蕎麥內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴(kuò)增及序列分析-四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

1、蕎麥內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的擴(kuò)增及序列分析生物科學(xué)2002級(jí) 曾子賢指導(dǎo)老師 吳 琦 副教授摘 要：本研究以野生金蕎麥、栽培苦蕎為材料，采用改進(jìn)的CTAB法提取蕎麥總DNA。設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，對(duì)三份蕎麥ITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得長(zhǎng)約700bp的單一條帶。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，野生金蕎麥1號(hào)測(cè)序片段為699bp，包含ITS區(qū)序列為660bp；野生金蕎麥2號(hào)測(cè)序片段為678bp，包含ITS序列為646bp；苦蕎測(cè)序片段為640bp，包括ITS序列為599bp。將所得到的三份蕎麥ITS區(qū)序列分別與GenBank中登錄的蕎麥ITS序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，野生金蕎麥1號(hào)與已知金蕎麥ITS區(qū)同

2、源率為90.8%，野生金蕎麥2號(hào)與已知的金蕎麥ITS區(qū)序列同源率達(dá)到91.6%。供試苦蕎與已知苦蕎ITS區(qū)同源率為99.8%。關(guān)鍵詞：野生金蕎麥；苦蕎；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列；5.8S rDNA；PCR；序列分析Amplification and Sequences analysis of Internal Transcribed Spacer of BuckwheatZENG Zi-xian Biological Science, Grade 2002 Directed by WU Qi (Associate Prof. Ph. D)Abstract：Wildness F. cymosu

3、m and cultivated F. tataricum were investigated in this article. By the improving method of CTAB DNA extraction, total DNA from three buckwheat was obtained. A pair of specific primers was designed. The ITS regions of three buckwheat were amplified. The amplified fragments, about 700bp in length, we

4、re sequenced directly. The results show that the sequencing fragments are 699bp, 678bp and 640bp in length, including ITS regions of F. cymosum and F. tataricum are 660bp, 646bp and 599bp in length. Comparing F. cymosum and F. tataricum with sequences reported, it suggests that the homology rate of

5、ITS sequence of F. cymosum, NO. 1 is 91.6% and NO. 2 is 90.8% and the homology rate of the ITS sequence of F. tararicum is 99.8%.Keywords: Wildness F. cymosum; F. tataricum; ITS sequences; 5.8S rDNA; Sequence Analysis蕎麥屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）植物。蕎麥不僅是營(yíng)養(yǎng)豐富的糧食作物，也是有較好藥用價(jià)值的藥用植物。因此開(kāi)展蕎麥屬植物的系

6、統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化研究，進(jìn)一步完善蕎麥屬植物的分類和新種、野生種的鑒定，對(duì)豐富的蕎麥遺傳資源保護(hù)和利用以及蕎麥屬植物的開(kāi)發(fā)和改良提供系統(tǒng)學(xué)資料。KweonHeo等1對(duì)蕎麥屬的野生種進(jìn)行了分類，將其劃分為3大類（表1）。 表1 蕎麥屬的分類第1類F. esculentum F. homotropicum F. esculentum. Ancestralis第2類F. cymosum F. tataricum F. tataricum. potanini第3類F. callianthumF. capillatumF. gilesiiF. gracilipesF. leptopodumF. uroph

7、yllumF. lineareF. macrocarpumF .pleioramosumF. rubifoliumF. statice近年來(lái)，分子生物學(xué)研究技術(shù)如RFLP分析、AFLP分析、SSR分析、RAPD分析、DNA序列分析為分子系統(tǒng)學(xué)的研究提供了重要的分子標(biāo)記資料。其中核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析已被廣泛的用于植物屬內(nèi)、近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育分析2。對(duì)于蕎麥種間親緣關(guān)系，國(guó)際上多從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、種間可雜交性、同功酶、cpDNA、rDNA、rbcL、accD、RAPD和ITS等方面進(jìn)行研究。植物基因組因其結(jié)構(gòu)和功能上的差異，進(jìn)化速率有所不同。核基因組(nDNA)進(jìn)化最快，約為葉

8、綠體基因組(cpDNA)的2倍，線粒體基因組(mtDNA)進(jìn)化最慢，還不到葉綠體基因組的1/33。由于cpDNA的進(jìn)化速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于nDNA，限制了其在較低分類階元（如屬、亞屬）中的應(yīng)用。因此，眾多的研究者將注意力集中到nDNA中進(jìn)化較快的DNA序列上，18S-26S核核糖體DNA（nrDNA）的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(Internal transcribed spacer）正是符合要求的序列之一。植物細(xì)胞核中，編碼rRNA的基因是一些高度重復(fù)序列組成的多基因家族，其中，編碼核糖體小亞基rRNA的18S基因與5.8S、26S基因共同構(gòu)成一轉(zhuǎn)錄單位（圖1所示）。其中，18S與5.8S、26S間的基因間

9、區(qū)分別為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）1和2。也就是說(shuō)，ITS區(qū)被5.8S分隔成ITS1和ITS2兩個(gè)區(qū)域。ITS1和ITS2的轉(zhuǎn)錄物在rRNA加工的過(guò)程中被切掉，但這兩部分在nrRNA成熟過(guò)程中具有重要作用4。18s Nuclear rDNAITS15.8s rDNAITS226s Nuclear rDNAITS Region圖 1 ITS區(qū)域結(jié)構(gòu)（仿劉金姐 2000）本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GenBank中發(fā)表的蕎麥ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比對(duì)，根據(jù)White等（1990）5所報(bào)道的4條經(jīng)典ITS序列的引物,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以三份蕎麥總DNA為模板

10、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序（包括ITS1、5.8s rDNA和ITS2），將這三份蕎麥的ITS序列與GenBank中登錄的蕎麥ITS序列進(jìn)行同源性比較和序列分析，為蕎麥的系統(tǒng)演化以及蕎麥的分類鑒定提供分子遺傳學(xué)證據(jù)。1材料與方法1.1材料三份實(shí)驗(yàn)植物中，野生金蕎麥（F. cymosum）1號(hào)采集于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)老板山，野生金蕎麥（F. cymosum）2號(hào)和苦蕎（F. tataricum）栽培種由成都高等烹飪?？萍夹g(shù)學(xué)校唐宇教授提供。1.2試劑和儀器DNA提取液(50mmol/L Tris-Cl，25mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl，1%SDS，1%PVP)，無(wú)水乙醇

11、，70%乙醇，氯仿和異戊醇（24：1），5 mol/L KAc，TE（10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，H2O），RNaseA，ddH2O，10×PCR buffer，25 mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs，Taq酶（PCR擴(kuò)增試劑均購(gòu)自上海生工），GoldView（購(gòu)自賽百盛），0.8%瓊脂糖凝膠。 Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf PCR儀，水平電泳儀，-20冰箱，制冰機(jī)，Thermo冷凍離心機(jī)，普通離心機(jī)，Unico UV-2102C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，滅菌鍋，研缽，離心管，冰盤(pán)。1.3方法1.3.1三

12、份蕎麥總DNA的提取采用在CTAB法6以及王莉花等7提取方法基礎(chǔ)上改進(jìn)的SDS微量快速提取DNA。1.3.1.1將100mg蕎麥嫩葉放入置于冰上已滅菌的研缽中，再加入300L DNA提取液充分研磨；1.3.1.2將磨細(xì)的樣品轉(zhuǎn)移到置于冰上的已滅菌的1.5mL離心管中，再向研缽中加入300L DNA提取液并轉(zhuǎn)入同一離心管中；1.3.1.3將離心管置于65水浴1小時(shí)，并不時(shí)輕輕上下顛倒離心管；1.3.1.4再加入125L 5M KAc冰浴30分鐘，再向離心管中加入400L氯仿/異戊醇（24：1），冰浴20min；1.3.1.5將樣品于4下，4000rpm離心15min，取上清液并轉(zhuǎn)入另一滅菌的離心

13、管中，并加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，上下輕輕顛倒；1.3.1.6在4下，8000rpm離心4min，而后棄上清液；1.3.1.7用70%乙醇漂洗沉淀1-2次，放入50烘箱干燥15min；1.3.1.8用50L TE溶解DNA，用含GoldenView的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)定OD260及OD280,確定DNA的純度及含量。置于-20冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.2 ITS序列引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank里已登陸的蕎麥ITS序列AB000325-AB000329，AB000339，AB000340和Yasuo Yasui等8、White等5報(bào)道的引物序列，設(shè)計(jì)、選取出一對(duì)特異引物：Primer

14、1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3Primer2: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3這對(duì)引物的擴(kuò)增區(qū)包含了ITS1、5.8S和ITS2完整區(qū)域。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。1.3.3 三份蕎麥ITS序列的PCR擴(kuò)增在趙暉等9報(bào)道的雪腐核盤(pán)菌ITS序列擴(kuò)增體系及循環(huán)程序基礎(chǔ)上，改進(jìn)反應(yīng)體系以及退火溫度和延伸時(shí)間。采用PCR總體積50L，反應(yīng)體系如下：ddH2O 38.5 L10×Buffer 5L25mmol/L MgCl2 2LdNTP mixture 1L20umol/L Primer1 1L20umol/L Primer2 1L模板DNA

15、1LTaq DNA聚合酶 0.5L（5U）總體積 50L按照上述順序分別加入，反應(yīng)循環(huán)程序：95 3min30個(gè)循環(huán) 94 30sec 52.5 1min72 55sec72 10min4 保存1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)取5L PCR產(chǎn)物與1L 6×Loading buffer混勻，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。1.3.5 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物直接送上海英駿生物技術(shù)有限公司純化和測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)選取的一對(duì)引物均位于ITS序列以外（圖2），ITS1位于18s rDNA，ITS4位于26s rDNA5。因此直接采用下游引物進(jìn)行單向測(cè)序，另一條鏈則以互補(bǔ)配對(duì)原則得出序列。

16、 圖2 ITS序列引物所在位置1.3.6 ITS序列分析將三份蕎麥rDNA的ITS序列的測(cè)序結(jié)果與已登陸的蕎麥ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比較，確定ITS1和ITS2的范圍。用生物信息學(xué)分析軟件DNASTAR 5.0對(duì)本實(shí)驗(yàn)序列及GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中蕎麥屬ITS序列進(jìn)行比對(duì)和分析。 2結(jié)果與分析2.1蕎麥總DNA的提取實(shí)驗(yàn)所提取的野生金蕎麥1號(hào)、野生金蕎麥2號(hào)和苦蕎總DNA經(jīng)Unico UV-2102C型紫外可見(jiàn)分光光度檢測(cè)，三個(gè)樣品的OD260/OD280分別為：1.9、1.8和1.8。野生金蕎麥1號(hào)DNA有明顯的RNA的污染，可

17、通過(guò)電泳圖分析，但已滿足PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA純度的要求。三份蕎麥總DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，條帶較為清晰，完整性較好，可以用于PCR反應(yīng)。15kb10Kb7.5kb5kb2.5kb1kbMarker 1 2 3 圖3 蕎麥總DNA電泳檢測(cè)1.野生金蕎麥1號(hào)；2.苦蕎；3.野生金蕎麥2號(hào)2.2三份蕎麥ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增以總DNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的引物Primer1和Primer2（圖2 所示ITS1和ITS4） PCR擴(kuò)增出野生金蕎麥1號(hào)、2號(hào)和苦蕎ITS區(qū)的特異性條帶。野生金蕎麥1號(hào)、2號(hào)擴(kuò)增片段大小約700bp左右，苦蕎擴(kuò)增片段略小于700bp與Yasuo Yas

18、ui（1998）8報(bào)道的蕎麥屬ITS區(qū)序列長(zhǎng)度相近，結(jié)果見(jiàn)圖4。4500bp3000bp2000bp1200bp800bp500bp200bpMarker 1 2 3圖4 三份蕎麥ITS區(qū)PCR擴(kuò)增圖譜1.野生金蕎麥1號(hào)；2.苦蕎；3.野生金蕎麥2號(hào)2.3三份蕎麥ITS區(qū)序列所獲得三份蕎麥ITS區(qū)序列由于測(cè)序的原因，在ITS1上游可能有14bp-26bp處未能測(cè)出，ITS區(qū)全序列下游有55bp-58bp在ITS區(qū)以外，測(cè)序結(jié)果如下。2.3.1野生金蕎麥ITS區(qū)序列*GAGAGACCCGCGTACCCGTTCTCAAACACCCCCGCGGGGCGCCTTCCCCGACCCCGGGAGAGATC

19、CCGGGAGAGGAGGAGGTGTCCCGCGGTGCCTGTGGGGCAAGCTCTCCCGAAACGCCAAGTACGGTGGGGGGACCCTTCCCGGCTCCAACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCAAGGACCACGAACAGAGCCGCGTCCCGCCCCTCCCGGGCCCCGGGAGGGGCGGATACCTCACGTCGTTTCTAACAAACAGAACGACTCTCGGCAACTGATATCTCGGCTCTCACATCAATGAAAAACGTAACTAAATGCGATACTTGGAGTGAATTGCACAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACG

20、CAAGTTGCGCCCGAGGGCTTCGGCTGAGGGGACGCCTGTCTGGGCGTCACCCATCCCGTCTCCCCCTCTCCCTCCTCCGTTCCTCGGAAGGAGGCGGGCGGCTAGGGCCCGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCGCCTCGCGGCCGACCTAAAGGCCGACCCCGTGGCCGCCAACGGCCGCTACAATTGATGGTGTACTGGACTACGCATCGCGTCGCGTCCCCGCGTGCCCCGGGAGCTCAACCCAGACAACCGGATAGCCACGGTCTTCAGAACCGATGCGACCGCACATCACACTGAACT

21、ACACGCTGATTTAAGCATATCATTAAAGCGGAAA擴(kuò)增片段為699bp，包含ITS區(qū)序列為660bp。由于測(cè)序原因序列上游可能有18bp未能測(cè)出，用*標(biāo)記；下游有57bp位于26S rDNA上。全序列包括開(kāi)端到箭頭處。2.3.2苦蕎ITS區(qū)序列*AGCAGACAGACCCGCGCACCCGTTCTCAAACACCCCTGCCGGCGGGGCGAGCTCTCCCGAAACACCAAGTACGGAGGGCGGACCCTTCCCGGCCCCAACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCAAGGACCACGAACAGAAGCGCGTCCCGCCCCTCCCGGTCCCCGGGAG

22、GGGCGGCGGCGCCGCGTCGTTTCTAAGAAACAGAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCCCGGCTGAGGGCACGCCTGTCTGGGCGTCACGCACCGCGTCGCCCCCCTCCCCCTCCTCCCTCCGCGGAAGGCGGGCGGTAAGGGGCGGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCCTCGCGCGGCCGGCCTAAACGCAGACCCC

23、GTGGCCGCGAACGGCCGCGACGATTGGTGGTGTACCGGACTACGCATCGCGTCGCGTCCCCGCGAGCCGCGGGAGCTCAACCCGTGAAACCGGAGGGCCCCGGCCCTCCGAACCGTTGCGACCCCAGATCAGACGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCATAAGCGGAA擴(kuò)增片段為640bp，包含ITS區(qū)序列為599bp。由于測(cè)序原因序列上游可能有14bp未能測(cè)出，用*標(biāo)記；下游有55bp位于26S rDNA上。全序列包括開(kāi)端到箭頭處。2.3.3野生金蕎麥2號(hào)ITS區(qū)序列*CGCGTACCCGTTCTCAACACCCCCG

24、CGGGGCACCTTCCCCGACCCTAGGAGAGGAGGAGGTGTCCCGCGATGCCGGTGGGGCGAGCTCTCGCGAAAGCCAAGTACGGTGGGCGGACCCTTCCCGGGTCCCACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCGCGGACCACGAACAGAACCGCGTCCCGAGCCTCCCGGTCCCCGGGAGGGGCGGCGACATCGCGTCGTTTCTAACAAACAGAACGACTCTCGGAAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAACAACGTAACGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGTGGAATCCCTTGAA

25、CCATCCAGTCTTTGAACGCAACTTGCACCCGAGGCCTTCGGCTAAGGCTACGCCTGTCTGGGCGTCAGGCATCGCGTCGCCCCCTCCCCCTCCTCCCTTCCTCGGAAGGATGCGGGCGGCTAGGGGCGGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCCCCCCGCGGCCGGCCTAAACGCAGACCCCGTGGCCGACAACGGGCGCGACAATTGGTGGTGTACTAGACTACGCATCGCGTCACGTCCCCGCGTGCCCCGGGAGCTCAACCCACAAAACCGGAGAGCCCCGGCCTTCCGAACCGTTGTGAC

26、ACCCGATCAGACGGCACTACCCGCTGAGTTTAACGATATCTTTAAACAGAACA擴(kuò)增片段為678bp，包含ITS區(qū)序列為646bp。由于測(cè)序原因序列上游可能有26bp未能測(cè)出，用*標(biāo)記；下游有58bp位于26S rDNA上。全序列包括開(kāi)端到箭頭處。2.4三份蕎麥ITS區(qū)序列相似性比較野生金蕎麥1號(hào)野生金蕎麥2號(hào)苦蕎圖 5 三份蕎麥ITS區(qū)序列相似性比較將序列測(cè)定的三條ITS區(qū)序列均去掉位于26S rDNA上的序列進(jìn)行比對(duì)。ITS區(qū)變化主要集中在ITS1，而5.8S rDNA和ITS2序列比較保守?？嗍wITS1序列中缺失了一段59bp（37bp-96bp）富含CG的片斷

27、。由圖5 可以看出野生金蕎麥1號(hào)和野生金蕎麥2號(hào)ITS序列之間的相似性較高，達(dá)到了86.6%，而兩份野生金蕎麥與苦蕎ITS序列之間的相似性則要低一些，但也能達(dá)到81.0-82.4%。表明，在同一蕎麥屬中不同種的蕎麥ITS序列之間存在一定的差異。2.5三份蕎麥ITS序列長(zhǎng)度及CG含量將所測(cè)三份蕎麥ITS序列與已發(fā)表的金蕎麥和苦蕎ITS序列進(jìn)行比較，確定ITS1和ITS2范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。表2 三份蕎麥ITS1、ITS2和5.8S rDNA長(zhǎng)度供試蕎麥ITS-15.8sITS-2(C+G)%野生金蕎麥1號(hào)野生金蕎麥2號(hào)苦蕎254bp232bp195bp162bp163bp160bp226bp226

28、bp230bp65.26%66.18%68.72%（注：ITS1中未包含由于測(cè)序原因可能未測(cè)出的14bp-26bp）GenBank中登錄的金蕎麥序列ITS1序列長(zhǎng)度變化較大60bp（212bp-272bp），ITS2長(zhǎng)度變化僅為4bp（221bp-225bp），5.8s rDNA序列長(zhǎng)度變化僅為3bp。野生金蕎麥1號(hào)與已知金蕎麥序列對(duì)比，ITS區(qū)序列單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為80個(gè)，其中ITS1單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為28個(gè)；ITS2單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為37個(gè)；5.8S rDNA單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為15個(gè)；缺失2個(gè)。野生金蕎麥2號(hào)與已知金蕎麥序列對(duì)比，ITS區(qū)序列單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為66個(gè)，其中ITS1

29、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為28個(gè)；ITS2單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為23個(gè)；5.8S rDNA單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為15個(gè)；缺失3個(gè)。將已知兩條苦蕎ITS序列對(duì)比，其序列完全相同，ITS1長(zhǎng)度為213bp，ITS2長(zhǎng)度為222bp，5.8S rDNA長(zhǎng)度為164bp，與實(shí)驗(yàn)所測(cè)苦蕎ITS序列相比，ITS區(qū)序列單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為33個(gè)，其中ITS1單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為10個(gè)；ITS2單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為14個(gè)；5.8S rDNA單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為9個(gè)；缺失14個(gè)。從表2可以看出兩份野生金蕎麥的ITS區(qū)序列長(zhǎng)度是相當(dāng)保守的，CG含量接近，而苦蕎與兩份野生金蕎麥的ITS區(qū)序列差異稍大一些。但是三條ITS區(qū)的5

30、.8S rDNA和ITS2長(zhǎng)度都很保守，長(zhǎng)度和堿基位點(diǎn)的變異主要在ITS1。2.6三份蕎麥ITS區(qū)的種內(nèi)相似性比較將野生金蕎麥1號(hào)、2號(hào)和苦蕎的ITS序列分別與GenBank上登錄的蕎麥ITS序列作種內(nèi)相似性的比較，結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。金蕎麥3號(hào)金蕎麥4號(hào)金蕎麥5號(hào)金蕎麥6號(hào)金蕎麥7號(hào)野生金蕎麥1號(hào)野生金蕎麥2號(hào)圖 6 野生金蕎麥1號(hào)和野生金蕎麥2號(hào)ITS區(qū)序列相似性比較（野生金蕎麥1號(hào)和野生金蕎麥2號(hào)為供試材料；金蕎麥3號(hào)-7號(hào)為GenBanBank登錄序列）野生金蕎麥1號(hào)ITS序列在種內(nèi)的相似性為70.6%-90.8%；野生金蕎麥2號(hào)ITS序列在種內(nèi)的相似性為82.6%-91.1%。結(jié)果表明

31、野生金蕎麥2號(hào)與已知的金蕎麥ITS區(qū)序列很接近，比野生金蕎麥1號(hào)與已知金蕎麥ITS區(qū)同源性高?？嗍w1號(hào)苦蕎2號(hào)實(shí)驗(yàn)苦蕎圖 7 苦麥ITS區(qū)序列相似性比較（苦蕎1號(hào)、2號(hào)為GenBank登錄序列；實(shí)驗(yàn)苦蕎為供試材料）供試苦蕎與已知苦蕎ITS區(qū)序列種內(nèi)相似性為99.0%-99.8%。表明苦蕎ITS區(qū)序列在種內(nèi)相似性很高。3討論與結(jié)論3.1蕎麥總DNA的提取本文采用了三種總DNA提取方法，均為小量DNA提取。方法一6是將與DNA提取液共同被研磨成勻漿的樣品加入一定量的氯仿，離心后取上清液用無(wú)水乙醇沉淀DNA；方法二9則是將研磨成勻漿的樣品于65水浴10min，離心之后加入氯仿/異戊醇（24：1），離

32、心后取上清用無(wú)水乙醇沉淀DNA；方法三(3.2 ITS序列PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)ITS成為系統(tǒng)和進(jìn)化等研究中重要的分子標(biāo)記，它具有兩個(gè)基礎(chǔ)：第一，作為18S和26SrDNA的組成部分，ITS在核基因組中高度重復(fù)，而且通過(guò)不等交換和基因轉(zhuǎn)換，這些重復(fù)單位間已經(jīng)發(fā)生了位點(diǎn)內(nèi)和位點(diǎn)間的同步進(jìn)化11，即不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致，這就為對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序奠定了理論基礎(chǔ)12,13。第二，DNA測(cè)序工作的難易程度與DNA片段長(zhǎng)度有密切關(guān)系，被子植物的ITS區(qū)長(zhǎng)度比較穩(wěn)定，包括5.8S rDNA在內(nèi)，總長(zhǎng)度只有565-700bp，測(cè)序方便。同時(shí)，ITS1、ITS2分別位于18S-5.8S

33、rDNA、5.8S-26S rDNA之間，而18S、5.8S、26SrDNA的序列非常保守，這樣就可以用與它們序列互補(bǔ)的通用引物對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序14。本實(shí)驗(yàn)中的上游引物（Primer1）位于18S rDNA下游，上游引物位于26S rDNA上游。因此，能夠擴(kuò)增到完全的ITS區(qū)序列。3.3蕎麥ITS序列的PCR擴(kuò)增對(duì)于PCR反應(yīng)中出現(xiàn)的非特異性條帶，通?？赡苡?個(gè)原因：1.模板DNA由于引物同源性高的非特位異性位點(diǎn)；2.退火溫度太低；3.過(guò)量的酶、引物和dNTP造成PCR反應(yīng)混亂。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的目的片斷約為700bp，Tm值分別為62和58，根據(jù)Tm=4(C+G)+2(A+T)計(jì)算，

34、一般退火溫度比理論Tm值低5。因此最初將退火溫度設(shè)定為52，72延伸1min，但擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)大于1200bp和約500bp的非特異性條帶。將退火溫度調(diào)高0.5至52.5，延伸時(shí)間相應(yīng)減少5s，擴(kuò)增得到特異性很好的單一條帶。由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性受Mg2+濃度的影響較大，因此篩選了Mg2+濃度。固定PCR反應(yīng)體系的其他條件，使Mg2+終濃度分別為0.75mmol/L、1mmol/L、1.25mmol/L和1.5mmol/L。結(jié)果表明，Mg2+終濃度為0.75mmol/L的特異擴(kuò)增條帶幾乎不可見(jiàn)；Mg2+終濃度為1mmol/L的特異擴(kuò)增條帶單一，亮度最佳；Mg2+終濃度為1.25mmol/L特

35、異擴(kuò)增條帶亮度與Mg2+終濃度1mmol/L特異擴(kuò)增條帶相當(dāng)，但是1200bp和500bp左右出現(xiàn)非特異性條帶；Mg2+終濃度為1.5mmol/L的特異擴(kuò)增條帶亮度有所減弱，而非特異條帶亮度逐漸增加。一般認(rèn)為PCR反應(yīng)的Mg2+濃度為1.5-4mmol/L之間15，由于Mg2+濃度與酶的工作效率有關(guān)，過(guò)低的Mg2+濃度大造成擴(kuò)增不出特異性的條帶；Mg2+濃度過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生非特異性條帶，甚至可能由于Mg2+與PCR混合物中DNA模板、引物和dNTP的磷酸基結(jié)合，降低了游離dNTP的濃度，從而抑制特異性擴(kuò)增16。本實(shí)驗(yàn)Mg2+的最佳工作濃度為1mmol/L。3.4蕎麥ITS序列及5.8S rDNA

36、序列的分析日本研究者于1998年對(duì)20種蕎麥屬的植物ITS區(qū)序列進(jìn)行過(guò)較為完善的分析。ITS1和ITS2的長(zhǎng)度比較保守。據(jù)統(tǒng)計(jì)，被子植物ITS1的長(zhǎng)度為187-298bp，ITS2的長(zhǎng)度為187-252bp。在目前所研究過(guò)的被子植物中，大多數(shù)類群中這兩個(gè)片段所提供的信息量相近，雖然單獨(dú)根據(jù)ITS1或ITS2均可得出重要的系統(tǒng)學(xué)結(jié)論17，但考慮到這兩個(gè)片段的長(zhǎng)度有限，各自的信息量并不充足。因此，大多數(shù)情況下都是將這兩個(gè)片段綜合起來(lái)考慮。關(guān)系密切的物種間ITS長(zhǎng)度非常接近，而序列有一定程度的變異。 被子植物核rDNA的ITS區(qū)中，5.8SrDNA的長(zhǎng)度非常保守，一般為163bp或164bp，僅在大

37、豆屬中發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度為168bp18，而且它的序列也很保守，在有些類群中根本沒(méi)有變異19。因此，5.8SrDNA提供的信息有限，在研究中可不必測(cè)該片段的序列20。但近幾年也有研究表明，高度保守的5.8SrRNA基因序列對(duì)揭示遠(yuǎn)緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系能提供一定的信息量，在研究中可將5.8S與ITS序列結(jié)合起來(lái)14。本研究將ITS1、5.8S rDNA和ITS2序列結(jié)合起來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)中野生金蕎麥和苦蕎進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究中的野生金蕎麥1號(hào)和2號(hào)ITS序列與GenBank登錄的金蕎麥序列比對(duì)，野生金蕎麥2號(hào)與已知的金蕎麥ITS區(qū)序列很接近，比野生金蕎麥1號(hào)與已知金蕎麥ITS區(qū)同源性高?？嗍w與已知苦

38、蕎ITS區(qū)序列對(duì)比，種內(nèi)相似性很高，同源率為99.8%。不同種的蕎麥在ITS區(qū)序列上存在一定的差異。由于種的不同，ITS區(qū)序列長(zhǎng)度和堿基有較大的差異，這正符合了利用ITS區(qū)序列分析對(duì)蕎麥屬的分類。在種間，ITS區(qū)序列存在的較小差異，可能由于實(shí)驗(yàn)材料采集地的不同，生活環(huán)境使蕎麥的進(jìn)化不同，同時(shí)豐富了蕎麥的遺傳多樣性。本研究由于供試材料樣本和時(shí)間限制，僅將野生金蕎麥1號(hào)、2號(hào)和苦蕎這三種蕎麥分別與已知的金蕎麥和苦蕎ITS序列進(jìn)行比對(duì)，難以構(gòu)建蕎麥屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，不足以對(duì)蕎麥屬進(jìn)行系統(tǒng)分類和遺傳評(píng)價(jià)。因此需要對(duì)更多的蕎麥屬材料進(jìn)行分子遺傳分析，這對(duì)蕎麥種質(zhì)資源的保護(hù)和利用具有重要意義。參考文獻(xiàn)1Kw

39、eon Heo, Ki Cheol Lee, Ohmi Ohnish. Pericarp Anatomy and character evolution of fagopyrumA. Seung Shi Ham Yong Soon Choi, Nam Soo Kim Cheal Ho Park. Advances in buckwheat research, Proceedings of the 8th international symposium on buckwheatC. Chunchon Korea: published by the Organization Committee o

40、f the 8th international symposium under the auspices of the International Buckwheat Research Association, 2001. 256-260.2宋葆華，陳之端，旺小全，李法曾. 中國(guó)莧屬nrDNA的ITS序列分析及其系統(tǒng)學(xué)意義J. 植物學(xué)報(bào)，2000，42（11）：1184-11893 Wolfe K H, Li W-H, Sharp P M. Rates of nucleotide substitution Vary greatly among plant mitochondrial, chlo

41、roplast, and nuclear DNAsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:9054-9058.4Baldwin B G, Sanderson M J, Porter J M, et al.,. The ITS region of nuclear ribosomal DNA：A val able source of evidence on angiosperm phylogenyJ. Ann Missouri Bot Gand, 1995, 82：247-27.5White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor

42、, J.(1990) Amplification and direct sequencing of Fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Amplifications (eds.:M.Innis, D.Gelfamd, J.Sninsky, and T.White), pp. 315-322. Academic Press, San Diego, CA.6Rogers S.O. and Bendich A.J. Extraction of DNA from

43、milligram amount of fresh, herbarium and mummified plant tissuesJ. Plant Mol. Biol., 1985(5):69-767王莉花，殷富有，劉繼梅，葉昌榮. 利用RAPD分析云南野生蕎麥資源的多樣性和親緣關(guān)系J. 蕎麥動(dòng)態(tài)，2004（2）：7-158Yasuo Yasui and Ohmi Ohnishi. Phylogenetic relationships among Fagopyrum species revealed by the nucleotide sequences of the ITS region of

44、 the nuclear rRNA geneJ. Genes Genet. Syst, 1998(73):201-2109趙暉，李國(guó)慶，郭堅(jiān)，陳建軍，羅志萍，王振華. 雪腐核盤(pán)菌的ITS序列分析J. 化學(xué)與生物工程，2005（12）：23-2510生物化學(xué)研究室. 高級(jí)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命理學(xué)院，2005，p：1-211Elder J R, Turner B J. Concerted evolution of repetitive DNA sequence in eukaryotesJ. Quart Rev Biol, 1995, 70:297-319.12Ainounce M L, Bayer R. On the origins of the