細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

1、第三章第三章 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察技術(shù)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察技術(shù)一、活體細胞的觀察和攝影技術(shù)一、活體細胞的觀察和攝影技術(shù)1.倒置顯微鏡倒置顯微鏡：p60圖圖3-3（提問光鏡使用注意）（提問光鏡使用注意） 適用適用：觀察貼壁生長的培養(yǎng)中細胞：觀察貼壁生長的培養(yǎng)中細胞 構(gòu)造特點構(gòu)造特點：因物鏡置于觀察標本下方而得名：因物鏡置于觀察標本下方而得名 技巧技巧：調(diào)弱光亮度，集光器稍遠些，：調(diào)弱光亮度，集光器稍遠些， 增大光線反差，對正光軸；增大光線反差，對正光軸； 攝影時，使觀察物稍偏遠離焦點，照片攝影時，使觀察物稍偏遠離焦點，照片 會更清晰。會更清晰。 底片選用正片，反差大底片選用正片，反差大2.相差顯微鏡相差

2、顯微鏡 p62圖圖3-4 適用適用：可增強活細胞同背底反差，幫助看清：可增強活細胞同背底反差，幫助看清 細胞的輪廓和細胞內(nèi)細微結(jié)構(gòu)，如：細胞的輪廓和細胞內(nèi)細微結(jié)構(gòu)，如： 核仁、染色質(zhì)、線粒體等。核仁、染色質(zhì)、線粒體等。 構(gòu)造特點構(gòu)造特點：有兩個附加構(gòu)件：有兩個附加構(gòu)件： 相差接物鏡：其光學(xué)系統(tǒng)中有一個光環(huán)透鏡相差接物鏡：其光學(xué)系統(tǒng)中有一個光環(huán)透鏡 相差聚光器：內(nèi)有數(shù)個相位板，使用時與物相差聚光器：內(nèi)有數(shù)個相位板，使用時與物 鏡倍數(shù)一致鏡倍數(shù)一致 技巧技巧：細胞培養(yǎng)瓶質(zhì)地均勻透明較好，最好用塑：細胞培養(yǎng)瓶質(zhì)地均勻透明較好，最好用塑 料瓶；觀察攝影時，瓶壁要擦凈；光軸對料瓶；觀察攝影時，瓶壁要擦凈

3、；光軸對 正，照明度適宜，摸索試調(diào)至最佳正，照明度適宜，摸索試調(diào)至最佳3.熒光顯微鏡熒光顯微鏡 p67圖圖3-6 適用適用：觀察細胞內(nèi)天然的熒光物質(zhì)，如維生：觀察細胞內(nèi)天然的熒光物質(zhì)，如維生 素、脂褐素、核黃素等，也可觀察可與素、脂褐素、核黃素等，也可觀察可與 熒光染料結(jié)合的細胞組分。熒光染料結(jié)合的細胞組分。 構(gòu)造特點構(gòu)造特點：與普通光鏡比，區(qū)別在于用高壓汞燈光：與普通光鏡比，區(qū)別在于用高壓汞燈光源，波長可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；濾光片不同。源，波長可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；濾光片不同。 技巧技巧：觀察必須是自發(fā)熒光或經(jīng)熒光染色的標本；：觀察必須是自發(fā)熒光或經(jīng)熒光染色的標本；選用效果最好的濾光片；

4、熒光標本易褪色，不能長選用效果最好的濾光片；熒光標本易褪色，不能長期保存，觀察操作要迅速，作好記錄；儀器的高壓期保存，觀察操作要迅速，作好記錄；儀器的高壓汞燈光源啟動后汞燈光源啟動后15分鐘內(nèi)不得關(guān)閉，關(guān)閉后，燈冷分鐘內(nèi)不得關(guān)閉，關(guān)閉后，燈冷卻后方可再起動，否則壽命大減，長時間觀察標本卻后方可再起動，否則壽命大減，長時間觀察標本時，需帶護目鏡。時，需帶護目鏡。 4.暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡 p64圖圖3-5 適用適用：觀察記錄活細胞或細胞器的運動軌跡，：觀察記錄活細胞或細胞器的運動軌跡， 提高分辨率提高分辨率 構(gòu)造特點構(gòu)造特點：只有聚光器不同于普通顯微鏡，設(shè)：只有聚光器不同于普通顯微鏡，設(shè) 有

5、一個中央遮光板使照明光線不能直射。有一個中央遮光板使照明光線不能直射。 標本進入目鏡，只許標本散射光進入目標本進入目鏡，只許標本散射光進入目 鏡鏡 技巧技巧：物鏡的數(shù)值孔徑必小于聚光器的數(shù)值孔：物鏡的數(shù)值孔徑必小于聚光器的數(shù)值孔 徑；蓋玻片，載玻片應(yīng)清潔無痕；聚光徑；蓋玻片，載玻片應(yīng)清潔無痕；聚光 鏡和載玻片之間加香柏油，保證效果。鏡和載玻片之間加香柏油，保證效果。二.顯微攝影技術(shù) p68n1.概念：顯微攝影術(shù)是利用顯微攝影裝置拍攝n 顯微鏡視野的物象的技術(shù)。n2.技術(shù)類型：膠片相機攝像n 數(shù)碼相機攝像n ccd圖像采集n 三者前期操作一致，但成像和圖像存儲n原理不同。n3.圖像記錄原理：n

6、膠片相機攝像：顯微攝影時，光線自標本n片的微小物件射入物鏡后，造成一個倒立的放大實像，經(jīng)目鏡進一步放大后，投射在照相底片上，使底片感光而記錄下顯微鏡視野下物象。n 數(shù)碼相機攝像：是以數(shù)字的形式用電子設(shè)備儲存圖像。拍照后，可通過數(shù)據(jù)線將所拍攝圖像傳輸?shù)诫娔X，也可將相機的存儲卡取出，通過讀卡器將拍攝的圖像傳輸?shù)诫娔X上。n 數(shù)碼相機攝像原理與ccd圖像采集器相同。n ccd圖像傳感器：即ccd(charge copledndevice, 感光耦合組件）n ccd的組成結(jié)構(gòu)有三個層次：n 上層：聚光鏡片（增光鏡片）n 中層：一個類似馬賽克的網(wǎng)絡(luò)（分色網(wǎng)絡(luò)）n 下層：墊在下層的電子線路矩陣（感應(yīng)線路n

7、是可記錄光線變化的半導(dǎo)體）n ccd工作方式之一：n 當(dāng)數(shù)碼相機的快門開啟，來自影像的光線穿過，這些馬賽克會讓感光點的=氧化硅材料釋放出電子（正電）與電洞（負電）。經(jīng)由外部加入電壓，這些電子和電洞會被轉(zhuǎn)移到不同極性的另一個硅區(qū)暫存。電子數(shù)的多寡和曝光點所接受的光量成正比。在一個影像最明亮部位，可有十萬電子被積存起來。ccd image sensor外形外形彩色彩色ccd的組成結(jié)構(gòu)分圖的組成結(jié)構(gòu)分圖nccd 的三層結(jié)構(gòu)：上：增光鏡片、中：色塊網(wǎng)格 下：感應(yīng)線路 n由微型鏡頭、馬賽克分色網(wǎng)格，及墊于最底層的電子線路矩陣所組成 n4.拍攝技術(shù)步驟：n 膠片相機拍攝：p69-74(生物教研室李相偉）n

8、 數(shù)碼相機拍攝：p74-75(同上）n ccd圖像采集： （病理教研室姚海濤n （實驗中心劉君星）5.縮時顯微攝影術(shù)縮時顯微攝影術(shù) 適用適用：記錄細胞或細胞器連續(xù)動態(tài)變化過程：記錄細胞或細胞器連續(xù)動態(tài)變化過程 正常時態(tài)連續(xù)拍照正常時態(tài)連續(xù)拍照 縮時逐格拍照縮時逐格拍照n主要裝備主要裝備：倒置顯微鏡，：倒置顯微鏡，16mm攝影機，自控攝影機，自控 縮時啟動拍攝裝置。縮時啟動拍攝裝置。n原理：原理：縮時間隔時間：縮時間隔時間：目標物實際活動時間目標物實際活動時間 x 1/24 影片排成后要求放鏡時間影片排成后要求放鏡時間 =3600秒秒 10秒秒 x 124=15秒秒 所以，每隔所以，每隔15秒攝

9、取秒攝取1張照片。張照片。三、光鏡下的固定細胞觀察法（組胚，病理）三、光鏡下的固定細胞觀察法（組胚，病理） 細胞器培養(yǎng)皿內(nèi)鋪蓋片單層培養(yǎng)細胞器培養(yǎng)皿內(nèi)鋪蓋片單層培養(yǎng) 取蓋片取蓋片細胞懸液細胞懸液 離心沉淀離心沉淀 涂片涂片 固定固定染色染色 觀察觀察 拍照拍照 （固定劑，染色劑知識介紹）（固定劑，染色劑知識介紹）固定劑的作用：穿透，固定，保形，防腐固定劑的作用：穿透，固定，保形，防腐固定劑的選擇：固定劑的選擇：p83n細胞內(nèi)組分的差異染色。n染色劑的選擇：ngiemsa染色體桃紅色。 本書p84nfeulgendna紫紅色，細胞質(zhì)綠色。鄂p141n吖啶橙rna紅色，dna亮綠色。本書p86n蘇

10、木精-伊紅（he)細胞核藍色，細胞質(zhì)紅色n 本書p85n過碘酸席夫細胞內(nèi)含糖原區(qū)紫紅色。章p58n蘇丹紅iii細胞內(nèi)含脂肪區(qū)橘紅色。章p59n鬼筆環(huán)肽溦絲染色。章p59n免疫熒光法溦管染色。章p60n聯(lián)苯胺+h2o2過氧化氫體染色。小章p37n詹納斯綠b活體細胞線粒體。小章p43n 四、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)（實驗中心）四、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)（實驗中心）1.概念和原理概念和原理 p76 laster scanning confocal microscope lscm激光共聚焦顯微鏡是激光共聚焦顯微鏡是20世紀世紀80年代以來發(fā)展起來的年代以來發(fā)展起來的一項細胞生物學(xué)和高分子材料科學(xué)領(lǐng)域

11、的高科技分一項細胞生物學(xué)和高分子材料科學(xué)領(lǐng)域的高科技分析儀器。析儀器。 其在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，利用激光作其在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，利用激光作為光源，經(jīng)照明針孔可形成點光源照射熒光樣品，為光源，經(jīng)照明針孔可形成點光源照射熒光樣品，所產(chǎn)生的激發(fā)光斑被探測器針孔以共軛的形式接收所產(chǎn)生的激發(fā)光斑被探測器針孔以共軛的形式接收于同一焦平面上，可通過計算機控制顯微鏡移動，于同一焦平面上，可通過計算機控制顯微鏡移動，以實現(xiàn)在同一焦平面（以實現(xiàn)在同一焦平面（x-y)上的逐點掃描。計算機上的逐點掃描。計算機以像點的方式在計算機屏幕上形成圖像。以像點的方式在計算機屏幕上形成圖像。 同時，也可沿同時，也可沿z軸方

12、向逐漸改變焦平面，完軸方向逐漸改變焦平面，完成對樣品厚片不同層面的掃描，進行類似成對樣品厚片不同層面的掃描，進行類似ct斷斷層掃描的無損傷連續(xù)光學(xué)切片，經(jīng)計算機三維重層掃描的無損傷連續(xù)光學(xué)切片，經(jīng)計算機三維重建處理，可形成觀察標本的三維結(jié)構(gòu)圖形。建處理，可形成觀察標本的三維結(jié)構(gòu)圖形。2.lscm的主要組成部分及工作原理的主要組成部分及工作原理激光光源激光光源:氫離子激光氫離子激光,能同時能同時 / 順序順序 / 分別輸出紫分別輸出紫外光和可見光外光和可見光照明針孔照明針孔:使激光通過照明針孔后形成點光源使激光通過照明針孔后形成點光源,點光源具有方向性強點光源具有方向性強,發(fā)散小、亮度高等優(yōu)點發(fā)

13、散小、亮度高等優(yōu)點光束分離器：可將樣品經(jīng)點光源照射所激發(fā)的光束分離器：可將樣品經(jīng)點光源照射所激發(fā)的熒光與其它非信號光線分開，排除非信號光線熒光與其它非信號光線分開，排除非信號光線干擾，提高分辨率和清晰度。干擾，提高分辨率和清晰度。物鏡物鏡焦平面：激光點光源照射標本樣品，激發(fā)樣品焦平面：激光點光源照射標本樣品，激發(fā)樣品發(fā)射熒光，形成焦點光斑，在焦平面處聚焦成發(fā)射熒光，形成焦點光斑，在焦平面處聚焦成像。像。探測器針孔：起到空間濾波器作用。阻斷非聚焦探測器針孔：起到空間濾波器作用。阻斷非聚焦平面散色光和焦平面上非焦點光斑散色光。保證平面散色光和焦平面上非焦點光斑散色光。保證樣品所衍射的聚焦光斑和探測

14、器針孔的成像光斑，樣品所衍射的聚焦光斑和探測器針孔的成像光斑，包含相同信息。（兩點共扼聚焦）包含相同信息。（兩點共扼聚焦）光電倍增器：接受通過探測器針孔的光信號，轉(zhuǎn)光電倍增器：接受通過探測器針孔的光信號，轉(zhuǎn)換成電信號后轉(zhuǎn)輸至計算機，在屏幕上形成焦平換成電信號后轉(zhuǎn)輸至計算機，在屏幕上形成焦平面圖形面圖形多熒光通道多熒光通道:可以同時對樣品進行多種熒光標記的可以同時對樣品進行多種熒光標記的信號檢測信號檢測計算機控制系統(tǒng)：控制步動電動機帶動顯微鏡計算機控制系統(tǒng)：控制步動電動機帶動顯微鏡移動，實現(xiàn)在同一焦面移動，實現(xiàn)在同一焦面(x-y軸軸)上逐點掃描；控上逐點掃描；控制共聚焦系統(tǒng)；控制沿制共聚焦系統(tǒng)；

15、控制沿z軸改變焦平面，進行軸改變焦平面，進行對樣品厚度的連續(xù)光學(xué)切片和對樣品結(jié)構(gòu)的三對樣品厚度的連續(xù)光學(xué)切片和對樣品結(jié)構(gòu)的三維重建；控制信號的采集、轉(zhuǎn)輸、分析。維重建；控制信號的采集、轉(zhuǎn)輸、分析。3.lscm相對光學(xué)顯微鏡的優(yōu)點相對光學(xué)顯微鏡的優(yōu)點lscm的圖像是以電信號形式記錄下來的，可用的圖像是以電信號形式記錄下來的，可用電子計算機技術(shù)模擬數(shù)字化處理電子計算機技術(shù)模擬數(shù)字化處理利用共聚焦系統(tǒng)有效排除了焦點外信號干擾，利用共聚焦系統(tǒng)有效排除了焦點外信號干擾，不僅提高了不僅提高了x-y軸焦平面分辨率和清晰度，而軸焦平面分辨率和清晰度，而且可對觀察樣品進行且可對觀察樣品進行z軸無損傷光切片，實現(xiàn)

16、軸無損傷光切片，實現(xiàn)三維結(jié)構(gòu)的定位成像三維結(jié)構(gòu)的定位成像可廣泛應(yīng)用于活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，定量、定可廣泛應(yīng)用于活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，定量、定性、定位分析。與熒光探針技術(shù)結(jié)合，可進行性、定位分析。與熒光探針技術(shù)結(jié)合，可進行單細胞分選和多種細胞分子生物學(xué)研究及細胞單細胞分選和多種細胞分子生物學(xué)研究及細胞機能學(xué)研究機能學(xué)研究4.lscm的應(yīng)用的應(yīng)用貼壁細胞的分選貼壁細胞的分選n數(shù)量較多細胞群的分選數(shù)量較多細胞群的分選:在特別培養(yǎng)皿上一類細胞在特別培養(yǎng)皿上一類細胞群經(jīng)熒光染色，另一類細胞群未經(jīng)染色，可用高群經(jīng)熒光染色，另一類細胞群未經(jīng)染色，可用高能激光把熒光染色的細胞群殺死，而另一類保存，能激光把熒光染色

17、的細胞群殺死，而另一類保存，可繼續(xù)培養(yǎng)?？衫^續(xù)培養(yǎng)。n少量或單克隆細胞的分選：對于選中的突變細胞、少量或單克隆細胞的分選：對于選中的突變細胞、雜交細胞或腫瘤轉(zhuǎn)移細胞，可利用鋪有特制膜的雜交細胞或腫瘤轉(zhuǎn)移細胞，可利用鋪有特制膜的培養(yǎng)皿上，在選中的細胞克隆周圍切割成八角帶，培養(yǎng)皿上，在選中的細胞克隆周圍切割成八角帶，再用高能激光殺傷八角帶之外的細胞。再用高能激光殺傷八角帶之外的細胞。細胞形態(tài)學(xué)研究：可行細胞形態(tài)學(xué)研究：可行x-y焦平面形態(tài)研究，尤其焦平面形態(tài)研究，尤其是可行工是可行工z軸三維形態(tài)結(jié)構(gòu)研究?？蓪毎螤睿S三維形態(tài)結(jié)構(gòu)研究?？蓪毎螤睿荛L，面積，平均熒光強度，也可對細胞內(nèi)溶酶體，

18、周長，面積，平均熒光強度，也可對細胞內(nèi)溶酶體，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞骨架，結(jié)構(gòu)性蛋白形態(tài)、數(shù)線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞骨架，結(jié)構(gòu)性蛋白形態(tài)、數(shù)量、位置的描述。量、位置的描述。細胞內(nèi)某些大分子組分分析：與免疫熒光技術(shù)和熒細胞內(nèi)某些大分子組分分析：與免疫熒光技術(shù)和熒光探針技術(shù)相結(jié)合，可對細胞內(nèi)蛋白、光探針技術(shù)相結(jié)合，可對細胞內(nèi)蛋白、dna、rna、酶、受體等組份進行定性定量定時定位分析，以及酶、受體等組份進行定性定量定時定位分析，以及細胞內(nèi)細胞內(nèi)ph和細胞內(nèi)某些離子進行分析。用于細胞機和細胞內(nèi)某些離子進行分析。用于細胞機能學(xué)研究。細胞通訊研究。能學(xué)研究。細胞通訊研究。細胞機能學(xué)研究及細胞通訊研究細胞機能學(xué)研究及細胞通訊研究細胞顯微外科手術(shù)：在細胞顯微外科手術(shù)：在lscm鏡下可將激光作鏡下可將激光作光子刀使用進行細胞穿孔、染色體精切，細胞光子刀使用進行細胞穿孔、染色體精切，細胞器燒灼，神經(jīng)元突觸切除，細胞器轉(zhuǎn)移等手術(shù)。器燒灼，神經(jīng)元突觸切除，細胞器轉(zhuǎn)移等手術(shù)。五、電鏡觀察法五、電鏡觀察法 p78n分辨率分辨率：肉眼：肉眼0.1mm 光鏡（油鏡）光鏡（油鏡）0.2um 電鏡可達電鏡可達0.08nmn培養(yǎng)細胞的電鏡觀察途徑培養(yǎng)細胞的電鏡觀察途徑 透射電鏡觀察透射電鏡觀察 內(nèi)部結(jié)構(gòu)內(nèi)部結(jié)構(gòu) 原位切片原位切片 組織消化分離后切組織消化分離后切 掃描電鏡觀察掃描電鏡觀察 c表面結(jié)構(gòu)