大腸桿菌基因組DNA的提取及熒光定量PCR試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、大腸桿菌基因組DNA得提取一、傳統(tǒng)法提取大腸桿菌基因組 DNA。1、實(shí)驗(yàn)原理提取DNA得一般過(guò)程就是將分散好得組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉 （SDS） 與蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚與氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì) 布 到得DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。SDS得作用機(jī)理就是由于其能結(jié)合蛋白，中與蛋白得電性，使蛋白質(zhì)得非共價(jià) 鍵受到破壞，失去二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為光譜蛋 白酶,其重要特性就是能在SDS與EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在得情況下保持 很高得活性。在勻漿后提取 DNA得反應(yīng)體系中，SDS可通過(guò)失活蛋白破壞細(xì)胞 膜、核膜，并使組織蛋白與DNA

2、分離;而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基 酸，使DNA分子完整地分離出來(lái)。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，最后用無(wú)水乙 醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA,操作過(guò)程中常加入 RNaseA除去RNA。 CTAB（十六烷基三乙基澳化錢(qián)）就是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成 復(fù)合物，在高鹽溶液中（0、7 mol/L NaCl）就是可溶得，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定得 程度（0、3 mol/L NaCl）時(shí),從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB核酸得復(fù)合物與 蛋白多糖物質(zhì)分開(kāi)。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。2、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1）實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌2）實(shí)驗(yàn)試劑：LB

3、液體培養(yǎng)基，TE溶液,10%SDS蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液，酚/氯 仿/異戊醇,異丙醇,70%乙醇3）實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫?fù)u床、低溫離心機(jī)、微量移液器、水浴鍋3、溶液配制1）LB液體培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用膠化蛋白陳10 g/L,細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5 g/L,NaCl 10g/L,去離子水。（攪拌溶解后，用5mol/LNaOH調(diào)pH至7、0、用去離子水定容100ml,用20/50ml 搖瓶分裝5并S,包扎好，在121c ,1、034X105 pa高壓下蒸汽滅菌20min、）2）TE緩沖液：1M Tris 溶液（取 Tris242、2g,加 ddH2O 至 1600ml,

4、加熱溶解）1M trisHCl pH8、0溶液（取1M Tris溶液160ml用分析純鹽酸調(diào)至 Ph=8、0（需濃 鹽酸約8、5ml）,加ddH2O定容至200ml,高壓滅菌備用）TE 緩沖液（10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml0、5M EDTA PH =8、0 1ml向燒杯中加入約400mldd H2O均勻混合;將溶液 定容到500ml后,高溫高壓滅菌，室溫保存）3）蛋白酶K:（20mg蛋白酶K溶于1ml無(wú)菌雙蒸水，20C備用）4）CTAB/NaCl 溶液:（5% w/v,5gCTAB 溶于 100ml 0、5

5、M NaCl 溶液中，需加熱到 65c使之溶解，然后室溫保存）4、實(shí)驗(yàn)方法步驟1、將大腸桿菌接種到滅菌好得 LB培養(yǎng)基中，一級(jí)培養(yǎng)過(guò)夜，以10%得接種量進(jìn) 行二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（46h）02、取菌液1、5ml置于離心管中，以5000rpm冷凍離心1min,棄上清液3、加190 ul TE懸浮沉淀，并加10 ul 10%SDS搖勻直至溶液變粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml）,混勻,37C保溫1小時(shí)。5、力口 30ul 5 mol/L NaCl,混勻。6、力口 30ul CTAB/NaCl 溶液，混勻,65 C 保溫 20min7、加入300ul酚/氯仿/異戊醇抽提(25:24:1)

6、,5000rmp離心10min8、取上清液，加入300ul氯仿/異戊醇(24:1)抽提,5000rmp離心10min9、取上清液，加入300ul得異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜止10min,沉淀 DNA,5000rmp 離心 10min10、力口 500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp離心 10min11、棄上清液，待酒精揮發(fā)盡后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中,20C保存。二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組 DNA。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：1、TGuide細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP30202 50次 420 元2、TaKaRa細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒TaKaRa D

7、V810A 50 650 元3、Biomiga細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒GD241101 Bacterial gDNA kit 50 次 423元GD241102 Bacterial gDNA kit 250 次 1798 元4、Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒BSC12S1 50 次 400 元BSC12M1 100 次 750 元5、OMEGA細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒D335000 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 5 210 元D335001 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 50 980 元D335002 E、Z、N、A、TM

8、Bacterial DNA kit 200 3350 元熒光定量PCR試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法）定量實(shí)驗(yàn)就是一種實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)，用于在聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）得每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)期 間測(cè)定靶核甘酸序列（靶）數(shù)量。其中靶可以就是 DNA、cDNA或RNA。【實(shí)驗(yàn)原理】在實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)就是在PCR產(chǎn)物得擴(kuò)增達(dá)到固定熒光水平時(shí)得循 環(huán)期間時(shí)間點(diǎn)來(lái)描述得，而不就是在固定循環(huán)次數(shù)后累積得PCR產(chǎn)物最終數(shù)量來(lái)描述。擴(kuò)增曲線(xiàn)以圖形形式顯示在執(zhí)行得循環(huán)次數(shù)中檢測(cè)到得熒光。在PCR得最初幾次循環(huán)中，熒光信號(hào)沒(méi)有明顯變化。該預(yù)定義得PCR循環(huán)范圍稱(chēng)為基線(xiàn)。首先，軟件通過(guò)計(jì)算歸一化報(bào)告熒光信號(hào)強(qiáng)度（與基線(xiàn)循環(huán)相對(duì)應(yīng) 得Rn值）得數(shù)

9、學(xué)趨勢(shì)，生成一個(gè)基線(xiàn)簡(jiǎn)化擴(kuò)增曲線(xiàn)。然后，算法將搜索擴(kuò)增曲線(xiàn)上 基線(xiàn)校準(zhǔn)后歸一化報(bào)告熒光信號(hào)強(qiáng)度 （delta Rn ?Rn值）與閾值交叉得點(diǎn)。？Rn 值與閾值交叉得分?jǐn)?shù)循環(huán)定義為 CTo一、試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用StepOne軟件中得Design Wizard（設(shè)計(jì)導(dǎo)向）創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)1、定義實(shí)驗(yàn)屬性在Experiment Properties （實(shí)驗(yàn)屬性）屏幕上，輸入實(shí)驗(yàn)得標(biāo)識(shí)信息，然后選擇 要設(shè)計(jì)得實(shí)驗(yàn)類(lèi)型。1）Experiment Name （實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)）。2）Barcode （條碼）,然后輸入您得PCR反應(yīng)板上得條碼。（可不填）3）User Name （用戶(hù)名）。4）ments （注釋?zhuān)?。（可不填?

10、）選擇Quantitation （定量）實(shí)驗(yàn)類(lèi)型6）Next> （下一步）2、定義方法與材料在Methods & Materials （方法與材料）屏幕上,選擇用于實(shí)驗(yàn)得定量方法、試 劑、升降溫速度與PCR模板。1）將Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）選為定量方法。將Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）選為定量方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)確定樣本中靶 序列得絕對(duì)量。從已知量得稀釋序列中構(gòu)建得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)用于歸檔結(jié)果。當(dāng)設(shè)置反應(yīng)板時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法需要靶、標(biāo)準(zhǔn)品與樣本。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)得PCR反應(yīng)包括以下組分：?樣本-其中靶數(shù)量未知得樣本。?標(biāo)準(zhǔn)品一數(shù)量已知得樣本。?標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列組用

11、于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（例如,1:2、1:4、1:8、1:16、1:32） 0?重復(fù)數(shù)-含有相同組分與量得相同反應(yīng)數(shù)。?陰性對(duì)照-含有水或緩沖液得樣本，不含模板;也稱(chēng)為無(wú)模板對(duì)照（NTC）”。陰性對(duì)照應(yīng)不會(huì)擴(kuò)增。2）為試劑選擇 TaqMan ? Reagents （ TaqMan試劑）（包括兩個(gè)引物一個(gè)探 針）o-如果使用TaqMan試劑以檢測(cè)擴(kuò)增并定量樣本中靶得數(shù)量，則選擇 TaqMan ? Reagents （ TaqMan試劑）。TaqMan試劑包括兩個(gè)引物與一個(gè) TaqMan?探針。引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶。TaqMan探針設(shè)計(jì)用于雜交靶，并在擴(kuò)增靶時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。切記！ Applie

12、d Biosystems 不建議將 TAMRATM 染料隨 StepOneTM 系統(tǒng) 用作熒光報(bào)告基團(tuán)或淬火基團(tuán)。-如果使用 SYBR Green試劑以檢測(cè)擴(kuò)增并定量樣本中靶得數(shù)量，則選擇 SYBR? Green Reagents （ SYBR Green 試劑）。SYBR Green 試劑包括兩 個(gè)引物與SYBR Green染料。 引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶。 SYBR Green染料可在 結(jié)合到雙鏈DNA時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。SYBR Green染料通常就是添加到反應(yīng)得 SYBR Green母液得一部分。 如果使用 SYBR Green染料： 選才? Include Melt Curve （包括解鏈曲線(xiàn)

13、）以執(zhí)行擴(kuò)增靶得解鏈曲線(xiàn)分析。將 Standard （標(biāo)準(zhǔn)）選為升降溫速度。 Applied Biosystems不提供 SYBR Green試劑得Fast母液。3）為升降溫速度選擇 Standard （2 hours to plete a run）（標(biāo)準(zhǔn)（約兩小時(shí)完 成運(yùn)行）o-如果為 PCR反 應(yīng)使用Fast試齊1J,則選擇 Fast （40 Minutes to plete a Run）（快速（約40分鐘完成運(yùn)行）。-如果為PCR反應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)試劑（包括SYBR Green試劑與TaqMan試劑）, 則選擇Standard （2 Hours to plete a Run）（標(biāo)準(zhǔn)（約2小時(shí)完

14、成運(yùn)行）。4）為模板類(lèi)型選擇 gDNA （genomic DNA） （ gDNA （基因組DNA）。5）Next> （下一步）。3、設(shè)置靶在Targets （靶）屏幕上，輸入您想在PCR反應(yīng)板中定量得靶數(shù)量，然后為每個(gè) 靶設(shè)置檢測(cè)。1）單擊 How many targets do you want to quantify in the reaction plate?（您想在反應(yīng)板中定量多少靶？）字段然后輸入1（根據(jù)需要填）。注意:靶檢測(cè)表中得行數(shù)將以您輸入得數(shù)字更新。2）選才S Set Up Standards （設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框，以為靶檢測(cè)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品。建議反應(yīng)板中得每個(gè)靶檢測(cè)設(shè)置一條

15、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。注意：Set Up Standards設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框默認(rèn)情況下已選取。3）設(shè)置靶1檢測(cè)：a、單擊Enter Target Name （輸入靶名稱(chēng)）單元格，然后輸入 RNase P（示 例）。b、從Reporter （f艮告基團(tuán)）下拉菜單中，選才? FAM （默認(rèn)）。-如果要將FAMTM染料加在您用于檢測(cè)靶得 TaqMan探針得5'端,則選擇FAM-如果要將JOETM染料加在您用于檢測(cè)靶得 TaqMan探針得5'端,則選擇 JOE。-如果要將VIC?染料加在您用于檢測(cè)靶得 TaqMan探針得5'端,則選擇 VIC。-如果您正使用SYBR? Green染料以檢

16、測(cè)雙鏈 DNA,則選擇SYBR。c、從Quencher解火基團(tuán)）下拉菜單中，選才? NFQMGB （默認(rèn)）。-如果要將非熒光淬火基團(tuán)-小溝結(jié)合物加在您正用于檢測(cè)靶得TaqMan探針得3'端,則選擇NFQMGB。-如果您正使用SYBR Green染料,則選擇None （無(wú)）。4）Next> （下一步）。4、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品在Standards （標(biāo)準(zhǔn)品）屏幕上，為所有標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)輸入反應(yīng)板中得點(diǎn)數(shù)與重復(fù) 數(shù)。對(duì)于每條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，輸入起始量并選擇序列倍數(shù)。1）單擊 How many points do you need for each standard curve? （每條標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)您需要多少

17、個(gè)點(diǎn)？）字段然后輸入5。建議每條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)至少有五個(gè)稀釋點(diǎn)。2）單擊 How many replicates do you need for each point?（每個(gè)點(diǎn)您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段然后輸入3。建議每個(gè)點(diǎn)三次重復(fù)反應(yīng)。3）為RNase P樂(lè)例）檢測(cè)定義標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍：a、單擊Enter Starting Quantity （輸入起始量）字段，然后輸入10000。由于標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量得范圍會(huì)影響擴(kuò)增效率計(jì)算，因此應(yīng)仔細(xì)為您得檢測(cè)考慮標(biāo) 準(zhǔn)品數(shù)量得適當(dāng)范圍：-為了更準(zhǔn)確地測(cè)量擴(kuò)增效率，請(qǐng)使用大范圍得標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，擴(kuò)大到5個(gè)至6 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)之間。如果您為標(biāo)準(zhǔn)品指定大范圍得數(shù)量，您需使用PCR

18、產(chǎn)物或高度 濃縮得模板，如cDNA克隆-如果您得cDNA模板數(shù)量有限且/或靶就是低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄物，或已知在給定 范圍之內(nèi)，則可能需要小范圍得標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量。b、從Select Serial Factor選擇序列倍數(shù)）下列菜單中，選才？ 1:2。序列倍數(shù)用于計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所有點(diǎn)中得數(shù)量。如果您得起始數(shù)量就是最高數(shù)量，則選擇如1:2、1:3之類(lèi)得稀釋倍數(shù)。如果您得起始數(shù)量就是最低數(shù)量，則選擇如2X、3X之類(lèi)得濃縮倍數(shù)。4）查瞧Standard Curve Preview （標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)預(yù)覽）窗格。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)包含如 下點(diǎn)：10000、5000、2500、1250 與 625。5）Next> （下一步）。

19、5、設(shè)置樣本在Samples （樣本）屏幕上，輸入反應(yīng)板中要包括得樣本、重復(fù)數(shù)與陰性對(duì)照 數(shù)然后選擇樣本/靶反應(yīng)以進(jìn)行設(shè)置。1）單擊 How many samples do you want to test in the reaction plate? （您想在 反應(yīng)板中檢測(cè)多少樣本？）字段，然后輸入2。（根據(jù)需要填）2）單擊How many replicates do you need?（您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段， 然后輸入3。建議對(duì)每個(gè)樣本反應(yīng)重復(fù)三次反應(yīng)。3）單擊 How many negative controls do you need for each target assay

20、?（每 個(gè)靶檢測(cè)您需要多少陰性對(duì)照？），然后輸入3。建議對(duì)每個(gè)靶檢測(cè)進(jìn)行三次陰性對(duì)照反應(yīng)。4）4、設(shè)置樣本1:a、單擊Enter Sample Name （輸入樣本名）字段，然后輸入pop1 （用于重復(fù) 組1）。b、保留Color （顏色）字段中得默認(rèn)設(shè)置。5）設(shè)置樣本2:a、單擊Enter Sample Name （輸入樣本名）字段，然后輸入pop2 （用于重復(fù) 組2）。b、保留Color （顏色）字段中得默認(rèn)設(shè)置。6）選才A All Sample/Target Reactions （所有樣本/靶反應(yīng)）以檢測(cè)所有樣本中得 所有靶。-選才A All Sample/Target Reaction

21、s （所有樣本/靶反應(yīng)）以檢測(cè)所有樣本中得 所有靶。-選擇Specify Sample/Target Reactions （指定樣本/靶反應(yīng)）以指定每個(gè)樣本 中要檢測(cè)得靶。7）在Well Count （反應(yīng)孔數(shù)）窗格中，確認(rèn)存在：? 6個(gè)未知反應(yīng)孔U? 15個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔S? 3個(gè)陰性對(duì)照反應(yīng)孔N? 24個(gè)空反應(yīng)孔8）在View Plate Layout （查瞧檢測(cè)板布局）選項(xiàng)卡上：a、從Arrange Plate by （反應(yīng)板布局方式）下拉菜單中，選才R Rows （按行） （默認(rèn)）。b、 從 Place Negative Controls （放置陰Tt對(duì)照）下拉菜單中，選擇 Upper

22、Left （左上角）（默認(rèn)）。9）Next> （下一步）。6、設(shè)置運(yùn)行方式在Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上，查瞧默認(rèn)運(yùn)行方法得反應(yīng)體積與溫度變 化過(guò)程設(shè)置。若需要，您可調(diào)整默認(rèn)運(yùn)行方法或用Run Method （運(yùn)行方法）庫(kù)中得某種方法進(jìn)行替換。1）單擊選擇 Graphical View （圖形視圖）選項(xiàng)卡（默認(rèn)）或Tabular View （表格 視圖）選項(xiàng)卡。2）單擊Reaction Volume Per Well （每個(gè)反應(yīng)孔得反應(yīng)體積）字段，然后輸入 25山。為 反應(yīng)體積/反應(yīng)孔”輸入介于10至30得值。StepOne系統(tǒng)支持10至 30 L之間得反應(yīng)體積。3）確保溫度

23、變化過(guò)程設(shè)置顯示保持與循環(huán)階段。-確保溫度變化過(guò)程設(shè)置適合試劑。-如果正執(zhí)行一步法RTPCR擴(kuò)增，則包括一個(gè)反轉(zhuǎn)錄步驟。如果實(shí)驗(yàn)需要一個(gè)不同得溫度變化過(guò)程設(shè)置，調(diào)整溫度變化過(guò)程設(shè)置或用Run Method （運(yùn)行方法）庫(kù)中得某個(gè)溫度變化過(guò)程設(shè)置進(jìn)行替換。RunMethod（運(yùn)行方法）庫(kù)包括在StepOne軟件中。4）Next> （下一步）。7、查瞧反應(yīng)設(shè)置在Reaction Setup （反應(yīng)設(shè)置）屏幕上，選擇檢測(cè)類(lèi)型（如果使用TaqMan試 劑），然后查瞧為準(zhǔn)備PCR反應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)稀釋序列與樣本稀釋而計(jì)算得劑量。若需要,您可調(diào)整反應(yīng)體積、額外反應(yīng)體積、組分濃度、標(biāo)準(zhǔn)品濃度與 /或稀釋后樣本

24、 濃度。切記！對(duì)反應(yīng)板中得每個(gè)靶檢測(cè)執(zhí)行這些步驟。完成Reaction Mix Calculations （反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）選項(xiàng)卡1）選擇Reaction Mix Calculations （反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）選項(xiàng)卡（默認(rèn)）。2）從Select Target選擇靶）窗格中，選擇RNase P。3）從Assay Type （檢測(cè)類(lèi)型）下拉菜單中，選擇Inventoried/Made to Order （庫(kù) 存/定制）。如果正使用TaqMan試劑,選擇所使用彳4檢測(cè)類(lèi)型：-如果正使用 Applied Biosystems TaqMan? Gene Expression Assays 陣存/定 制）或

25、 Applied Biosystems Custom TaqMan? Gene Expression Assays,貝 選擇 Inventoried/Made to Order （庫(kù)存/定制）。-如果正使用 Primer Express?軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)，則選擇 Custom （定制）。4）確認(rèn)Reaction Volume Per Well （每個(gè)反應(yīng)孔得反應(yīng)體積）字段中顯示 25 （jL o為 反應(yīng)體積/反應(yīng)孔”輸入介于10至30得值。StepOne系統(tǒng)支持10至 30 L之間得反應(yīng)體積。5）確認(rèn)Excess Reaction Volume顫外反應(yīng)體積）字段中顯示10%。包括額外反應(yīng)體積以彌補(bǔ)

26、移液過(guò)程中得損失。建議至少準(zhǔn)備10%得額外反應(yīng)體積。6）在 Reactions for RNase P （ RNase &應(yīng)）窗格中：a、確認(rèn)Master Mix Concentration （母液濃度）字段中顯示2、0X。b、確認(rèn)Assay Mix Concentration （檢測(cè)預(yù)混液濃度）字段中顯示20、0X。c、查瞧PCR反應(yīng)得組分與計(jì)算得劑量。7）在 Standard Dilution Series for RNase P （ RNase P 得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列）窗格 中：a、單擊Standard Concentration in Stock（儲(chǔ)液中標(biāo)準(zhǔn)品得濃度）字段，然后輸

27、入200000b、單擊units （單位）字段然后輸入copies per皿。c、查瞧為準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列計(jì)算得劑量。完成Sample Dilution Calculations （樣本稀釋計(jì)算）選項(xiàng)卡1）選擇Sample Dilution Calculations （樣本稀釋計(jì)算）選項(xiàng)卡。2）單擊 Diluted Sample Concentration （10 X for Reaction Mix） 隔釋后樣本 濃度）（對(duì)于反應(yīng)預(yù)混液為10X），然后輸入6、6。3）從單位下拉菜單中，選才n ng/（默認(rèn)）。4）查瞧為樣本稀釋計(jì)算得劑量。8、實(shí)驗(yàn)材料訂購(gòu)在Materials List （材料

28、列表）屏幕上，查瞧建議用于準(zhǔn)備PCR反應(yīng)板得材料列 表?；蛘撸蓮?Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 產(chǎn)品倉(cāng)庫(kù)）訂購(gòu)所 建議得材料。創(chuàng)建購(gòu)物籃，向購(gòu)物列表中添加項(xiàng)目，然后登錄以提交您得訂單。您必須具有不受限制得網(wǎng)絡(luò)連接才能訪(fǎng)問(wèn) Applied Biosystems Store （AppliedBiosystems 產(chǎn)品倉(cāng)庫(kù)）。1）在 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 產(chǎn)品倉(cāng)庫(kù)）網(wǎng)站上查找靶 檢測(cè)套件：a、確保您得計(jì)算機(jī)已連接到因特網(wǎng)。b、單擊 Enter Gene Name（輸

29、入基因名）字段，輸入 RNase P,然后單擊 FindAssay （查找檢測(cè)套件）。c、在Find Assay Results （發(fā)現(xiàn)檢測(cè)套件結(jié)果）對(duì)話(huà)框中，選擇您得檢測(cè)套 件。d、單擊Apply Assay Selection （應(yīng)用檢測(cè)套件選擇）。2）完成Experiment Materials List （實(shí)驗(yàn)材料列表）窗格：a、從Display （顯示）下拉菜單中，選才A All Items （所有項(xiàng)）（默認(rèn)），然后查瞧建 議得材料。若需要，使用右側(cè)得滾動(dòng)條查瞧所有項(xiàng)。3）用于進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)得Inventoried/Made to Order檢測(cè)設(shè)計(jì)用于配合以下TaqMan?母液使用：

30、TaqMan? Fast Universal PCR Master Mix （2? ）, No AmpErase? UNG, 250次反應(yīng)，編號(hào)TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, 200 次反應(yīng)，編號(hào)TaqMan? 2 ? Universal PCR Master Mix, 2000 次反應(yīng)，編號(hào)10 包裝 TaqMan? 2 ? Universal PCR Master Mix,編號(hào)TaqMan? 2 ? Universal PCR Master Mix, No AmpErase? UNG,200 次反應(yīng), 編號(hào)TaqMan? 2? Universal

31、PCR Master Mix, No AmpErase? UNG, 2000次反應(yīng)，編號(hào)10 包裝 TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, No AmpErase? UNG,編號(hào)4)靶DNA或cDNA有幾種TaqMan與SYBR Green試劑可用于定量實(shí)驗(yàn)。a、TaqMan?試齊1JTaqMan? Fast Universal PCR Master Mix (2? ), No AmpErase? UNG, 250 次反應(yīng)TaqMan? 2 ? Universal PCR Master Mix, 200 次反應(yīng)，編號(hào)TaqMan? 2 ? Universal

32、PCR Master Mix, 2000 次反應(yīng)，編號(hào)10 包裝 TaqMan? 2 ? Universal PCR Master Mix，編號(hào)TaqMan? 2 ? Universal PCR Master Mix, No,AmpErase? UNG, 200 次反應(yīng)，編 號(hào)TaqMan? 2 ? Universal PCR Master Mix, NoAmpErase? UNG, 2000 次反應(yīng)，編 號(hào)10 包裝 TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix,No AmpErase? UNG, 編號(hào)TaqMan? PCR Core Reagents Kit, 2

33、00 次反應(yīng)，編號(hào) N8080228b、SYBR? Green 試劑Power SYBR? Green PCR Master Mix (1 mL),40 次反應(yīng)，編號(hào)Power SYBR? Green PCR Master Mix (5mL),200 次反應(yīng)，編號(hào)Power SYBR? Green PCR Master Mix(10 5mL), 2000 次反應(yīng)，編號(hào)Power SYBR? Green PCR Master Mix (50 mL),2000 次反應(yīng)，編號(hào)SYBR? Green PCR Master Mix (1mL), 40 次反應(yīng)，編號(hào)SYBR? Green PCR Mast

34、er Mix (5mL), 200 次反應(yīng)，編號(hào)SYBR? Green PCR Master Mix （50mL）, 2000 次反應(yīng)，編號(hào)SYBR? Green PCR Core Reagents, 20砍反應(yīng)，編號(hào)9、完成設(shè)計(jì)向?qū)б瓿蒁esign Wizard （設(shè)計(jì)向?qū)В┕ぷ髁鞒?，查瞧反?yīng)板布局，然后選擇一個(gè) 退出選項(xiàng)。1）在Review Plate for Experiment （查瞧實(shí)驗(yàn)得反應(yīng)板）窗口中,查瞧反應(yīng)板布 局。2）單擊 Save Experiment （保存實(shí)驗(yàn)）。3）在Save Experiment （保存實(shí)驗(yàn)）對(duì)話(huà)框中，單擊Save （保存）以接受默認(rèn)文件 名與位置

35、。示例實(shí)驗(yàn)被保存并關(guān)閉，并且您返回到Home （主頁(yè)）屏幕。二、準(zhǔn)備反應(yīng)工作如何為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)。1、準(zhǔn)備樣本稀釋在將樣本添加到最終反應(yīng)預(yù)混液之前，執(zhí)行樣本稀釋。采用 StepOneTM軟 件計(jì)算得劑量稀釋樣本。（樣本稀釋計(jì)算）根據(jù)儲(chǔ)液中得卞¥品濃度？ng/LStepone軟件計(jì)算出稀釋劑量。因?yàn)樵赟tepOne軟件中，樣本量?jī)H限于反應(yīng)總量得10%,因此需要進(jìn)行樣本稀釋。反應(yīng)總量為每次反應(yīng)25也因此樣本量為每次反應(yīng) 2、5山。根據(jù)樣本稀釋計(jì)算”表 稀釋樣本。1）所需材料用于稀釋樣本得稀釋液（TE緩沖液或水）、樣本儲(chǔ)液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2）為

36、每份擬稀釋樣本標(biāo)記一個(gè)單獨(dú)得微量離心管：Population 1、Population 23）將所需劑量得稀釋液添加到每個(gè)空反應(yīng)管內(nèi)（14、2 山）4）將所需劑量得樣本儲(chǔ)液添加到每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)。（1 L）5）振蕩每份稀釋得樣本3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）將稀釋后樣本置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。2、準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列采用StepOne軟件計(jì)算得劑量準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列。（反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）根據(jù) 儲(chǔ)液中得標(biāo)準(zhǔn)品濃度？ copies/山Stepone軟件計(jì)算出劑量。1）所需材料用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品得稀釋液（TE緩沖液或水）、標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2）為每份標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記

37、一個(gè)單獨(dú)得微量離心管：Std、 1、Std、2、Std、3、Std、4、Std、5。3）將所需劑量得稀釋液添加到每個(gè)空反應(yīng)管內(nèi):Std、 1（14、5山）、Std、2（9、1 山）、Std、3（9、1 山）、Std、4（9、1©、Std、5（9、1 山）。4）在Std、1反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液1:a振蕩儲(chǔ)液3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。b、使用新得移液槍槍頭，將3、6 L儲(chǔ)液添加到Std、1反應(yīng)管中。c 振蕩Std、1反應(yīng)管3至5秒然后短暫地離心反應(yīng)管。5）在Std、2反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液2:a、使用新得移液槍槍頭，將9、1 L稀釋液1添加到Std、2反應(yīng)管中。b、振蕩Std、2反應(yīng)管3

38、至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）在Std、3反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液3:a、使用新得移液槍槍頭，將9、1 L稀釋液2添加到Std、3反應(yīng)管中。b、振蕩Std、3反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。7）在Std、4反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液4:a、使用新得移液槍槍頭，將9、1 L稀釋液3添加到Std、4反應(yīng)管中。b、振蕩Std、4反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。8）在Std、5反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液5:a、使用新得移液槍槍頭，將9、1 L稀釋液4添加到Std、5反應(yīng)管中。b、振蕩Std、5反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。9）將標(biāo)準(zhǔn)品置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。3、準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液使用StepOne軟

39、件計(jì)算得組分與劑量準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液。（反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）若實(shí)驗(yàn)包括一個(gè)以上得靶檢測(cè)，則為每個(gè)靶檢測(cè)單獨(dú)準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液1）所需材料各反應(yīng)預(yù)混液組分微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）為反應(yīng)預(yù)混液標(biāo)記一個(gè)適當(dāng)大小得反應(yīng)管：Reaction Mix。3）將所需劑量得每種組分添加到反應(yīng)管中：母液（2、0X）12、5人、檢測(cè)母液 （20、0X）1、3山、水8、8心總劑量22、6山，加上10%得超額量2、26人共計(jì) 24、86人,24次反應(yīng)所需劑量為596、6人注意:將檢測(cè)母液置于冰柜中避光儲(chǔ)存，直到準(zhǔn)備使用。過(guò)多暴露在光線(xiàn)下會(huì)影響熒光探針。計(jì)算中包括額外劑量，以便為試劑轉(zhuǎn)移期間發(fā)生得損失提供多余劑 量

40、。建議至少準(zhǔn)備10%得超額量。4）用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋。5）短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。6）將反應(yīng)預(yù)混液置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。注意:使用之前，請(qǐng)執(zhí)行以下操作：-搖晃瓶子，徹底混合母液。-振蕩反應(yīng)管以重新懸浮檢測(cè)母液，然后短暫地離心反應(yīng)管。-將任何冷凍樣本置于冰上將其解凍。解凍時(shí)，進(jìn)行振蕩以重新懸浮樣本然后短暫地離心反應(yīng)管。4、準(zhǔn)備反應(yīng)板為每個(gè)重復(fù)組準(zhǔn)備反應(yīng)物，然后將它們轉(zhuǎn)移到反應(yīng)板。采用StepOne軟件中 顯示得反應(yīng)板布局。1）所需材料反應(yīng)預(yù)混液Reaction Mix、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、水MicroAmpTM Fast Optical 48Well

41、Reaction PlateMicroAmpTM Optical 48Well Adhesive Film微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）準(zhǔn)備靶陰性對(duì)照反應(yīng)預(yù)混液：a、向一個(gè)適當(dāng)大小得反應(yīng)管中，加入下面所列劑量得反應(yīng)預(yù)混液與水。反應(yīng)管反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（L）水量（山）1Reaction mix74、68、3b、用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋c、短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。d、向反應(yīng)板得相應(yīng)反應(yīng)孔中分別加入 25 L得陰性對(duì)照反應(yīng)預(yù)混液。3）對(duì)于每個(gè)重復(fù)組，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液：a、向適當(dāng)大小得反應(yīng)管中，加入下面所列劑量得反應(yīng)預(yù)混液與標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)管標(biāo)準(zhǔn)

42、品 反應(yīng)預(yù) 混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（山）標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品劑量（山）1Std 1Reaction mix74、6Std 18、32Std 2Reaction mix74、6Std 28、33Std 3Reaction mix74、6Std 38、34Std 4Reaction mix74、6Std 48、35Std 5Reaction mix74、6Std 58、3b、用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋c、短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。d、向反應(yīng)板得相應(yīng)反應(yīng)孔中加入 25 L得標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液。4）對(duì)于每個(gè)重復(fù)組，準(zhǔn)備未知樣本得反應(yīng)預(yù)混液：a、向適當(dāng)大小得反應(yīng)管中，加

43、入下面所列劑量得反應(yīng)預(yù)混液與樣本。反應(yīng)管未知樣本反 應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（1）樣本樣本劑量（山）1pop1Reaction mix74、6pop18、32Pop2Reaction mix74、6Pop28、3b、用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋c、短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。d、向反應(yīng)板得相應(yīng)反應(yīng)孔中加入 25 L得未知（樣本）反應(yīng)預(yù)混液。5）用孔板高透光度蓋膜密封反應(yīng)板。6）短暫地離心反應(yīng)板以除去氣泡。7）在您準(zhǔn)備好運(yùn)行實(shí)驗(yàn)之前，將反應(yīng)板置于陰暗處得冰上。注意:當(dāng)您準(zhǔn)備自己得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)：?確保您使用適當(dāng)?shù)煤牟?確保PCR反應(yīng)得安排與StepOne

44、軟件中顯示得反應(yīng)板布局一致。您可以：-接受軟件自動(dòng)生成得反應(yīng)板布局?；?使用Advanced Setup信級(jí)設(shè)置）工作流程更改軟件中得反應(yīng)板布局。三、運(yùn)行試驗(yàn)1、準(zhǔn)備運(yùn)行打開(kāi)實(shí)驗(yàn)并將密封得 MicroAmpTM Fast Optical 48Well Reaction Plate 裝載到 StepOneTM擴(kuò)增儀以準(zhǔn)備運(yùn)行。1）打開(kāi)設(shè)計(jì)得實(shí)驗(yàn)a、打開(kāi) StepOneb、從Home屏幕上，單擊Openc、在Open對(duì)話(huà)框中，導(dǎo)航到experiments文件夾（默認(rèn)）d、找到創(chuàng)建得試驗(yàn)設(shè)計(jì)，打開(kāi)。2）裝載反應(yīng)板（帶無(wú)粉手套）a、打開(kāi)擴(kuò)增儀抽屜b、將反應(yīng)載體放置在樣本加熱塊中。反應(yīng)板得方向取決于您所

45、用耗材得類(lèi) 型：?若使用一個(gè)反應(yīng)板，讓A1反應(yīng)孔位于樣本加熱塊得左后角。?若使用反應(yīng)管條帶，則將條帶置于樣本加熱塊中。c、小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。2、啟動(dòng)運(yùn)行若計(jì)算機(jī)已通過(guò)StepOne系統(tǒng)線(xiàn)纜直接連接到StepOne擴(kuò)增儀，則執(zhí)行下列 步驟。（并置啟動(dòng)）1）在StepOne軟件中，單擊Temperature Plot （溫度曲線(xiàn)）。2）單擊START RUN （啟動(dòng)運(yùn)行）3、監(jiān)視運(yùn)行1講置監(jiān)視運(yùn)行期間，定期查瞧StepOne軟件提供得所有三條曲線(xiàn)就是否存在潛在問(wèn) 題。a停止運(yùn)行在StepOne軟件中，單擊STOP RUN （停止運(yùn)行）。對(duì)話(huà)框中包括：-Stop Immediately （立即停

46、止）以立即停止運(yùn)行。-Stop after Current Cycle/Hold（當(dāng)前循環(huán)/保持階段后停止）以在當(dāng)前循環(huán)或保持階段之后停止運(yùn)行。-Cancel （取消）以繼續(xù)運(yùn)行。b、實(shí)時(shí)查瞧擴(kuò)增數(shù)據(jù)Amplification Plot （擴(kuò)增曲線(xiàn)）屏幕允許在StepOne擴(kuò)增儀運(yùn)行期間采集熒 光數(shù)據(jù)時(shí)查瞧樣本擴(kuò)增。若設(shè)置了某種方法以采集實(shí)時(shí)數(shù)據(jù) ，AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線(xiàn)）屏幕上會(huì)顯示在 View Plate Layout （查瞧反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡中所 選反應(yīng)孔得數(shù)據(jù)。擴(kuò)增曲線(xiàn)將對(duì)照歸一化染料熒光（?Rn）循環(huán)數(shù)。Amplification Plot （擴(kuò)增曲線(xiàn)）屏幕對(duì)識(shí)

47、別與檢查異常擴(kuò)增十分有用。異常擴(kuò)增可能包括以下情況：?陰性對(duì)照反應(yīng)孔中熒光增強(qiáng)。?預(yù)期循環(huán)中不存在可檢測(cè)熒光（在相同情況下使用相同試劑從先前類(lèi)似 得實(shí)驗(yàn)運(yùn)行確定）。c、實(shí)時(shí)查瞧運(yùn)行得溫度數(shù)據(jù)。運(yùn)行期間，Temperature Plot （溫度曲線(xiàn)）屏幕上實(shí)時(shí)顯示樣本加熱塊、受熱 護(hù)蓋門(mén)與樣本（已計(jì)算）得溫度。Temperature Plot （溫度曲線(xiàn)）屏幕對(duì)識(shí)別硬件故障十分有用。當(dāng)監(jiān)視TemperaturePlot （溫度曲線(xiàn)）屏幕時(shí)，觀察Sample （樣本）、Heated Cover （受熱護(hù) 蓋門(mén)）與Sample Block （樣本加熱塊）曲線(xiàn)就是否出現(xiàn)異常情況。?通常，Sample

48、（樣本）與Block （樣本加熱塊）曲線(xiàn)應(yīng)大約相互對(duì)應(yīng)。兩條曲線(xiàn)存在顯著偏差可能表示存在問(wèn)題。? Heated Cover （受熱護(hù)蓋門(mén)）曲線(xiàn)應(yīng)保持方法中指定得常溫。偏離一致溫度可能表示存在問(wèn)題。d、在Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上查瞧運(yùn)行進(jìn)度開(kāi)始運(yùn)行之后，StepOne系統(tǒng)會(huì)在Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上顯示運(yùn)行 進(jìn)度。例如對(duì)于方法得溫度變化過(guò)程報(bào)告運(yùn)行進(jìn)度。更改運(yùn)行方法（添加循環(huán)、保持或解鏈曲線(xiàn)）?在導(dǎo)航窗格中，單擊Run Method （運(yùn)行方法）。?在Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上，執(zhí)行以下任意操作-輸入要應(yīng)用于Cycling Stage （循環(huán)階段）得

49、循環(huán)數(shù)。-若您想要將解鏈曲線(xiàn)階段添加到運(yùn)行得末尾，則選擇 Add Melt Curve Stage to End （將解鏈曲線(xiàn)階段添加到末尾）。-若您想要將保持階段添加到運(yùn)行得末尾，則選擇 Add Holding Stage to End （將保持階段添加到末尾）。?單擊Send to Instrument （發(fā)送到擴(kuò)增儀）e啟用/禁用通知設(shè)置。取或取消選取Enable Notifications （啟用通知）復(fù)選框。2）遠(yuǎn)程監(jiān)視若將您得StepOne擴(kuò)增儀連接到網(wǎng)絡(luò)，您可使用StepOne軟件得遠(yuǎn)程監(jiān)視功 能從網(wǎng)絡(luò)上得任何一臺(tái)計(jì)算機(jī)上實(shí)時(shí)查瞧運(yùn)行進(jìn)度。4、卸載反應(yīng)板并傳輸數(shù)據(jù)當(dāng)StepOne

50、擴(kuò)增儀顯示Run History （運(yùn)行歷史）屏幕時(shí)，從StepOne擴(kuò)增儀上 卸載反應(yīng)板，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)以進(jìn)行分析。當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀完成一次運(yùn)行時(shí)，系統(tǒng)會(huì)將運(yùn)行詳情保存到運(yùn)行歷史 記錄，在擴(kuò)增儀完成另一次運(yùn)行之前，該運(yùn)行歷史記錄會(huì)保留在系統(tǒng)中。1）當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀觸摸屏上顯示 Run Report 行報(bào)告）屏幕時(shí)2）打開(kāi)擴(kuò)增儀抽屜。3）從樣本加熱塊中取出反應(yīng)板。4）小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。切記！不要在運(yùn)行后關(guān)閉StepOne擴(kuò)增儀電源開(kāi)關(guān)。不使用時(shí)，擴(kuò)增儀會(huì)自動(dòng)進(jìn)入休眠模式。并置數(shù)據(jù)得傳輸就是自動(dòng)傳輸。四、實(shí)驗(yàn)分析StepOneTM軟件使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1

51、、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)打開(kāi)StepOne從Home屏幕上，單擊 Open,在對(duì)話(huà)框中，導(dǎo)航到experiments 文件夾，找到創(chuàng)建得試驗(yàn)設(shè)計(jì)，打開(kāi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件，單擊Analyze （分析），軟件使用 默認(rèn)分析設(shè)置來(lái)分析數(shù)據(jù)。1）軟件元素a Experiment Menu （實(shí)驗(yàn)菜單）窗格一提供到以下軟件屏幕得鏈接：? Setup（設(shè)置）屏幕? Run（運(yùn)行）屏幕? Analysis（分析）屏幕：Amplification Plot （擴(kuò)增曲線(xiàn)）-Standard Curve 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）-Multiponent Plot （多組分曲線(xiàn)）Raw Data Plot （原始數(shù)據(jù)曲線(xiàn)）QC Summary （

52、QC 摘要）Multiple Plots View （多曲線(xiàn)視圖）b、 Plot （曲線(xiàn)）窗格為已打開(kāi)得實(shí)驗(yàn)顯示所選分析屏幕。c、View （視圖）選項(xiàng)卡為已打開(kāi)得實(shí)驗(yàn)顯示反應(yīng)板布局或反應(yīng)孔表d、Experiment （實(shí)驗(yàn)）選項(xiàng)卡一為每個(gè)打開(kāi)得實(shí)驗(yàn)顯示一個(gè)選項(xiàng)卡。2）如何選擇反應(yīng)孔要在分析屏幕上顯示特定反應(yīng)孔，在View Plate Layout （查瞧反應(yīng)板布局）選 項(xiàng)卡上選擇相應(yīng)得反應(yīng)孔，操作如下：a 要選擇某特定類(lèi)型得反應(yīng)孔，使用Select Wells With （選擇反應(yīng)孔類(lèi)型） 下拉菜單：選才S Sample （樣本）、Target （靶）或Task （任務(wù)），然后選擇樣本、靶

53、或任務(wù)名稱(chēng)。b、要選擇單個(gè)反應(yīng)孔，在反應(yīng)板布局中單擊該反應(yīng)孔。c、要選擇多個(gè)反應(yīng)孔，按住CTRL鍵并單擊、或按住Shift鍵并單擊反應(yīng) 板布局中得某反應(yīng)孔并拖移鼠標(biāo)覆蓋所需得反應(yīng)孔。d、要選擇所有48個(gè)反應(yīng)孔，單擊反應(yīng)板布局得左上角。3）如何顯示多條曲線(xiàn)使用Multiple Plots （多曲線(xiàn)）屏幕可同時(shí)顯示最多 4條曲線(xiàn)。要在Multiple Plots（多曲線(xiàn)）屏幕內(nèi)導(dǎo)航：a、 從 Experiment Menu （實(shí)驗(yàn)菜單）窗格 中，選擇 Analysis （分析）- Multiple Plots View （多曲線(xiàn)視圖）。b、要顯示四條曲線(xiàn)，單擊Show plots in a 2 X

54、2 matrix （以2 2窗格方式 顯示曲線(xiàn)）。c、要在兩行中顯示兩條曲線(xiàn)，單擊：Show plots in two rows （以?xún)尚酗@示d、要在兩列中顯示兩條曲線(xiàn)，單擊 Show plots in two columns （以?xún)闪?顯示曲線(xiàn)）。e要顯示某特定曲線(xiàn)，從每條曲線(xiàn)顯示上方得下拉菜單中選擇該曲線(xiàn)。2、查瞧標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）屏幕顯示指定為標(biāo)準(zhǔn)品得樣本得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 StepOne軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算未知靶得數(shù)量。在Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）屏幕上檢查以下回歸系數(shù)值:? Slope（斜率）/擴(kuò)增效率斜率/擴(kuò)增效率值-擴(kuò)增效率通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)曲

55、線(xiàn)中回歸線(xiàn)得斜率來(lái)計(jì)算。斜率接近-3、3表示最佳，即100% PCR擴(kuò)增效率。影響擴(kuò)增效率得因素包括：-標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍，為了獲得更準(zhǔn)確及更精確得效率測(cè)量值，使用大范圍得 標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量（5至6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)（105至106倍）。-標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)數(shù)，為了獲得更準(zhǔn)確得效率測(cè)量值，包括重復(fù)數(shù)以降低移液誤 差得影響。-PCR抑制劑反應(yīng)中得PCR抑制劑可降低擴(kuò)增效率。? F2值（相關(guān)系數(shù)）R2值表示標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸線(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)得單個(gè)Ct數(shù)據(jù)點(diǎn)之間得擬合程度。值1、00表示回歸線(xiàn)與數(shù)據(jù)點(diǎn)完全擬合。R2值0、99較理想。? G值閾值循環(huán)（Ct）就是熒光水平達(dá)到閾值時(shí)得 PCR循環(huán)數(shù)。Ct值8且 35較理想。Ct值8表明反應(yīng)中

56、有太多模板。 Ct值35表明反應(yīng)中靶得數(shù) 量太少；對(duì)于Ct值35得情況，期望更高得標(biāo)準(zhǔn)偏差。1）從 Experiment Menu （實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇 Analysis （分析） Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）。注意：如果Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）屏幕中未顯示數(shù)據(jù)，單擊Analyze （分 析）。2）在View Plate Layout （查瞧反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡上單擊反應(yīng)板布局得左上角，以在Standard Curve標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)）屏幕上顯示全部48個(gè)反應(yīng)孔。3）從Target椰）下拉菜單中，選才? All （全部）。4）從Plot Color （曲線(xiàn)顏色）下拉菜單中，選才? Default （默認(rèn)）。5）單擊Show/Hide the plot legend （顯示/隱藏曲線(xiàn)圖例）。6）查瞧標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)下面顯示得值。在示例實(shí)驗(yàn)中，靶（RNase P）得值在可接受范