA 分子拼接起來的酶。3、 DNA 聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。4、

10、逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA 的DNA 聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA 成為DNA 的酶，產(chǎn)物DNA 又稱互補(bǔ)DNA。5、 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA 的3 末端。6、 堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA 等的5 磷酸基團(tuán)。7、 依賴DNA 的RNA 聚合酶：識(shí)別特異性啟動(dòng)子，RNA 轉(zhuǎn)錄。（2）、良好載體的條件1、必須有自身的復(fù)制子；2、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA 插入；3、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞；6、對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相

11、適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA 調(diào)控元件。病毒、真核和原核生物的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1. 病毒基因組所含核酸類型不同2. 不同病毒基因組大小相差較大3. 病毒基因組可以是連續(xù)的也可以是不連續(xù)的4. 病毒基因組的編碼序列大5. 基因可以是連續(xù)的也可以是間斷的6. 病毒基因組都是單倍體和單拷貝7. 基因重疊8. 病毒基因組功能單位或轉(zhuǎn)錄單位9. 病毒基因組含有不規(guī)則結(jié)構(gòu)基因（1） 幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)無間隔（2） 結(jié)構(gòu)基因本身沒有翻譯起始序列（3） mRNA沒有 5端的帽結(jié)構(gòu) 原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1. 細(xì)菌等原核生物的基因組是一條雙鏈閉環(huán)的DNA分子2. 具有操

12、縱子結(jié)構(gòu)3. 原核基因組中只有1個(gè)復(fù)制起點(diǎn)4. 結(jié)構(gòu)基因無重疊現(xiàn)象5. 基因序列是連續(xù)的，無內(nèi)含子，因此轉(zhuǎn)錄后不需要剪切6. 編碼區(qū)在基因組中所占的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真核基因組，但又遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于病毒基因組。非編碼區(qū)主要是一些調(diào)控序列7. 基因組中重復(fù)序列很少8. 具有編碼同工酶的基因9. 細(xì)菌基因組中存在著可移動(dòng)的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子10. 在DNA分子中具有多種功能的識(shí)別區(qū)域，如復(fù)制起始區(qū)、復(fù)制終止區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)和終止區(qū)等。這些區(qū)域往往具有特殊的序列，并且含有反向重復(fù)序列 真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1） 真核基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組。2） 真核基因具有許多復(fù)制起點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制子大小不一。

13、每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目，除了配子為單倍體外，體細(xì)胞一般為雙倍體，即含兩份同源的基因組。3） 真核基因都出一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的單順反子，即一分子mRNA只能翻譯成一種蛋白質(zhì)。4） 真核生物基因組中含有大量重復(fù)順序。5） 真核生物基因組內(nèi)非編碼的順序（NCS）占90%以上。編碼序列占5%。6） 真核基因產(chǎn)斷列基因，即編碼序列被非編碼序列分隔開來，基因與基因內(nèi)非編碼序列為間隔DNA，基因內(nèi)非編碼序列為內(nèi)含子，被內(nèi)含子隔開的編碼序列則為外顯子。7） 真核生物基因組功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，它們可串聯(lián)在一起，亦可相距很遠(yuǎn)，但即使串聯(lián)在一起成族的基因也是分別轉(zhuǎn)錄的。

14、8） 真核生物基因組中也存在一些可移動(dòng)的遺傳因素，這些DNA順序并無明顯生物學(xué)功能，似科為自己的目的而級(jí)織，故有自私DNA之稱，其移動(dòng)多被RNA介導(dǎo)，也有被DNA介導(dǎo)的。一、 名詞解釋1、基因：能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 RNA 的DNA 序列，是決定遺傳性狀的功能單位。2、基因組：細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。3、端粒：以線性染色體形式存在的真核基因組 DNA 末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒。該結(jié)構(gòu)是一段DNA 序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，僅在真核細(xì)胞染色體末端存在。4、操縱子：是指數(shù)個(gè)功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動(dòng)子和操縱基因）以及下游

15、的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所構(gòu)成的基因表達(dá)單位，所轉(zhuǎn)錄的RNA 為多順反子。5順式作用元件：是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的特異DNA 序列。包括啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件等。6、反式作用因子：是指真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。7、啟動(dòng)子：是 RNA 聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA 序列。8、增強(qiáng)子：位于真核基因中遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，能明顯增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率的特殊 DNA 序列。它可位于被增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄基因的上游或下游，也可相距靶基因較遠(yuǎn)。9、基因表達(dá)：是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)

16、過轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過程。10信息分子:調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)。其中由細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞間信息分子；而在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息調(diào)控信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞內(nèi)信息分子。11、受體：是存在于靶細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合，進(jìn)而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的的特殊蛋白質(zhì)。12、分子克?。涸隗w外對(duì)DNA 分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入合適宿主，使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA 分子的大量拷貝。13、蛋白激酶：是指能夠?qū)⒘姿峒瘓F(tuán)從磷酸供體分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白的氨基酸受體上的一大類酶。14

17、、蛋白磷酸酶：是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同構(gòu)成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開關(guān)系統(tǒng)。15、基因工程：有目的的通過分子克隆技術(shù)，人為的操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程。16、載體：能在連接酶的作用下和外源 DNA 片段連接并運(yùn)送DNA 分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA 分子。17、轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒 DNA 或以它為載體構(gòu)建的重組DNA 導(dǎo)入細(xì)菌的過程。18、感染：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA 分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。19、轉(zhuǎn)導(dǎo)：指以噬菌體為載

18、體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA 的過程，有時(shí)也指在真核細(xì)胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞DNA 的過程。20、轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。21、DNA 變性：在物理或化學(xué)因素的作用下，導(dǎo)致兩條DNA 鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共價(jià)鍵則不受影響。22、DNA 復(fù)性：當(dāng)促使變性的因素解除后，兩條DNA 鏈又可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)。23、退火：指將溫度降至引物的 TM 值左右或以下，引物與DNA 摸板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雜交鏈。24、筑巢 PCR：先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為摸板擴(kuò)增獲取目的基因?？梢蕴岣逷CR

19、的效率和特異性。25、原位 PCR：以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的DNA 或RNA 作為靶序列，進(jìn)行PCR 反應(yīng)的過程。26、定量 PCR：基因表達(dá)涉及的轉(zhuǎn)錄水平的研究常需要對(duì)mRNA 進(jìn)行定量測(cè)定，對(duì)此采用的PCR 技術(shù)就叫定量PCR。27、基因打靶：是指通過DNA 定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。28、DNA 芯片：DNA 芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的DNA 探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可獲得樣品的遺傳信息。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA

20、芯片。29、錯(cuò)義突變:DNA 分子中堿基對(duì)的取代，使得mRNA 的某一密碼子發(fā)生變化，由它所編碼的氨基酸就變成另一種的氨基酸，使得多肽鏈中的氨基酸順序也相應(yīng)的發(fā)生改變的突變。30、無義突變：由于堿基對(duì)的取代，使原來可以翻譯某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子的突變。31、同義突變：堿基對(duì)的取代并不都是引起錯(cuò)義突變和翻譯終止，有時(shí)雖然有堿基被取代，但在蛋白質(zhì)水平上沒有引起變化，氨基酸沒有被取代，這是因?yàn)橥蛔兒蟮拿艽a子和原來的密碼子代表同一個(gè)氨基酸的突變。32、移碼突變：在編碼序列中，單個(gè)堿基、數(shù)個(gè)堿基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突變位點(diǎn)之后的三聯(lián)體密碼閱讀框發(fā)生改變，不能編碼原來的蛋

21、白質(zhì)的突變。33、癌基因：是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性。當(dāng)癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生異常時(shí)，其產(chǎn)物可使細(xì)胞無限制增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。包括病毒癌基因和細(xì)胞癌基因。34、細(xì)胞癌基因：存在于正常的細(xì)胞基因組中，與病毒癌基因有同源序列，具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長、增殖、分化和發(fā)育等生理功能。在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的細(xì)胞癌基因叫原癌基因，當(dāng)其受到某些條件激活時(shí)，結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常，能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。35、病毒癌基因：存在于病毒（大多是逆轉(zhuǎn)錄病毒）基因組中能使靶細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因。它不編碼病毒結(jié)構(gòu)成分，對(duì)病毒無復(fù)制作用，但是當(dāng)受到外界的條件激活時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。36、基

22、因診斷：以 DNA 或RNA 為診斷材料，通過檢查基因的存在、結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體的狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。37、 RFLP：即限制性片段長度多態(tài)性，個(gè)體之間DNA 的核苷酸序列存在差異，稱為DNA 多態(tài)性。若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)則可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化，稱為RFLP。38、基因治療：一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞，以最終達(dá)到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的治療方法。39、反義 RNA：堿基序列正好與有意義的mRNA 互補(bǔ)的RNA 稱為反義RNA?？梢宰鳛橐环N調(diào)控特定基因表達(dá)的手段。40、核酶：是一種可以催化RNA 切割和RNA 剪接反

23、應(yīng)的由RNA 組成的酶，可以作為基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑。41、三鏈 DNA：當(dāng)某一DNA 或RNA 寡核苷酸與DNA 高嘌呤區(qū)可結(jié)合形成三鏈，能特異地結(jié)合在DNA 的大溝中，并與富含嘌呤鏈上的堿基形成氫鍵。42、SSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)是一種基于DNA 構(gòu)象差別來檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。相同長度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。43、管家基因：在生物體生命的全過程都是必須的，且在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因。44、細(xì)胞全能性：指同一種生物的所有細(xì)胞都含有相同的DNA，即基因的數(shù)目和種類是一樣的，但在不同階段，同一個(gè)體的不同組織和器官中

24、基因表達(dá)的種類和數(shù)目是不同的。45、SD 序列：轉(zhuǎn)錄出的mRNA 要進(jìn)入核糖體上進(jìn)行翻譯，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列與大腸桿菌16S rRNA3，末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體的識(shí)別位點(diǎn)。46、反義核酸技術(shù)：是通過合成一種短鏈且與DNA 或RNA 互補(bǔ)的，以DNA 或RNA 為目標(biāo)抑制翻譯的反義分子，干擾目的基因的轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過程的技術(shù)。47、核酸探針：探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用，并在相互作用之后可以檢測(cè)出來的生物大分子。核酸探針是指能識(shí)別特異堿基順序的帶有標(biāo)記的一段DNA 或RNA 分子。48、周期蛋白：是一類呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá)、累積與分解的蛋白質(zhì)，它

25、與周期素依賴性激酶共同影響細(xì)胞周期的運(yùn)行。49、 CAP：是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號(hào)傳遞個(gè)許多操縱子，使細(xì)菌在缺乏葡萄糖時(shí)可以利用其他碳源。二、 問答題（一）、病毒、原核、真核基因組的特點(diǎn)？答：1、病毒基因組的特點(diǎn)： 種類單一；單倍體基因組：每個(gè)基因組在病毒中只出現(xiàn)一次；形式多樣；大小不一；基因重疊；動(dòng)物/細(xì)菌病毒與真核/原核基因相似：內(nèi)含子；具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因；基因編碼區(qū)無間隔：通過宿主及病毒本身酶切；無帽狀結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)基因沒有翻譯起始序列。2、原核基因組的特點(diǎn)：為一條環(huán)狀雙鏈DNA；只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；具有操縱子結(jié)構(gòu)；絕大部分為單拷貝；可表達(dá)基因約50%，大

26、于真核生物小于病毒；基因一般是連續(xù)的，無內(nèi)含子；重復(fù)序列很少。3、真核基因組的特點(diǎn)：真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；基因組DNA 與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)；真核基因?yàn)閱雾樂醋?，而?xì)菌和病毒的結(jié)構(gòu)基因多為多順反子；基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)；真核基因多為不連續(xù)的斷裂基因，由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌而成；存在大量的重復(fù)序列；功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族；存在可移動(dòng)的遺傳因素；體細(xì)胞為雙倍體，而精子和卵子為單倍體。（二）、乳糖操縱子的作用機(jī)制？答：1、乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A 三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷

27、乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O，一個(gè)啟動(dòng)子P 和一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。2、阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時(shí)，I 基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí)，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。3、CAP 的正性調(diào)節(jié)：在啟動(dòng)子上游有CAP 結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí)，cAMP 濃度升高，與CAP 結(jié)合，使CAP 發(fā)生變構(gòu)，CAP 結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近的CAP 結(jié)合位點(diǎn)，激活RNA 聚合

28、酶活性，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I 基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP 的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。（三）、真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制？答：真核生物在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是通過反式作用因子、順式作用元件和RNA 聚合酶的相互作用來完成的，主要是反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程。1、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成：真核生物 RNA 聚合酶識(shí)別的是由通用轉(zhuǎn)錄因子與DNA 形成的蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物，只有當(dāng)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA 上，形成有功能的啟動(dòng)子，

29、才能被RNA 聚合酶所識(shí)別并結(jié)合。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程為：TFD 結(jié)合TATA 盒；RNA 聚合酶識(shí)別并結(jié)合TFD-DNA 復(fù)合物形成一個(gè)閉合的復(fù)合物；其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA 聚合酶結(jié)合形成一個(gè)開放復(fù)合物。在這個(gè)過程中，反式作用因子的作用是：促進(jìn)或抑制TFD 與TATA 盒結(jié)合；促進(jìn)或抑制RNA 聚合酶與TFD-DNA 復(fù)合物的結(jié)合；促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。2、反式作用因子：一般具有三個(gè)功能域（DNA 識(shí)別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域和結(jié)合其他蛋白結(jié)合域）；能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件；對(duì)基因的表達(dá)有正性或負(fù)性調(diào)控作用。3、轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控：反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達(dá)式調(diào)節(jié)反式作用因

30、子合成出來就具有活性；共價(jià)修飾磷酸化和去磷酸化，糖基化；配體結(jié)合許多激素受體是反式作用因子；蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的解離與形成。反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合：反式作用因子被激活后，即可識(shí)別并結(jié)合上游啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子中的保守性序列，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用。反式作用因子的作用方式成環(huán)、扭曲、滑動(dòng)、Oozing。反式作用因子的組合式調(diào)控作用：每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，但反式作用因子對(duì)基因調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用。（四）、真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制？答：（1）、5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義：5，端

31、加帽和3，端多聚腺苷酸化是保持mRNA 穩(wěn)定的一個(gè)重要因素，它至少保證mRNA 在轉(zhuǎn)錄過程中不被降解。（2）、mRNA 選擇性剪接對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的作用（3）、mRNA 運(yùn)輸?shù)目刂疲ㄎ澹?、受體的特點(diǎn)？答：1、高度專一性；2、高度親和性；3、可逆性；4、可飽和性；5、特定的作用模式（六）、表皮生長因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑？答：表皮生長因子受體是一個(gè)典型的蛋白酪氨酸激酶受體，這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要步驟是： 1、 受體二聚化的形成及其磷酸化：表皮生長因子與受體的結(jié)合使受體發(fā)生二聚化，從而改變受體構(gòu)象，使蛋白酪氨酸激酶活性增強(qiáng)，受體自身的幾個(gè)蛋白酪氨酸殘基在激酶的作用下發(fā)生磷酸化。2、 募集接頭蛋白Grb

32、2：表皮生長因子受體自身被磷酸化后，不僅其激酶活性增強(qiáng)，而且其構(gòu)象發(fā)生變化，從而適合與含SH2 結(jié)構(gòu)域的蛋白分子相結(jié)合。Grb2 是作為接頭蛋白結(jié)合到受體上。3、 調(diào)控分子SOS 的活化：SOS 含有可與SH3 結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的富含脯氨酸基序，當(dāng)Grb2結(jié)合到磷酸化的表皮生長因子受體后，它的兩個(gè)SH3 結(jié)構(gòu)域即可結(jié)合SOS，使之活化。4、 低分子量G 蛋白R(shí)as 的活化：SOS 可促進(jìn)Ras 釋放GDP，結(jié)合GTP 的反應(yīng)，使Ras 激活?；罨腞as 作用其下游分子Raf，使之活化。Raf 是MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一個(gè)分子，由此啟動(dòng)了MAPK 的三級(jí)激活過程。5、 MAPK 的級(jí)聯(lián)激活：Raf

33、 是一種MAPKKK，它作用于MEK，使之磷酸化而激活，活化的MEK在作用于MAPK 家族的ERK1，使之磷酸化激活由此完成了三級(jí)激活。6、 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用：活化的ERK 可以轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，使某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生磷酸化，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。（七）、cAMP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？答：1、組成：胞外信息分子（主要是胰高血糖素、腎上腺素和促腎上腺皮質(zhì)激素），受體，G 蛋白，AC，cAMP , PKA。2、途徑：? 信號(hào)分子與受體結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化? 受體活化G 蛋白? 活化后的G 蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）? AC 催化ATP 生成cAMP? cAMP 活化PKA，PKA 使目標(biāo)蛋白

34、磷酸化，調(diào)節(jié)代謝酶的活性或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)（八）、IP3-Ca2+信號(hào)途徑：? 信號(hào)分子與受體結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化? 受體活化G 蛋白? 活化后的G 蛋白激活PLC? PLC 水解PIP2 生成IP3 和DG? IP3 使鈣通道打開，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高? Ca2+與CaM 結(jié)合，激活Ca2+-CaM 依賴的蛋白激酶? Ca2+-CaM 依賴的蛋白激酶使目標(biāo)蛋白磷酸化。（九）、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？答：（1）、常用的工具酶1、 限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA 分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。2、 DNA 連接酶：將兩段DNA 分子拼接起來的酶。3、

35、DNA 聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。4、 逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA 的DNA 聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA 成為DNA 的酶，產(chǎn)物DNA 又稱互補(bǔ)DNA。5、 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA 的3 末端。6、 堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA 等的5 磷酸基團(tuán)。7、 依賴DNA 的RNA 聚合酶：識(shí)別特異性啟動(dòng)子，RNA 轉(zhuǎn)錄。（2）、良好載體的條件1、必須有自身的復(fù)制子；2、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA 插入；3、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過特定的方法導(dǎo)入

36、細(xì)胞；6、對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA 調(diào)控元件。（十）、藍(lán)-白篩選的原理？答：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點(diǎn)的DNA 序列。這些位點(diǎn)上如果沒有克隆外源性DNA 片段，在質(zhì)粒被導(dǎo)入lac-的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_(dá)，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal 和誘導(dǎo)劑IPTG 后，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA 片段，將使lac Z 基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由于這種顏色標(biāo)

37、志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然。（十一）SANGER 雙脫氧鏈終止法的原理？答：DNA 鏈中核苷酸以3,5-磷酸二酯鍵連接，合成DNA 所用的底物是 2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP 與普通dNTP 不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?位置缺少一個(gè)羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA 鏈中，但由于沒有3羥基，不能同后續(xù)的dNTP 形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA 鏈不能繼續(xù)延伸。在DNA 合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP 中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置間的距離。

38、在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4 種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4 組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G 或T 位置。（十二）、核酸分子雜交的原理？答：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及在復(fù)性過程中個(gè)分子間鍵的形成和斷裂。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知序列。（十三）、影響雜交的因素？答：1、核酸分子的濃度和長度：核酸濃度越大，復(fù)性速度越快。探針長度應(yīng)控制在50-300個(gè)堿基對(duì)為好。2、溫度：溫度過高不利于復(fù)性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較TM

39、 值低25 度。3、離子強(qiáng)度：在低離子強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強(qiáng)度的增加，雜交反應(yīng)率增加。高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，所以進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度。4、雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的TM 值。它有以下優(yōu)點(diǎn)：在低溫下探針更穩(wěn)定；能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。5、核酸分子的復(fù)雜性：是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度。兩個(gè)不同基因組DNA 變性后的相對(duì)雜交速率取決于樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)的相對(duì)復(fù)雜性（即DNA 中的堿基數(shù)）。6、非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前應(yīng)對(duì)非特異性雜交反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少其對(duì)探針的非特異性吸附作

40、用。（十四）、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)？答：1、cDNA 探針：通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cDNA 得到大量的擴(kuò)增。提取質(zhì)粒后分離純化作為探針使用。它是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。2、基因組探針：從基因組文庫里篩選得到一個(gè)特定的基因或基因片段的克隆后，大量擴(kuò)增、純化，切取插入片段，分離純化為探針。3、寡核苷酸探針：根據(jù)已知的核酸順序，采用DNA 合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段作為探針。4、RNA 探針：采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA 或反義RNA 作為探針。（十五）、探針的標(biāo)記法？答：1、缺口平移法：此法是利用適當(dāng)濃度的DNase 在DN

41、A 雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，造成單鏈切口。切口處產(chǎn)生一個(gè)5 末端和3 末端，3 末端就可以作為引物，在大腸桿菌DNA 聚合酶的催化下，以互補(bǔ)的DNA 單鏈為摸板，依次將dNTP 連接到切口的3 末端的羥基上，合成新的DNA 單鏈；同時(shí)DNA 聚合酶的53 的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5 末端逐步切除，新合成鏈不斷延伸，從而使原DNA 分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代。2、隨機(jī)引物法：隨機(jī)引物是人工合成的長度為6 個(gè)寡核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物。對(duì)于任何一個(gè)用作探針的DNA 片段，隨機(jī)引物混合物中都會(huì)有一些六核苷酸片段可與之結(jié)合，起到DNA 合成引物的作用。將這些引物與變性的D

42、NA 單鏈結(jié)合后，以4 種dNTP（其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP）為底物，合成與探針DNA 互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的DNA 探針。3、PCR 標(biāo)記法：在PCR 反應(yīng)底物中，將一種dNTP 換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP， 這樣標(biāo)記的dNTP 就在PCR 反應(yīng)的同時(shí)摻入到新合成的DNA 鏈上。4、末端標(biāo)記法：只是將DNA 片段的一端進(jìn)行標(biāo)記。（十六）、PCR 的基本原理？答：PCR 是在試管中進(jìn)行的DNA 復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA 半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA 分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA 變成單鏈，單鏈DNA 與人工合成的

43、引物退火，然后耐熱DNA 聚合酶以dNTP 為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR 全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA 模板解鏈、引物與模板DNA 結(jié)合、DNA 聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸個(gè)步驟構(gòu)成PCR 反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA 得以迅速擴(kuò)增。DNA 模板變性：模板雙鏈DNA單鏈DNA，94。退火：引物單鏈DNA雜交鏈，引物的Tm 值。引物的延伸：溫度至70 左右， Taq DNA聚合酶以種dNTP 為原料，以目的DNA 為模板，催化以引物末端為起點(diǎn)的53DNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA 鏈。新合

44、成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA 得到高效快速擴(kuò)增。（十七）、PCR 引物設(shè)計(jì)的基本要求？答：1、引物長度一般為1530 個(gè)核苷酸。過短影響PCR 的特異性，過長會(huì)提高相應(yīng)退火溫度，使延伸溫度超過TaqDNA 聚合酶最適溫度74,影響產(chǎn)物的生成。2、引物的堿基盡可能隨機(jī)，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。3端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G 和C。否則會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對(duì)。G+C 含量一般占45 -55。3端和5端引物具有相似的Tm 值,Tm 值計(jì)算公式：Tm4(G+C)+ 2(A+T)3、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的連續(xù)互補(bǔ)序

45、列，一般不超過3bp。4、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。5、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過70，引物3末端連續(xù)8 個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6、引物3端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA 配對(duì)。引物3端最佳堿基選擇是G 和C，形成的堿基配對(duì)比較穩(wěn)定。7、引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的5端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響PCR 反應(yīng)的進(jìn)行。8、引物的5端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子等。（十八）、PCR 的反應(yīng)條件？答：1、PCR 反應(yīng)的緩

46、沖液：? Tris-HCl 緩沖液? KCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時(shí)會(huì)抑制Taq DNA 聚合酶活性。? 加入BSA 或明膠有利于保護(hù)TaqDNA 聚合酶活性。? 必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高PCR 反應(yīng)特異性。2、鎂離子濃度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA 聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+濃度過低，會(huì)顯著降低酶活性。Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg 2+濃度還會(huì)影響引物的退火、模板與PCR 產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。3、底物濃度 工作濃度20-200umol/L， dNTPs 濃度過高可加

47、快反應(yīng)速度，也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，可提高反應(yīng)的特異性。在PCR 反應(yīng)中，4 種dNTP 必須以等摩爾濃度配制，以減少PCR 反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。4、Taq DNA 聚合酶 75-80時(shí)具有最高的聚合酶活性，150 個(gè)核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95仍有活性，應(yīng)用濃度一般為1-2.5u/100ul 反應(yīng)體積。5、引物 0.1-0.5umol/L。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增、生成引物二聚體，使目的DNA 片段產(chǎn)率下降。退火溫度與引物Tm 值有關(guān)，引物Tm 值在55-80 范圍較為理想。6、反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)（十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素？答：1、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱；2、基因的劑量；3、影響RNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素：SD 序列、mRNA；4、外源基因密