感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化(C)PPT

1、2021/8/251感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化2021/8/252導入大腸桿菌導入大腸桿菌: 氯化鈣轉(zhuǎn)化法氯化鈣轉(zhuǎn)化法electroporation 電擊法又叫電穿孔法電擊法又叫電穿孔法 體外包裝感染法體外包裝感染法重組重組DNA導入哺乳動物細胞導入哺乳動物細胞: DNA- 磷酸鈣共沉淀、磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導法、脂質(zhì)體介導法、原生質(zhì)體融合法原生質(zhì)體融合法 酵母菌轉(zhuǎn)化法酵母菌轉(zhuǎn)化法: 完整細胞轉(zhuǎn)化法完整細胞轉(zhuǎn)化法 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 電擊法電擊法2021/8/253大腸桿菌大腸桿菌(Escherichia coli)o 大腸桿菌大腸桿菌(Esch

2、erichia coli)大約含大約含3000kb的環(huán)狀染色體的環(huán)狀染色體DNA的棒狀細菌。的棒狀細菌。革蘭氏陰性、兼性厭氧。最適生長溫度革蘭氏陰性、兼性厭氧。最適生長溫度37，PH7.07.6 (一般一般7.4)，保存加，保存加甘油，培養(yǎng)皿密封。甘油，培養(yǎng)皿密封。o 大腸桿菌的生長曲線可分為遲緩期大腸桿菌的生長曲線可分為遲緩期(生長滯后期生長滯后期)、對數(shù)生長期、對數(shù)生長期(2030min)、穩(wěn)定期穩(wěn)定期(飽和期飽和期)，約，約1109 2108/mL和衰老期。和衰老期。 2021/8/2542021/8/255 大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大。有些菌株大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大

3、。有些菌株在液體培養(yǎng)基中，在液體培養(yǎng)基中，4可保存幾個月，而有些菌株在相同可保存幾個月，而有些菌株在相同條件下只能保存幾天。如在相同條件下，大腸桿菌條件下只能保存幾天。如在相同條件下，大腸桿菌K12株株比大腸桿菌比大腸桿菌X1776株保存期長。株保存期長。 所以菌株首先應劃平板分離單個菌落，經(jīng)擴增后再所以菌株首先應劃平板分離單個菌落，經(jīng)擴增后再做抗藥性等鑒定，然后應用或保存。保存一般用對數(shù)生做抗藥性等鑒定，然后應用或保存。保存一般用對數(shù)生長后期的細菌。根據(jù)不同需要做短期、中期或長期保存。長后期的細菌。根據(jù)不同需要做短期、中期或長期保存。2. 菌株的保存菌株的保存2021/8/256 LB瓊脂平

4、板劃線，瓊脂平板劃線，37，倒置平板培養(yǎng)，倒置平板培養(yǎng)(16-24hr)，形成，形成單一菌落后，用石臘紙單一菌落后，用石臘紙(parafilm)將平皿四周封嚴將平皿四周封嚴(使平皿隔使平皿隔絕空氣絕空氣)，倒置放入，倒置放入4或或-20冰箱中，可保存數(shù)周。冰箱中，可保存數(shù)周。 E. coli菌株的生存期差別大：有些菌株在液體培養(yǎng)基中，菌株的生存期差別大：有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4能存活幾個月。有些菌株只能活幾天。能存活幾個月。有些菌株只能活幾天。 穿刺瓊脂穿刺瓊脂(stab agar)，室溫，避光可保存數(shù)年。，室溫，避光可保存數(shù)年。 冰凍：單一菌落，液體培養(yǎng)基中擴增后，稀釋后倒入冰凍：單一菌落

5、，液體培養(yǎng)基中擴增后，稀釋后倒入10-50%甘油培養(yǎng)基中，分裝，置甘油培養(yǎng)基中，分裝，置-20 -70?？山?jīng)過?？山?jīng)過30次凍融，次凍融，細菌仍然存活。細菌仍然存活。 菌菌LB中過液培養(yǎng)，加入等體積中過液培養(yǎng)，加入等體積2冰凍培養(yǎng)基。液氮速冰凍培養(yǎng)基。液氮速凍后置凍后置-70，可經(jīng)，可經(jīng)15次凍融，保存次凍融，保存5年以上。年以上。具體保存方法：具體保存方法：2021/8/257瓊脂穿刺培養(yǎng)基瓊脂穿刺培養(yǎng)基 2冰凍培養(yǎng)基冰凍培養(yǎng)基 瓊脂（瓊脂（Difco） 6g K2HPO4 12.6g細菌胰蛋白胨細菌胰蛋白胨（Difco） 10gN+-檸檬酸檸檬酸 0.19g NaCl 8gMgSO4H2O

6、 0.18g HCl 20mg(NH4)2SO4 1.8g ddH2O 至至1LKH2PO4 3.6g 甘油甘油 88g dH2O 至至1L 菌株保存液的配制菌株保存液的配制2021/8/258高壓滅菌高壓滅菌 Phagemid -20 Enzyme -20 Buffers -20 Primer -4 Thiodeyivatives -20 Ribonucleotides-20 Helper phage -4 置于置于20或或80，并一個月檢查一次，并一個月檢查一次 2021/8/259抗生素抗生素工作濃度工作濃度 松馳型質(zhì)粒松馳型質(zhì)粒 嚴緊型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒 氨芐青霉素氨芐青霉素(Amp) 5

7、0mg/mL（水）（水） 60ug/mL20ug/mL 氯霉素氯霉素(Cm) 34mg/mL（乙醇）（乙醇）170ug/mL 25ug/mL 卡那霉素卡那霉素(Kan) 50ug/mL（水）（水）50ug/mL10ug/mL 鏈霉素鏈霉素(Sm) 10mg/mL（水）（水）50ug/mL10ug/mL 四環(huán)素四環(huán)素(Tc) 5mg/mL（乙醇）（乙醇） 50ug/mL10ug/mL抗生素的配制抗生素的配制2021/8/2510大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和貯存大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和貯存 在基因工程研究過程中，常常需要將外源在基因工程研究過程中，常常需要將外源DNA與載體與載體DNA連接，重組后，導

8、入大腸桿菌受體細胞中，進行連接，重組后，導入大腸桿菌受體細胞中，進行DNA復制，擴增或表達，噬菌體單鏈或雙鏈復制，擴增或表達，噬菌體單鏈或雙鏈DNA導入大腸桿菌導入大腸桿菌宿主菌中復制擴增。但很久以前人們就試圖將宿主菌中復制擴增。但很久以前人們就試圖將DNA轉(zhuǎn)化大轉(zhuǎn)化大腸桿菌但都沒有成功。因此長期以來人們一直認為大腸桿腸桿菌但都沒有成功。因此長期以來人們一直認為大腸桿菌缺乏天然的轉(zhuǎn)化機理。菌缺乏天然的轉(zhuǎn)化機理。1970年年M. Mandela 和和A. Higa提提出，在轉(zhuǎn)化出，在轉(zhuǎn)化DNA之前，預先用氯化鈣溶液處理大腸桿菌，之前，預先用氯化鈣溶液處理大腸桿菌，能夠人為地誘導這些大腸桿菌細胞呈

9、現(xiàn)感受態(tài)，這種細胞能夠人為地誘導這些大腸桿菌細胞呈現(xiàn)感受態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。從而提高重組稱為感受態(tài)細胞。從而提高重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化頻率。目前對這種機制尚不清楚。化頻率。目前對這種機制尚不清楚。 2021/8/2511感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞(Compenent cells)：將質(zhì)粒將質(zhì)粒DNA或重組質(zhì)粒或重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化到宿主菌中之前，必須使細菌呈感受狀，即有能力攝取到宿主菌中之前，必須使細菌呈感受狀，即有能力攝取DNA的狀態(tài)。的狀態(tài)。( (主要介紹用氯化鈣溶液處理大腸桿菌制備感受態(tài)細胞的方法主要介紹用氯化鈣溶液處理大腸桿菌制備感受態(tài)細胞的方法) ) 取

10、出大腸桿菌取出大腸桿菌HB101菌種管劃菌種管劃LB瓊脂平板，瓊脂平板，-70保存，保存，37過夜過夜(一般一般16小時小時)。 取一個菌落接種于取一個菌落接種于35mlLB培養(yǎng)管中，培養(yǎng)管中，37振振 培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)，過夜(816小時小時)。 取出取出1mL過液菌加入新鮮配制的過液菌加入新鮮配制的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)液50mL中中(2%接種量接種量)。37振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)，24小時。測定光密度值小時。測定光密度值(約約5107個細胞個細胞/mL)，OD550達達0.30.5。注意：不同的大腸桿菌菌株，每注意：不同的大腸桿菌菌株，每mL培養(yǎng)物中細菌存活數(shù)與光密度值培養(yǎng)物中細菌存活數(shù)與光密度值間關系

11、不同。間關系不同。 HB101，OD600=0.5（約（約107個細胞個細胞/mL） X1776，OD600=0.2（約（約107個細胞個細胞/mL）2021/8/2512 細菌培養(yǎng)管取出置水浴中，細菌培養(yǎng)管取出置水浴中，1015分鐘。分鐘。 細菌移入預冷的離心管中，細菌移入預冷的離心管中，44000GSA轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)離心5分鐘；棄上分鐘；棄上清，留沉淀置于冰浴中。清，留沉淀置于冰浴中。 加加0.1mol/L CaCl2(預冷預冷)溶液溶液25mL，將沉淀充分懸浮，置冰浴中，將沉淀充分懸浮，置冰浴中2030分鐘。延長分鐘。延長CaCl2處理時間，可增加感受態(tài)，所以也可在處理時間，可增加

12、感受態(tài)，所以也可在0過夜。過夜。 4，40002500rpm轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，留沉淀，置冰浴中。分鐘，棄上清，留沉淀，置冰浴中。 用預冷的用預冷的0.1mol/L CaCl2溶液溶液2.5mL，小心輕輕懸浮沉淀，小心輕輕懸浮沉淀，4過夜。過夜?？芍苯邮褂?。可直接使用。 次日加次日加20%(最終濃度最終濃度)滅菌預冷甘油。滅菌預冷甘油。 分裝成每分裝成每Eppendorf管管200uL。 新鮮感受態(tài)細胞用于質(zhì)粒新鮮感受態(tài)細胞用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化最好。但新鮮感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化最好。但新鮮感受態(tài)細胞0 4貯存不超過貯存不超過3天。長期保存，必須將細胞在天。長期保存，必須將細胞在-70干冰或液氮氣

13、體干冰或液氮氣體部分速凍部分速凍5分鐘，再置于分鐘，再置于-80冰箱中保存，一般可保存冰箱中保存，一般可保存1年。年。2021/8/2513 CaCl2處理處理4，0.1M低滲低滲CaCl2處理使細菌表面的細胞處理使細菌表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，俗稱俗稱“打孔打孔”，使，使DNA分子能夠進入細胞內(nèi)。分子能夠進入細胞內(nèi)。 CaCl2處理使感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受處理使感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受DNA的的酶位點，使酶位點，使DNA分子能進入細胞。在細菌中能發(fā)展為感受分子能進入細胞。在細菌中能發(fā)展為感受態(tài)細

14、胞占極小數(shù)，只有感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定的攝取外來態(tài)細胞占極小數(shù)，只有感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定的攝取外來DNA分子。保持感受態(tài)的時間約分子。保持感受態(tài)的時間約12天，一般出現(xiàn)在生長天，一般出現(xiàn)在生長對數(shù)期的后期。對數(shù)期的后期。兩種假設：兩種假設：2021/8/25145 . DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 抗生素抗生素 抽濾除菌并均置抽濾除菌并均置 -20保存。保存?？股夭荒蜔?，在加入到瓊脂抗生素不耐熱，在加入到瓊脂板中時，應等瓊脂冷至板中時，應等瓊脂冷至4850時再加入抗生素時再加入抗生素 Mg+是四環(huán)素拮抗物，是四環(huán)素拮抗物， 需加需加MgCl2時改加時改加NaCl(6g/L) 四環(huán)素光敏感

15、應避光保存四環(huán)素光敏感應避光保存（1）抗性瓊脂板中抗生素的配制）抗性瓊脂板中抗生素的配制2021/8/2515 感受態(tài)細胞新鮮配制的或從感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80凍存取出后置于冰水中融化。凍存取出后置于冰水中融化。 取出分裝到取出分裝到Eppendorf管中，每管管中，每管100200uL。 加入需轉(zhuǎn)化的加入需轉(zhuǎn)化的DNA溶液溶液25ul充分混勻充分混勻(15ug/mLDNA)。 冰水中放置冰水中放置30分鐘。分鐘。 37或或42水浴水浴2分鐘。分鐘。(熱休克熱休克) 冰浴冰浴2min。 每管再加入每管再加入1mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)1小時。小時。 取出后稍加離心，去

16、掉部分上清，留取出后稍加離心，去掉部分上清，留500uL或或250mLLB則全則全部鋪板。部鋪板。（2） 轉(zhuǎn)化步驟轉(zhuǎn)化步驟2021/8/2516 取取100200uL，置于有選擇性標記的瓊脂培養(yǎng)皿上，用無菌玻，置于有選擇性標記的瓊脂培養(yǎng)皿上，用無菌玻璃棒涂勻；靜置璃棒涂勻；靜置510分鐘。分鐘。 倒置倒置37培養(yǎng)培養(yǎng)1218小時小時(一般過夜一般過夜)；次日，挑選單菌落，擴增，；次日，挑選單菌落，擴增，提取提取DNA酶切，電泳檢測，篩選重組子。酶切，電泳檢測，篩選重組子。 并設下列對照：并設下列對照：A不加需轉(zhuǎn)化的不加需轉(zhuǎn)化的DNA溶液（用蒸餾水或溶液（用蒸餾水或LB培養(yǎng)基代替）。培養(yǎng)基代替）

17、。B用普通用普通LB瓊脂平板代替有選擇性標記的瓊脂平板。瓊脂平板代替有選擇性標記的瓊脂平板。 DNA超螺旋轉(zhuǎn)化最好超螺旋轉(zhuǎn)化最好 DNA環(huán)狀環(huán)狀 次之次之 DNA線狀線狀 有干擾作用有干擾作用 1ug pBR322DNA轉(zhuǎn)化入轉(zhuǎn)化入HB101可得：可得：5106/2107轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子。 DNA分子量小比分了量大的轉(zhuǎn)化率高，一般不超過分子量小比分了量大的轉(zhuǎn)化率高，一般不超過10kb，最高，最高限為限為15kb。一般。一般1ug DNA可得可得51071108個轉(zhuǎn)化菌。個轉(zhuǎn)化菌。2021/8/2517（3）注意事項）注意事項 宿主菌取出時應注意菌株名及編號。宿主菌取出時應注意菌株名及編號。 檢查

18、宿主菌，應無質(zhì)粒污染，無抗菌素抗性。檢查宿主菌，應無質(zhì)粒污染，無抗菌素抗性。 整個操作過程應保持無菌狀態(tài)。整個操作過程應保持無菌狀態(tài)。 LB培養(yǎng)液中不能有抗生素。培養(yǎng)液中不能有抗生素。 不同受體菌，培養(yǎng)要求不同。如不同受體菌，培養(yǎng)要求不同。如 K802株，株，OD550=0.5 最好，而最好，而X1776株，株，OD550=0.20.3最好。最好。 質(zhì)粒的質(zhì)粒的DNA比較小，有助于其轉(zhuǎn)于宿主細胞中的效比較小，有助于其轉(zhuǎn)于宿主細胞中的效率。轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒大小成反比。而質(zhì)粒大于率。轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒大小成反比。而質(zhì)粒大于15kb時，時，轉(zhuǎn)化率成為限制因素。同時質(zhì)粒大，復制的拷貝數(shù)低。轉(zhuǎn)化率成為限制因素

19、。同時質(zhì)粒大，復制的拷貝數(shù)低。2021/8/2518（4）質(zhì)粒的三種構(gòu)型）質(zhì)粒的三種構(gòu)型 超螺旋閉合環(huán)狀超螺旋閉合環(huán)狀DNA，cccDNA。 開環(huán)開環(huán)DNA，至少一股，至少一股DNA上有缺口，一處或多上有缺口，一處或多處使處使DNA鮮旋。鮮旋。 線狀線狀DNA 瓊脂糖瓊脂糖(Agrose)電泳可將這三種構(gòu)型的電泳可將這三種構(gòu)型的DNA分分開，開，Agrose電泳中電泳中 cccDNA位置最前。位置最前。2021/8/2519二、閱讀微生物的基因型符二、閱讀微生物的基因型符號號 在描述一個微生物的品系時，最重要的事就是區(qū)分它的基因型和表在描述一個微生物的品系時，最重要的事就是區(qū)分它的基因型和表現(xiàn)

20、型?；蛐驼f明它的遺傳決定子，這是看不見的特性；而表現(xiàn)型反映現(xiàn)型。基因型說明它的遺傳決定子，這是看不見的特性；而表現(xiàn)型反映的是可觀察到的特性。的是可觀察到的特性。 1由于一個微生物的基因組中有成百個基因。因此，一般而言，在由于一個微生物的基因組中有成百個基因。因此，一般而言，在描述一個品系的基因型時只給出它與野生型有所不同的等位基因，而不描述一個品系的基因型時只給出它與野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些與野生型相同的基因。也就是說，在它們名稱后面所給必一一描述那些與野生型相同的基因。也就是說，在它們名稱后面所給出的是這些品系的基因組中發(fā)生了突變的基因。如：某菌，出的是這些品系的基因組

21、中發(fā)生了突變的基因。如：某菌，trp、his和和metA，是表示它的，是表示它的trp、his和和metA基因座是突變了的，其他基因組仍然基因座是突變了的，其他基因組仍然正常。在上下文貫通地具體描述微生物的某個基因正常。在上下文貫通地具體描述微生物的某個基因 (如如trp) 時，可以用時，可以用trp+，或者只是簡單地用，或者只是簡單地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到表示它的野生型品系，而不必在每次提到它時都寫作它時都寫作trp+。有些突變型是缺失突變，就用表示，如。有些突變型是缺失突變，就用表示，如lon表示表示lon基因的缺失突變?；虻娜笔蛔儭?021/8/2520 2有些

22、細菌中有附加體或者其他特殊的傳導噬菌體。最常見的是有些細菌中有附加體或者其他特殊的傳導噬菌體。最常見的是性因子性因子F。細菌中有。細菌中有F因子的描述為因子的描述為F+；沒有的為；沒有的為F-。有些。有些F因子上面因子上面帶有細菌的某些基因，這樣的帶有細菌的某些基因，這樣的F因子寫作因子寫作F，它所帶基因的描述方法，它所帶基因的描述方法同上。例如同上。例如Flac+，proA+，B+表示表示F因子上面帶有細菌的因子上面帶有細菌的lac和和proA，B基因。又如，基因。又如，F(xiàn)lacZ，proA+，B+表示表示F因子上面帶有因子上面帶有l(wèi)ac和和proA，B基因，但是，其中的基因，但是，其中的Z

23、基因是突變的基因?；蚴峭蛔兊幕?。 3校正基因校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花繚亂。因為野生型品系座位的描述常常令人眼花繚亂。因為野生型品系雖然不帶有校正基因，它的基因型卻理所當然地應當寫作雖然不帶有校正基因，它的基因型卻理所當然地應當寫作sup+，表現(xiàn)，表現(xiàn)型則應該寫為型則應該寫為Sup-。可是，帶有?？墒牵瑤в衧up基因的突變型品系的基因型必需寫基因的突變型品系的基因型必需寫為為sup-或者或者sup，它的表現(xiàn)型是，它的表現(xiàn)型是Sup+。也就是說，字面上的概念與實際。也就是說，字面上的概念與實際上的情況正好倒了一個個兒。因此，在閱讀它時要特別小心，以免搞上的情況正好倒了一個個兒。

24、因此，在閱讀它時要特別小心，以免搞錯。此外，在談到特殊的校正基因時，它的表現(xiàn)型常用數(shù)字來表示，錯。此外，在談到特殊的校正基因時，它的表現(xiàn)型常用數(shù)字來表示，如如Sul；但是，它的基因型卻用字母來表示；但是，它的基因型卻用字母來表示supD。鑒于這種情況，有。鑒于這種情況，有人建議對校正基因野生型人建議對校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符號，只標出突變的品系干脆不用任何符號，只標出突變型品系型品系(Su+)的特殊基因座位符號，如的特殊基因座位符號，如supD和和supE等。等。 2021/8/2521 JM83，F(xiàn)-，ara，(lac-proAB)，rpsL，80d，lacZ M15是這

25、是這樣一個品系：不帶樣一個品系：不帶F因子，因子，ara基因座突變基因座突變(因此不能代謝阿拉伯糖因此不能代謝阿拉伯糖)，lac操縱子缺失操縱子缺失(因此不能利用乳糖因此不能利用乳糖)，30S核糖體的核糖體的S12亞基突變亞基突變(因此有因此有鏈霉素抗生鏈霉素抗生)，-D-半乳糖苷酶基因部分缺失半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含因此在含X-gal的平板中的平板中有有-互補作用。如果將克隆的互補作用。如果將克隆的pUC質(zhì)粒的重組質(zhì)粒的重組DNA轉(zhuǎn)化入這個細菌，轉(zhuǎn)化入這個細菌，就可以通過藍就可以通過藍/白菌斑來篩選出轉(zhuǎn)化子白菌斑來篩選出轉(zhuǎn)化子)。 野生的大腸桿菌具有大約野生的大腸桿菌具有大約4700

26、kbp的的DNA分子，上面有約分子，上面有約2800個基個基因。當這些基因中有突然變異發(fā)生時，基因產(chǎn)物隨之變化，并且有可因。當這些基因中有突然變異發(fā)生時，基因產(chǎn)物隨之變化，并且有可能給大腸桿菌帶來可以觀察到的變化。這種能夠觀察到的特征叫做大能給大腸桿菌帶來可以觀察到的變化。這種能夠觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型腸桿菌的表現(xiàn)型(Phenotype)，而把基因的構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型，而把基因的構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型(Genotype)。試舉一例來說明上述概念：試舉一例來說明上述概念：2021/8/2522 通常情況下，基因工程中使用的大腸桿菌的基因型只有在基因發(fā)通常情況下，基因工程中使用的

27、大腸桿菌的基因型只有在基因發(fā)生變異，表現(xiàn)型發(fā)生變化時才被表示。但是需要特別的表示時，則在生變異，表現(xiàn)型發(fā)生變化時才被表示。但是需要特別的表示時，則在野生的基因型上加野生的基因型上加“+”，在變異的基因型上加，在變異的基因型上加“-”以示區(qū)別。表示方以示區(qū)別。表示方法是用基因產(chǎn)物或其作用的名稱的三個斜體字素表示法是用基因產(chǎn)物或其作用的名稱的三個斜體字素表示(如如 DNA Aednine methylase-dam)。如果不同的基因變導致相同的作用結(jié)果，則加上一。如果不同的基因變導致相同的作用結(jié)果，則加上一個大寫字母個大寫字母(如如Recombination- recA、recB、recC)。 某

28、個基因或者是某領域缺失時，在基因型前向加上某個基因或者是某領域缺失時，在基因型前向加上“”表示，表示，如如“從從lac到到proAB基因缺失時表示為基因缺失時表示為(lac-proAB)。 野生的大腸桿菌本來還有具有野生的大腸桿菌本來還有具有F因子等的質(zhì)粒因子等的質(zhì)粒DNA，并且感染噬菌，并且感染噬菌體。把被野生的大腸桿菌感染的噬菌體特稱為原噬菌體體。把被野生的大腸桿菌感染的噬菌體特稱為原噬菌體(Prophage)，例如例如 e14。一般當這些質(zhì)粒或原噬菌體缺失或變異時也用。一般當這些質(zhì)粒或原噬菌體缺失或變異時也用“()”或或“/”等等加以區(qū)別表示。加以區(qū)別表示。2021/8/2523表現(xiàn)型是

29、用羅馬字母體表示表現(xiàn)型是用羅馬字母體表示(第一個字母大寫第一個字母大寫)。一般通過變異。一般通過變異而獲得了能夠觀察到的抗藥性或者活性表達等特征時，用而獲得了能夠觀察到的抗藥性或者活性表達等特征時，用“+”表示表示(Steptomycin抗性：抗性：Str+)；相反地當成為藥物敏感性或者活性喪失；相反地當成為藥物敏感性或者活性喪失時，用時，用“-”表示表示(Ampicillin敏感性：敏感性：Amp-)?；蛐捅憩F(xiàn)容易混淆，?；蛐捅憩F(xiàn)容易混淆，使用時注意。使用時注意。 *基因工程中經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于基因工程中經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于K-12菌株，最近菌株，最近也常使用由也常

30、使用由B株及株及C株來源的大腸桿菌。株來源的大腸桿菌。 *大腸桿菌大腸桿菌B株原來就為株原來就為lon-，另外，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因株不具有琥柏抑制基因(Amber suppressor free)，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。因此不在基因型中加以表示，要注意。2021/8/2524p supE (suppressor) 抑制基因抑制基因 supE變異時，即使存在終止密碼變異時，即使存在終止密碼UAG，此處也會插入谷，此處也會插入谷氨酰胺氨酰胺 (Glutamine) ，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。，從而

31、可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。p supF (suppressor) 抑制基因抑制基因 supF變異時，即使存在終止密碼子變異時，即使存在終止密碼子UAG，此處也會插入酪，此處也會插入酪氨酸氨酸 (Tyrosine) ，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。停止密碼回復停止密碼回復2021/8/2525p recA (recombination) 重組重組 相同的相同的DNA重組活性缺失重組活性缺失 由于導入由于導入DNA與宿主與宿主DNA的重組受到阻害，可以保的重組受到阻害，可以保持插入持插入DNA的穩(wěn)定性。與的穩(wěn)定性。與recA13宿主菌相比，宿主菌相比，recA1宿宿主菌能夠使插入主菌

32、能夠使插入DNA穩(wěn)定存在。穩(wěn)定存在。p recB，C (recombination) 重組重組 內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶V變異。變異。 抑制重組并能影響放射線損傷的修復。抑制重組并能影響放射線損傷的修復。 p traD (transmissibility) 遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性 在質(zhì)粒在質(zhì)粒F因子內(nèi)部，與大腸桿菌的結(jié)合有關。因子內(nèi)部，與大腸桿菌的結(jié)合有關。 TraD變異后，變異后，F(xiàn)因子自身的傳遞能力顯著下降。因子自身的傳遞能力顯著下降。重組機能缺失重組機能缺失2021/8/2526p dam (DNA adenine methylase) DNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶 宿主菌來源的腺嘌呤甲

33、化酶宿主菌來源的腺嘌呤甲化酶 (GmATC) 缺失缺失p dcm (DNA cytsine methylase) DNA胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶 宿主菌來源的胞嘧啶甲基化酶（宿主菌來源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失）缺失p hsdR (host specificity defective) 宿主特異性缺陷宿主特異性缺陷 宿主菌來源的宿主菌來源的I型限制酶型限制酶Ecok (或或EcoB) 的切斷部位蛋白變異的切斷部位蛋白變異 轉(zhuǎn)化的外源轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶不被限制酶EcoK切斷，可以進行克隆切斷，可以進行克隆p hsdM (host specificity defective)

34、 宿主菌來源的宿主菌來源的I型限制酶型限制酶EcoK (或或EcoB) 的甲基化酶部位蛋白變異的甲基化酶部位蛋白變異p hsdS（host specificity defective） 宿主菌來源的宿主菌來源的I型限制酶型限制酶EcoK (或或EcoB) 的識別部位蛋白變變異的識別部位蛋白變變異 轉(zhuǎn)化的外源轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶不被限制酶EocK切斷，可以進行克隆切斷，可以進行克隆對插入對插入DNA具有直接作用因子的缺失具有直接作用因子的缺失2021/8/2527p endA (endonuclease) 內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶 宿主菌來源的非特異性內(nèi)切核酸酶宿主菌來源的非特異性內(nèi)切核酸酶I

35、活性缺失，可以活性缺失，可以 提高純提高純化的質(zhì)?；馁|(zhì)粒DNA的質(zhì)量。的質(zhì)量。p NcrA (methylcytsine restriction) mCG序列的甲基化活性缺失。序列的甲基化活性缺失。p mcrB，C (methylcytsine restriction) GmC序列的甲基化活性缺失。序列的甲基化活性缺失。p mrr (methylation requiring restricion) mA以及以及mC序列的甲基化活性缺失。序列的甲基化活性缺失。2021/8/2528p rpsL (ribosomal protein small subunit) 由由30S核糖體蛋白變異而獲得

36、鏈霉素核糖體蛋白變異而獲得鏈霉素 (Steptomycine)抗性抗性 (Strr)。p gyrA (gyrase) 由由DNA回旋酶亞基回旋酶亞基A的變異而獲得的萘啶酮酸的變異而獲得的萘啶酮酸(Nalidxic acid) 抗性抗性 (Nalr)。 p Tn5 (transposon) 轉(zhuǎn)座子變異，獲得卡那霉素轉(zhuǎn)座子變異，獲得卡那霉素 (Kanamycine) 抗性抗性(Kmr)。p Tn10 (transposon) 轉(zhuǎn)座子變異，獲得四環(huán)素（轉(zhuǎn)座子變異，獲得四環(huán)素（Tetracycline）抗性（）抗性（Tetr）。）?？顾幮缘淖儺惪顾幮缘淖儺?021/8/2529p lon (long

37、form) 分解異型蛋白質(zhì)的分解異型蛋白質(zhì)的ATP依賴型蛋白分解酶活性缺失。依賴型蛋白分解酶活性缺失。大腸桿菌大腸桿菌B株原來就為株原來就為lon-?？梢种破浔磉_的融合蛋?？梢种破浔磉_的融合蛋白質(zhì)的分解。白質(zhì)的分解。p omp (outer membrane protein) 外膜蛋白外膜蛋白 膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表達的融合蛋膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表達的融合蛋白質(zhì)的分解白質(zhì)的分解。宿主蛋白酶缺失宿主蛋白酶缺失2021/8/2530p lac Iq (lactose) 乳糖操縱子中控制乳糖操縱子中控制-半乳糖苷酶表達的調(diào)節(jié)蛋白基因。由于半乳糖苷酶表達的調(diào)節(jié)蛋白基因。由于la

38、cIq變異，表達調(diào)節(jié)蛋白過量形成，因此從乳糖啟動子開始的轉(zhuǎn)變異，表達調(diào)節(jié)蛋白過量形成，因此從乳糖啟動子開始的轉(zhuǎn)錄過程完全受到抑制。錄過程完全受到抑制。p lacZ (lactose) -半乳糖苷酶活性缺失半乳糖苷酶活性缺失p lacZ M15 -半乳糖苷酶蛋白的半乳糖苷酶蛋白的w-fragment得到表達。當與多數(shù)載體質(zhì)粒得到表達。當與多數(shù)載體質(zhì)粒中所具有的中所具有的-fragment共同存在時，可使共同存在時，可使-半乳糖苷酶的活性回復半乳糖苷酶的活性回復 (-互補性互補性)。在含有。在含有X-gal的平板培養(yǎng)基上，可以通過藍白菌的差的平板培養(yǎng)基上，可以通過藍白菌的差別選擇重組體。別選擇重組

39、體。p deoR deoR變異，可以選擇性地改善大分子變異，可以選擇性地改善大分子DNA的轉(zhuǎn)化。的轉(zhuǎn)化。有利于選擇轉(zhuǎn)化體的基因有利于選擇轉(zhuǎn)化體的基因2021/8/2531p dut (dUTPase) dUTP酶酶 dUTP分解酶活性缺失，當分解酶活性缺失，當dUTP分解酶存在時，分解酶存在時， dUTP不能摻不能摻入到入到DNA鏈中。鏈中。p ung (Urasil-N-glycosylase) 尿嘧淀尿嘧淀-N-糖苷酶糖苷酶 尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶活性缺失。糖苷酶活性缺失。 當具有這種基因時，可以特異性地分解當具有這種基因時，可以特異性地分解DNA含含U的那條鏈。的那條鏈。p mutS

40、(mutator) 突變子突變子 未被甲基化的新合成未被甲基化的新合成DNA鏈的錯配序列修復受到阻礙。鏈的錯配序列修復受到阻礙。有利于點突變的基因有利于點突變的基因2021/8/2532p leuB (leucine) 亮氨酸亮氨酸 在最小培養(yǎng)基中必須添加亮氨酸在最小培養(yǎng)基中必須添加亮氨酸 (Leu)p proAB (proline) 脯氨酸脯氨酸 脯氨酸代謝基因變異。在最小培養(yǎng)基中只有添加脯氨酸才能脯氨酸代謝基因變異。在最小培養(yǎng)基中只有添加脯氨酸才能生長。用于確認生長。用于確認JM109等大腸桿菌菌株的等大腸桿菌菌株的F因子是否脫落。因子是否脫落。p Thi-1 (thiamine) 硫胺素

41、硫胺素 硫胺素代謝基因變異，在最小培養(yǎng)基中必須添加硫胺素。硫胺素代謝基因變異，在最小培養(yǎng)基中必須添加硫胺素。菌株篩選用基因菌株篩選用基因2021/8/2533LacZ、lac5、trpE、bio、bio256從大腸桿菌從大腸桿菌lac、trp和和bio區(qū)置換而來區(qū)置換而來imm80、QSR80從從80噬體置換而來噬體置換而來imm434從從434噬菌體置換而來噬菌體置換而來imm21從從21噬菌體置而來噬菌體置而來int29從從29噬菌體置換而來噬菌體置換而來b2、b1007、b527、b189B域的缺失突變，使域的缺失突變，使att位點受破壞并因而阻止溶源化位點受破壞并因而阻止溶源化KH52

42、80噬菌體噬菌體DNA的缺失突變的缺失突變KH53類似于類似于噬菌體噬菌體cI區(qū)域的區(qū)域的80噬菌體區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化噬菌體區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化KH54RexcI區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化nin5轉(zhuǎn)錄終止位點轉(zhuǎn)錄終止位點tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并基因產(chǎn)物，并且也刪除了且也刪除了ral基因附近的基因附近的BamH I位點位點ninL44轉(zhuǎn)錄終止位點轉(zhuǎn)錄終止位點tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并基因產(chǎn)物，

43、并且也刪除了且也刪除了ral基因附近的基因附近的BamH I位點。位點。WL113從從33 240位的位的SalI到到34 500位的位的BamH I之間的之間的1，3kb缺失突變，不損傷缺失突變，不損傷gam基因，但基因，但kil，c、ssb和和ral基因被刪除。基因被刪除。sslI1-2從第一到第二個從第一到第二個SalI之間的之間的0.5kb缺失突變，缺失突變，gam基因和部分基因和部分bet基因被刪除基因被刪除。2021/8/2534續(xù)續(xù) 上上 表表 shnd 2-3噬菌體第二與第三個噬菌體第二與第三個Hind 之間的之間的2.3kb缺失突變，部分缺失突變，部分b區(qū)被刪除區(qū)被刪除 sx

44、I1oXbaI酶切后經(jīng)外切核酸酶消化而造成的酶切后經(jīng)外切核酸酶消化而造成的0.5kb缺失突變?nèi)笔蛔?鼠填充片段鼠填充片段 大腸桿菌填充片段大腸桿菌填充片段 lac操縱基因操縱基因+ 腺病毒腺病毒DNA在重組體中將被置換的載體在重組體中將被置換的載體DNA片段片段 Bluescript M13-重組入重組入ZAP載體的噬菌粒，當用載體的噬菌粒，當用M13輔助噬菌體感染后，噬菌粒部分可在體內(nèi)被切下。輔助噬菌體感染后，噬菌粒部分可在體內(nèi)被切下。 lacY、lacZ、lacPO 、lacIq、ampr插入插入OPF8的的lac和氨芐青霉素抗生基因和氨芐青霉素抗生基因 Aam、Bam、Eam、 Wam

45、、gamam可被可被supE和（或）和（或）supF抑制的琥珀突變。抑制的琥珀突變。 int amInt基因內(nèi)的基因內(nèi)的BamH I位點被消除后形成的琥珀突變。位點被消除后形成的琥珀突變。 Sam7、Sam100參與溶解細菌細胞膜的一個基因內(nèi)的琥珀突變。該突變可被參與溶解細菌細胞膜的一個基因內(nèi)的琥珀突變。該突變可被supF抑制，但不被抑制，但不被supE抑制，失卻野抑制，失卻野生型生型S基因產(chǎn)物后，引起感染性噬菌體顆粒在細胞內(nèi)發(fā)生積累。基因產(chǎn)物后，引起感染性噬菌體顆粒在細胞內(nèi)發(fā)生積累。 cIts857使使cI基因產(chǎn)物對熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變基因產(chǎn)物對熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變 chi促進促進噬菌體

46、定向重組的特定八核苷酸序列噬菌體定向重組的特定八核苷酸序列 gamGam基因編碼大腸桿菌基因編碼大腸桿菌recBC外切核酸酶的抑制物，因此可使外切核酸酶的抑制物，因此可使Q型型DNA復制有效地轉(zhuǎn)向滾環(huán)復制復制有效地轉(zhuǎn)向滾環(huán)復制。Gam基因產(chǎn)物對于基因產(chǎn)物對于噬菌體有噬菌體有recA-菌株（菌株（Fec表型）和表型）和P2噬菌體溶源的噬菌體溶源的recA+菌株（菌株（Spi表型）內(nèi)表型）內(nèi)的生長非常重要。的生長非常重要。 exo bet (red)Exo和和bet是位于是位于噬菌體噬菌體red區(qū)域的兩個基因（區(qū)域的兩個基因（red表示兩個基因或任一個基因）。這兩處基因產(chǎn)物表示兩個基因或任一個基因

47、）。這兩處基因產(chǎn)物參與當從參與當從Q型型DNA復制向滾環(huán)復制轉(zhuǎn)變時的重組過程。這兩個基因產(chǎn)物對于復制向滾環(huán)復制轉(zhuǎn)變時的重組過程。這兩個基因產(chǎn)物對于噬菌體在噬菌體在recA-菌株菌株（Fec表型）和表型）和P2噬菌體溶源的噬菌體溶源的recA+菌株（菌株（Spi表型）內(nèi)的生長非常重要。表型）內(nèi)的生長非常重要。2021/8/2535常用細菌菌株常用細菌菌株 C600F-thi-1 thr leuB6 lacY1 ton21 supE44-常用于制備裂解物及增殖常用于制備裂解物及增殖gt10的抑制型菌的抑制型菌株株 該菌株也叫該菌株也叫CR34 C600: HflA150 (Y1073)F-thi-

48、1 thr leuB6 lacY1 tonA21 supE44- hflA150(chr:Tn10)host for repressing background plaques of gt10 when establishing cDNA libraries DH5F-endA1 recA1 hsdR17(rk-mk+)deoR thi-1 supE44-gyrA96 relA1host for pBR322 or other non-Puc vectorsuseful for cDNA cloning DH5F-80dlacZM15(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1

49、hsdR17(rk-mk+) deoR thi-1 supE44-gyrA96relA1host for pUC and other - complementation vectors;pBR322useful for cDNA cloning DH5FF-80dlacZ(lacZYA-argF)U169 endA1 hsdR17(rk-mk+) deoR thi-1 supE44-gryA96relA1Host for growth of M13, phagemids, or other male-specific bacteriophageprovides -complementation

50、 for M13mp vectors2021/8/2536續(xù)續(xù) 上上 表表 DH5F IQFproAB+lacIqZM15zzf:Tn5Kmr/ 80dlacZM15(lacZYA-ARGf)U169 andA1 recA1hsdR17(rk-mk+) deoR thi-1 supE44-gyrA96 relA1host ofr expression from the lac promotherhost for growth of M13, phagemids, or other male-specific bacteriophageprovides -complementation for

51、M13mp vectors DH5- MCRF-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 deoR thi-1supE44-gyrA96 relA1host for pUC and other - complementation vectors;pBR322useful for generating genomic libraries containing methylated cytosine or adenine residues DH10BF-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15

52、lacX74 endA1recA1 deoR (ara,leu)7697araD139 galU galK nupG rpsL-host for pUC and other - complementation vectors;pBR322useful for generating genomic libraries containing methylated cytosine or adenine residuesusful for plasmid rescue procedures DH10BACF-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15lacX74 endA1recA1 deoR (ara,leu)7697araD139 galU galK nupG rpsL-/bmon14272/Pmon7124host for pEASTtBAC vectorsuseful for generating recombinant bacmid DNA for use in BEVS technology2021/8/2537續(xù)續(xù) 上上 表表 DH10B (ZIP)F-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15lacX74 endA1recA