多肽類藥物個人見解

1、多肽類藥物個人見解多肽類藥物氨基酸是蛋白質的基本單位，兩個以上的氨 基酸縮合形成肽鏈(polypeptide chain)o蛋白質 是機體內最重要的一類生物大分子，目前被廣泛 地作為藥物用于疾病的治療。但是，蛋白質類藥 物也有缺點，如分子量大、制備困難、存在抗原 性、體內易降解等。令人驚喜的是，人們發(fā)現某 些分子量較小的多肽同樣具有類似蛋白質的活 性，且功能更顯著。隨著對這類生物活性多肽的 進一步研究，已為新藥的研制和開發(fā)提供了一個 新的途徑。從生物學角度看，多肽和蛋白質的區(qū) 別只是前者結構小一些，后者結構大一些。在人 的生命活動中，蛋白質不斷分解變化，蛋白質分 解后形成多肽，多肽聚合又形成蛋

2、白質。在人體 中，多肽是涉及各種細胞功能的生物活性物質， 幾乎所有的細胞都能合成多肽，所有細胞又受多 肽調節(jié)。生命科學之所以將目光投向多肽，原因 恰恰在于多肽在人體內擔當的這種獨特的生理 和生化反應的信使角色。蛋白質和多肽之間在分子量上并無明確的區(qū)分，習慣上將胰島素(51個氨基酸組成，分子 量5733)視為多肽和蛋白質的界限。也有人將分 子量小于104（或2X10，）的氨基酸鏈稱為多肽。目前生物醫(yī)學在人體中已發(fā)現了 1000多種具有 活性的多肽，僅腦中就存在近40種，它們在生 物體內的濃度很低，血液中一般僅有1042 109molL,但生理活性很強，在神經、內分泌、 生殖、消化、生長等系統(tǒng)中發(fā)

3、揮著不可或缺的生 理調節(jié)作用。人們比較熟悉的有谷胱甘肽（3肽）、 催產素（9肽）、加壓素（9肽）、腦啡肽（5肽）、P- 內啡肽（31肽）、P物質（10肽）等。作為藥用的肽，通常是由幾個到二十幾個氨基 酸組成的比較短的多肽。開發(fā)和發(fā)展內源性活性 物質作為治療疾病的藥物具有重要的實用價值, 因為它是最符合人體生物學調節(jié)規(guī)律的治療手 段，可以避免許多其他類型藥物給人體帶來的不 良反應。目前，全世界已經應用于臨床的多肽類 藥物約有幾十種，包括人們熟知的胰島素、胸腺 肽、抗艾滋病新藥T20以及肽類激素等。近幾年 蛋白質/多肽類藥物市場的發(fā)展速度驚人，年增 長率達24%,與增長率僅為9%的總體醫(yī)藥市場 相

4、比，該領域令人注目。鑒于多肽生物活性高, 一些肽在人的生長發(fā)育、細胞分化、大腦活動、 腫瘤病變、免疫防御、生殖控制、抗衰防老及分 子進化等方面又具有極其特殊的功能，多肽類藥 物的研發(fā)自然成為近年生命科學的一大熱門領 域。1 .多肽藥物的優(yōu)勢多肽藥物是近年來世界新藥研究開發(fā)的熱點，也是我國生物醫(yī)藥研究的重點方向之一。與 傳統(tǒng)藥物相比，多肽藥物具有以下明顯的優(yōu)勢:(1)活性高，在很低的劑量和濃度下即可表現出顯著的高活性;(2)分子量小，相對蛋白質而言易于人工化學合成，方便進行結構改造; 合成效率高。近年來技術的進步使多肽的固相合成變得簡單，過程自動化，易 于控制;(4)副作用小。由于許多多肽藥物采

5、用 與人同源的序列,加之分子量小，無抗原性, 不易引起免疫反應。2 .常見多肽藥物分類生物技術的發(fā)展極大地促進了多肽、蛋白藥 物的研制開發(fā)，目前已有40種以上重要的治療 藥物上市，700多種生物技術藥物正進行Im 期臨床試驗或接受FDA審評，其中200種以上 的藥物進入最后的批準階段(HI期臨床與FDA評 估)。2.1 根據分泌部位分類加壓素及其衍生物：腦神經垂體素、加壓素、 糅酸加壓素、去氨精加壓素、苯賴加壓素、鳥加 壓素(POR8)等。催產素及其衍生物：催產素、去氨基催產素、催產素酒石酸等。促皮質素及其衍生物：促皮質素、鋅促皮質 素(ACTH-Zn)、磷鋅促皮質素、明膠促皮質素、 竣纖促皮

6、質素、絲賴促皮質18肽、甘精促皮質 18肽、鋅促皮質24肽、促皮質24肽、25肽、 28肽等。下丘腦垂體肽激素：促性腺素釋放激素、促甲狀腺素釋放激素、生長激素釋放激素(CHRH)、 生長激素抑制素(CHIH, 14肽)、促黑色素細胞抑制激素(MRIH)、促黑色素細胞釋放激素(MRH)、催乳素釋放激素(PRH)、催乳素抑制激素(PIH)、促皮質素釋放激素(LRH)等。消化道激素：促胃泌素34肽、17肽、14肽、 5肽、4肽，胰泌素27肽、膽囊收縮素39肽、 33肽、8肽，抑胃肽、胃動肽、血管活性肽、胰多肽、P物質、神經降壓肽、蛙皮肽14肽、 10肽等。其他激素和活性肽：胸腺素al（28肽）、胰高

7、血糖素（29肽）、降鈣素（32肽）、血管緊張肽1（10 眠肽、記憶肽、松果肽、胰蛋白酶抑制劑、舒緩 激肽（8肽）、蛙皮降壓肽（8肽）等。肽）、II （8肽）、111（7肽）、腦啡肽、內啡肽、睡2.2 根據功能分類多肽疫苗傳染性疾病，例如肝炎、流感、瘧疾和血吸蟲病等，流行很廣，危害很大。目前，雖然可用 化學藥物治療且療效較好，但治愈后再感染率很 高，在疫區(qū)需對再次感染者不停地進行治療。因 此，若要從根本上防治這些傳染性疾病，就必須 借助于疫苗。雖然滅活或減毒疫苗有一定效果, 但仍有引起感染的可能性。因此，對于危險性很 大的傳染病，如艾滋病等，人們就不敢使用滅活 或減毒疫苗，對于這類疾病來說，發(fā)展

8、合成多肽 疫苗顯得尤為重要。20世紀80年代初，Lerner提出了發(fā)展合成 多肽疫苗的方法。首先確定天然抗原（如病毒或 其亞單位）的氨基酸序列，并尋找抗原決定簇肽 段；然后合成抗原肽，并試驗其誘導產生抗體的 能力，選出具有免疫性和保護性的特異性抗原肽 制備疫苗。多肽抗原作為完整病毒的一部分，不 具備傳染疾病的危險性，并可以大量合成生產， 是未來疫苗發(fā)展的重要途徑之一。合成多肽疫苗研究的第一步是確定抗原肽， 其后的關鍵是制備出有很好免疫原性，同時又無 毒副作用的多肽抗原，并結合使用適當的佐劑， 以得到較好的免疫效果。由抗原肽制備的合成多 肽抗原主要有3類：（1）抗原肽載體復合抗原;多抗原肽抗原；

9、（3）多價合成多肽疫苗抗原。目前對人類危害極大的兩種病毒性疾病艾 滋病和丙型肝炎均無理想的疫苗，核酸疫苗和多 肽疫苗的研究結果令人鼓舞。1999年美國NIH 公布了兩種HIVJ病毒多肽疫苗，對人體進行的I期臨床試驗結果，證實兩種多肽能刺激機體產生特異性抗體和特異性細胞免疫，并有較好的安 全性。我國清華大學也證實HIVJ膜蛋白內一段 多肽有很強的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也顯 示有良好的發(fā)展前景，國外學者從丙肝病毒（HCV）外膜蛋白E2內篩選出一段多肽，它可刺激機體產生保護性抗體。其它病毒（如甲肝、麻疹、辛德畢斯病毒等）的多肽疫苗及抗腫瘤，避 孕等多肽疫苗的研究也取得了較大進展。例如, 美國學者

10、NaZ等從噬菌體肽庫內篩選出一個12 氨基酸小肽，它能特異性地與人卵子結合，阻止 精子與卵子的結合，可用于避孕疫苗?？鼓[瘤多肽 腫瘤的發(fā)生雖然是多種原因作用的結果，但最終都要涉及癌基因的表達調控。不同的腫瘤產 生時所需要的酶等調控因子不同，選擇特異性小 肽作用于腫瘤發(fā)生時所需的調控因子等，封閉其 活性位點，可防止腫瘤發(fā)生?，F在已發(fā)現很多腫 瘤相關基因及腫瘤生長調控因子，篩選與這些靶 點特異結合的多肽，已成為尋找抗癌藥物的新熱 點。美國學者發(fā)現了一個短肽（6個氨基酸），它 在體內能顯著抑制腺癌的生長，包括肺、胃及在 大腸腺癌為治療這一死亡率很高的惡性腫瘤開 辟了一條新路。流感病毒血凝素2氨基端模

11、擬肽 能進入腫瘤細胞，激活抗癌基因P53,誘導腫瘤 細胞的凋亡。P物質（10肽）的一個衍生物對小細 胞肺癌的生長有明顯的抑制作用。與正常細胞相比，腫瘤細胞對多種具有抗活性的多肽更敏感，目前對引起這種差別的原因還不完全清楚，初步認為與以下幾個因素有關: 由于腫瘤細胞的高代謝引起細胞膜電位的改 變；腫瘤細胞膜外表面含有更高的酸性磷脂;腫瘤細胞的細胞骨架或胞外基質的變化。目前 已經發(fā)現cecropin及其類似物，magainin及其 類似物，cecropmA-magainin, cecropinA-melittin雜合肽及其類似物都對腫瘤細胞具有選擇性殺 傷作用?？共《径嚯牟《靖腥竞笠话阋洑v吸附（

12、宿主細胞）、穿 入、脫殼、核酸復制，轉錄翻譯，包裝等多個階 次。阻止任一過程均可防止病毒復制。最有效的 抗病毒藥物應該是作用在病毒吸附及核酸復制 兩個階段，因此篩選抗病毒藥物主要集中在病毒 復制的這兩個階段。病毒通過與宿主細胞上的特 異受體結合吸附細胞，依賴其自身的特異蛋白酶 進行蛋白加工及核酸復制。因此可從肽庫內篩選 與宿主細胞受體結合的多肽或能與病毒蛋白酶 等活性位點結合的多肽，用于抗病毒的治療。多肽藥物可以3種不同的機制起到抗病毒 的作用。第1種是通過直接與病毒粒子相結合而 發(fā)揮作用。如a -defensins, modelin-1等對皰疹病毒的作用,polyphemusins對HIV病

13、毒的作用。 第2種是抑制病毒的繁殖,如mellitin和cecropin A對HIV病毒的作用。第3種機制是通過模仿病毒的侵染過程而起作用。如蜂毒肽及其類似物 的結構與煙草花葉病毒核衣殼與mRNA相互作 用的區(qū)域具有相似性，通過干擾病毒的組裝而對 病毒產生作用。HCV非結構蛋白3區(qū)(NS3)是一個與病毒復 制密切相關的蛋白酶，其活性位點已被確定，并 且從肽庫內篩選到一個6肽(DDIVPC)能顯著抑 制該酶活性。同樣已從肽庫內篩選到能與HIV 復制必需的逆轉錄酶結合的小肽，及能與HIV 外膜蛋白結合防止病毒進入細胞的小肽。這些小肽部分已進入臨床試驗。 多肽導向藥物 已知很多毒素(如綠膿桿菌外毒素

14、)，細胞因子(如白細胞介素系列)等有較強的腫瘤細胞毒 性，但在人類長期或大量使用時也可損傷正常細 胞。將能和腫瘤細胞特異結合的多肽與這些活性 因子進行融合，則可將這些活性因子特異性地集 中在腫瘤部位，可大大降低毒素、細胞因子的使 用濃度，降低其副作用。比如，在很多腫瘤細胞 表面存在表皮生長因子的受體，其數量較正常細 胞上的數目高幾十倍，甚至上百倍，將毒素或抗 腫瘤細胞因子與表皮生長因子融合，可將這些活 性因子特異地聚集到腫瘤細胞，國內外已有幾家 將表皮生長因子與綠膿桿菌外毒素融合表達成 功。同從肽庫內篩選出能與腫瘤抗原特異結合的 小肽，也可用于導向藥物，因其分子量小，比鼠 源性的單克隆抗體更適

15、合用于導向藥物。細胞因子模擬肽利用已知細胞因子的受體從肽庫內篩選細胞因子模擬肽，近年成為國內外研究的熱點。國 外已篩選到了人促紅細胞生成素，人促血小板生 成素，人生長激素、人神經生長因子及白細胞介 素1等多種生長因子的模擬肽，這些模擬肽的氨 基酸序列與其相應的細胞因子的氨基酸序列有 所不同，但具有細胞因子的活性，并且具有分子 量小的優(yōu)點。這些細胞因子模擬肽正處于臨床前 或臨床研究階段。.1胸腺肽胸腺五肽(thymopentin, TP5)是目前世界上處方量居第一位的免疫調節(jié)劑。TP5是人工合 成的五肽，其氨基酸序列和結構與胸腺生成素的 第3236位的氨基酸組成相同，即為TP的主 要活性部位，功

16、能與TP相同。動物實驗和臨床 研究證明胸腺五肽對免疫功能低下和自身免疫 疾病患者的免疫功能具有重要的調節(jié)作用。正是 由于胸腺五肽優(yōu)良的免疫調節(jié)功能，使其在非典 時期的醫(yī)藥市場上十分搶手。.2干擾素干擾素是哺乳動物細胞在誘導下產生的一種高活性、多功能的淋巴因子，其相對分子質量 為2.0X103干擾素作用于相應的其他同種生物 細胞，并使其獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面的 “免疫力”。它能夠抑制病毒在細胞內的增殖，加 強巨噬細胞的吞噬作用和對癌細胞的殺傷作用o 目前，人們已經利用大腸桿菌系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)成 功地高效表達了干擾素。已上市的干擾素制劑有13 種，其中 aIFN 7 種，P-IFN 2 種，y-

17、IFN 4種，取得許多國家的批準，用于臨床。.3白細胞介素白細胞介素是一類抗腫瘤免疫因子，它能夠促進T細胞的生長、增殖和分化，也能夠促進B 細胞的生長和增殖，并且能夠增強殺傷性淋巴細 胞的功能，也用于癌癥的治療。白細胞介素包括29個成員，其中白細胞介素2是含量最高的一 種。目前，重組白細胞介素2和白細胞介素3已 經上市.4集落刺激因子集落刺激因子可以分為兩類，即粒細胞集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。這類 細胞因子促進體內白細胞的增殖，增強粒細胞的 功能，調控造血功能，可用于治療腫瘤病人化療 后白細胞下降等癥狀。目前已有產品上市，年產 值達數億美元.粒細胞集落刺激因子（商品名惠爾血，粒

18、生素，欣粒生等）能促進粒細胞集落的形成，促進 造血干細胞向中性粒細胞增殖、分化。對成熟的 中性粒細胞可促進游走、吞噬、產酶、釋放活性 氧、殺菌能力和對外來異物的黏著作用。還可動 員成熟中性粒細胞從骨髓進入外周。能使早期多 能造血干細胞進入細胞周期，連日應用可促使骨 髓造血干細胞進入外周血。適用于骨髓移植后促 進中性粒細胞的升高；腫瘤、白血病化療后的中 性粒細胞減少癥；骨髓增生異常綜合征、再生障 礙性貧血伴發(fā)的中性粒細胞減少癥；先天性、特 發(fā)性中性粒細胞減少癥。重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（商品名吉姆欣）能與粒細胞及單核巨噬細胞系前體細 胞表面的特異性受體結合，促進其增殖分化，產 生中性粒細

19、胞、嗜酸性粒細胞及單核巨噬細胞。與高濃度紅細胞生成因子有協(xié)同作用，促進紅細 胞的活力。并能促進成熟細胞向外周血釋放。體 外研究表明，本品尚可促進單核一巨噬細胞對腫 瘤細胞的裂解作用。能提高機體抗腫瘤和抗感染 免疫力。.5生長激素人生長激素可用于治療侏儒癥和促進傷口愈合，動物生長激素能夠加速家禽生長，增加奶 的產量。目前，人和動物的生長激素基因都已經 在大腸桿菌中得到成功表達，并已有產品投放市 場，年產值達到6.25億美元，并在醫(yī)學和畜牧 業(yè)領域取得了很好的應用效果。.6紅細胞生成素紅細胞生成素是一種由腎臟產生的作用于骨髓的造血相關細胞因子。它可以縮短原始紅細 胞的成熟期，調節(jié)骨髓中的造血細胞含

20、量?？捎?于腎功能不全引起的貧血，放射化療引起的貧 血，以及其他一些罕見的貧血癥的治療。此外,還可用于外科手術前準備自體輸血的病人。紅細胞生成素是一種糖肽，糖基化對它的功能至關重 前，采用的方法是在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中表 達，因而成本很高，生產過程比較復雜。盡管如 此，它上市后產值仍高達每年12.25億美元，居 多種重組藥物之首。要,因此不能在大腸桿菌等原核細胞中表達。目抗菌性活性肽幾乎所有類型的生物在微生物入侵時，其機 體都會產生一些物質加以抵御，這些物質中大部 分是小分子多肽，即抗菌肽。當昆蟲受到外界環(huán) 境刺激時產生大量的具有抗菌活性的陽離子多 肽，已篩選出百余種抗菌肽。抗菌肽一般由124

21、5個氨基酸構成，來自不同物種的抗菌肽一級結構有相似之處，如含精氨酸、賴氨酸、組氨酸 等堿性氨基酸而帶有正電，呈疏水性或雙親性?？咕囊蚱浣Y構和作用方式不同可分成兩大類：一類是具有螺旋結構的線性多肽；另一類是由一 個或多個二硫鍵或硫酸連接構成的環(huán)形多肽，含 有6 折疊和（或）a 螺旋。由于其獨特的結構, 抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定、水溶性好、免疫 原性較低、作用迅速、抗菌譜廣等特點，不僅可以抑殺細菌、真菌、病毒和寄生蟲，對多種癌細 胞、轉化細胞和實體瘤也有明顯的抑制作用，且 某些抗菌肽在發(fā)揮以上作用時對正常細胞沒有 破壞作用。目前，傳統(tǒng)的抗生素大多出現了與其 相應的耐藥致病菌株，常用的抗癌藥物又

22、對“敵 我”細胞不能區(qū)分，而抗菌肽不受已產生的耐藥 性突變影響，靶菌株也不易出現耐藥性突變，另 外其獨特的選擇毒性作用和其較低的免疫原性 引起人們廣泛的興趣，使其成為新一代的抗菌、 抗癌藥物。cecropins> magainins> defensins 等許多可 形成雙親螺旋結構的多肽抗生素是通過作用于 細菌的細胞膜，在膜上形成離子通道，引起胞內 物質的外漏而殺死細菌的。通過對sarcotoxin IA的研究發(fā)現，當在脂質體中存在膽固醇時,sarcotoxin IA對其的裂解作用減弱。這可部分解釋這類多肽對真核細胞不起作用的原因。apidaecins類多肽抗生素對細菌的作用機制是

23、非裂解機制，可能是通過與膜上的手性分子相互作 用進而殺死細菌的。許多多肽抗生素除了具有抗細菌的活性外,還具有抗真菌的作用。如來源于蛙類的PGQ,dermaseptin和哺乳動物的defensins對一些人類致病真菌具有殺傷作用，其中兔defensinNP-1 對玉米的致病真菌也有作用。一些來源于植物的 多肽抗生素，如植物defensins> thionins等對多種植物致病真菌具有殺傷作用o最近,Cavallarin 等發(fā)現cecropin衍生物N末端a螺旋區(qū)域的11 個氨基酸順序與抗真菌活力有關。用于心血管疾病的多肽很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用，不僅可用作藥物，亦可用作保

24、健食品。但 由于其作用成份不能確定。其應用受到很大限 制?，F已發(fā)現很多有效成分是小分子多肽，比如 我國科學家從大豆內加工分離出的小分子活性 多肽(MWV1000),可通過小腸直接吸收，能防治 血栓，高血壓和高血脂，還能延緩衰老，提高肌 體抗腫瘤能力。來源于a和丫玉米醇溶蛋白的 玉米多肽(LeuGlmGln、Val-Ser-Pro、 Leu-Gln-Pro> Leu-Ala-Tyr 和 ValAlaTyr);來 源 于無花 果乳液 的肽類 Ala-Val-Asp-Pro-Ile-Arg, Leu-Tyr-Pro-Val-Lys和Leu.Val-Arg均有抗高血壓作用；從人參、茶 葉、銀杏葉

25、等植物內也分離出很多用于心血管疾 病的小肽。其它藥用小肽小肽藥物除在上述幾大方面已取得較大進 展外，在其它很多領域也取得一些進展。比如 stiernberg等發(fā)現一個合成肽(TP508)肽能促進 傷口血管的再生，加速皮膚深度傷口的愈合。 Pfister等發(fā)現一個小肽(RTR)4能防止堿損傷角膜內炎癥細胞的侵潤，抑制炎癥反應。Carron 等證實其篩選的2個合成肽能抑制破骨細胞對 骨質的重吸收。內嗎啡肽1是國內學者研究較深入的另一個具有開發(fā)前景的鎮(zhèn)痛多肽。具有強烈鎮(zhèn)痛活 性，其活性高于嗎啡。它存在于哺乳動物腦內, 是內源性的IX阿片受體的激動劑。內嗎啡肽 是迄今所知對U阿片受體親和力和選擇性最高

26、 的生物活性肽。由于它只含有4個氨基酸，國內 學者采用液相合成方法，方便快速、純度高，且 能大量合成。診斷用多肽 多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細胞、支原體、螺旋體等微生物和 囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強，且易于制 備，因此裝配的檢測試劑，其檢測抗體的假陰性 率和本底反應都很低，易于臨床應用?，F在用多 肽抗原裝配的抗體檢測系統(tǒng)有針對甲、乙、丙、 庚型肝炎病毒、艾滋病病毒、人巨細胞病毒、單 純皰疹病毒、風疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲、錐 蟲、萊姆病及類風濕的試劑盒。使用的多肽抗原 大部分是從相應致病體的天然蛋白內分析篩選獲得，有些是從肽庫

27、內篩選的全新小肽。品感官肽阿斯巴甜(Aspartame)作為一種非糖甜味劑 是一類開發(fā)較成功的食品感官肽。阿斯巴甜由苯 丙氨酸與天冬氨酸為原料合成，其甜度為蔗糖的200倍，可供糖尿病患者等忌糖者食用，且熱量低，可用作減肥保健品。賴氨酸二肽(如 N-Ac-Phe-Lys)被證明是有效的阿斯巴甜替代 品，因為它不含有酯的功能特性，因而在食品加 工和儲存過程中更加穩(wěn)定。我國人口眾多，食品 消費量數值驚人，甜味劑需求潛力很大。其它食品感官肽還有苦味肽、酸味肽、咸味 肽、增強風味肽、苦味掩蓋肽、抗氧化肽、表面 活性肽等。這些食品感官肽能夠模擬、掩蓋和增進口感。如咸味肽作為無鈉調味劑，可為糖尿病 患者和高

28、血壓患者所用，也可作為保健食品。而 風味肽則可作為加工食品的風味和香味的前體, 起到增強風味的作用。表面活性肽則可作為食品 的穩(wěn)定劑和乳化劑。食品感官肽在我國生產和應 用剛剛起步，但市場潛力巨大，值得進一步研究 與開發(fā)。3 .多肽藥物的穩(wěn)定性問題及其對策:多肽因子、蛋白藥物主要通過降解、排泄、以及受體介導的內吞等作用在體內被清除。其中 分子量小于20kDa的多肽因子在代謝過程中易 由腎小球濾過；通過腎小管時多肽因子又被其中 的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而半衰期 短。為維持一定的療效需要大劑量反復用藥，長 期的頻繁注射不僅增加了病人的痛苦而且易引 發(fā)一系列副反應。近幾年各國學者主要從化學修

29、飾、基因融合、點突變以及制劑改造等方面著手 進行長效多肽藥物的研究。3.1 引起多肽不穩(wěn)定的原因3.1.1 脫酰胺反應：在脫酰反應中， Asn/GIn殘基水解形成Asp/Glu o非酶催化 的脫酰胺反應與環(huán)境條件和多肽結構有關，提高pH值、升高溫度都有利于脫酰胺反應 的進行。在Asn-GIy-結構中的酰胺基團更易 水解，位于分子表面的酰胺基團也比分子內 部的酰胺基團易水解。312氧化：多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過氧化物的污染，二 是多肽的自發(fā)氧化。在所有的氨基酸殘基 中，Met、Cys 和 His、Trp> Tyr 等最易氧 化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對氧化也都有 影響

30、。3.1.2 解：多肽中的肽鍵易水解斷裂。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷 裂，尤其是AspPro和AspGly肽鍵。3.1.3 成錯誤的二硫鍵：二硫鍵之間或二硫鍵與疏基之間發(fā)生交換可形成錯誤的 二硫鍵，導致三級結構改變和活性喪失。3.1.5 消旋：除Gly外，所有氨基酸殘基的a碳原子都是手性的，易在堿催化下發(fā)生 消旋反應。其中Asp殘基最易發(fā)生消旋反 應。3.1.6 B 消除：B 消除是指氨基酸殘基中B碳原子上基團的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr等殘基都可通過B 消除降解。在 堿性PH下易發(fā)生B -消除，溫度和金屬離子 對其也有影響。3.1.7 變性、吸附、聚集或沉淀：變

31、性一 般都與三級結構以及二級結構的破壞有關。在變性狀態(tài)，多肽往往更易發(fā)生化學反應, 活性難以恢復。在多肽變性過程中，首先形 成中間體。通常中間體的溶解度低，易于聚集，形成聚集體，進而形成肉眼可見的沉淀。 蛋白質的表面吸附是其貯存、使用過程中遇 到的另一個令人頭痛的問題，如riL-2在進 行曲灌注時會吸附在管道表面，造成活性損 失。3.2 增加多肽藥物穩(wěn)定性的方法改進多肽的自身結構：.1定點突變 通過基因工程手段替換引起多 肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)定性的殘 基，可提高多肽的穩(wěn)定性。利用寡核昔酸引物、PCR介導的定點突變及盒式突變等方法使蛋白藥物中影響活性或穩(wěn) 定性的氨基酸發(fā)生突變可以有效

32、提高蛋白穩(wěn)定 性，增加藥物半衰期。例如白介素2是一條133個氨基酸組成的多肽鏈，其中呈游離狀態(tài)的Cys-125易形成錯誤的二硫鍵配對或形成分子之間的二聚體影響活性和穩(wěn)定性，將Cys-125用Ser或Ala取代后生物活性比正常高1倍，體內半衰期由數分鐘提高到l.2h。重組組織型纖溶酶 源激活劑(rtPA)能高效特異地溶解血栓，目前兩 種新型tPA(K2.tPA、TNK-tPA)已被歐洲和美國 批準上市。K24PA保留了 tPAl-3及176527位氨基酸的肽段，缺失K1區(qū)、E區(qū)和F區(qū)使之 成為單鏈多肽，無糖基側鏈，半衰期延長45 倍；TNK-tPA突變體是將tPA 103位Thr變成Asn ；1

33、17 位 Asn 變成 Gin ；Lys296-His297-Arg298.Arg299 替換成 4 個 Ala,該突變體血清清除速率降低4倍左右，已獲得美 國FDA批準進入市場。自然界中亦存在天然突 變體，使其具有更高的生物學活性和更長的血漿 半衰期，如載脂蛋白AI(apoAI)的米蘭突變體 (AIM),即 apoAI 的 Argl73 突變?yōu)?Cysl73,兩個AIM單體通過Cysl73之間的二硫鍵形成同源 二聚體，血漿半衰期得到進一步延長。.2化學修飾選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可提高多肽的生物活性，提高熱穩(wěn)定性, 抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延長體內半衰 期。化學修飾是延長蛋白藥

34、物半衰期的一個有效 途徑，其中應用最為廣泛的修飾劑是單甲氧基聚 乙烯二醇(methoxypoly ethylene glycol, mPEG),其次是多糖類如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉等；同源 蛋白質、人工合成多肽類如白蛋白、聚丙氨酸等;長鏈脂肪酸類以及聚烯屬煌基化合物、聚酸酊 等。PEG是惰性、兩親、不帶電荷的柔性聚合 物，分子量隨聚合程度而變化(150kDa),有線 性和支鏈兩種構型，其中線性單甲氧基聚乙烯醇(mPEG)已經FDA批準作為許多藥物的安全載體。mPEG通過共價鍵與蛋白質連接，對蛋白表 面氨基進行修飾以有效地改變多肽、蛋白藥物在 體內的分布和藥物學特性。目前mPEG修飾已 應用于40

35、多種不同蛋白的修飾如豬血清白蛋白 (BSA)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素2(IL2)等。PEG修飾后血漿半衰期一般可延長幾倍至幾十倍甚至是上百倍，但大部分蛋白的免 疫原性也有所降低，而蛋白的生物活性也有不同 程度降低。這可能是由于PEG大分子在蛋白分 子周圍形成一層外殼阻礙了免疫細胞與蛋白的接觸保護了蛋白，掩蓋了蛋白酶識別位點避免蛋 白酶降解的發(fā)生，但同時也使蛋白的活性位點受 到影響。中國藥科大學田泓等用聚乙二醇修飾干 擾素a 2的研究表明活性損失與修飾率有關，修 飾率保持在30%以內時生物活性保持較好。Yamasaki等在PEG修飾重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)中發(fā)

36、現修飾位點的多少(即1分 子rhG-CSF與幾分子PEG結合)對半衰期的延 長方面并無多大影響，但修飾位點少活性損失就 相對少一些；為保持蛋白的生物活性，采取位點 特異性修飾即將蛋白功能結構域中易與PEG結 合的氨基酸殘基換成功能相似不干擾蛋白與PEG結合的氨基酸殘基如賴氨酸替換成精氨酸。PEG修飾應用十分廣泛，它對酶、多肽、受體、抗體片斷等均能實現偶聯(lián)以延長半衰期，抗體藥 物是繼疫苗之后的第二大生物技術藥物產業(yè)，但 是異體抗體容易產生免疫識別而被清除，經PEG 修飾后就可得到明顯改善，從而為抗體更廣泛地 應用于疾病的治療提供了基礎。隨著研究的不斷 深入，不少PEG修飾蛋白藥物已經上市或者進

37、入臨床。另外，掩蔽多肽分子的末端竣基或/和 氨基基團，也可以對抗外肽酶，減少水解作用。多糖和白蛋白作為化學修飾劑也有成功范 例：用于治療血栓的葡聚糖-鏈激酶已在俄羅斯 上市；白蛋白已作為多種蛋白藥物的載體，白蛋 白SOD半衰期由5min提高到6h；白蛋白GH 半衰期由5min提高23h,將rhG-CSF通過異 雙功能試劑聚乙二醇與白蛋白共價偶聯(lián)，使G-CSF的體內清除速度降低約6倍。也有將蛋 白藥物與抗體偶聯(lián)來延長藥物半衰期的報道。但 是化學修飾是完全隨機的，帶來的產物不均一性 及藥物活性的降低似乎是不可避免的，為此有人 提出采用酶法進行位點特異性修飾。對于修飾劑 的活化方法、修飾位點、修飾率

38、、修飾反應時間 等都需要深入研究。.3基因融合通過基因融合技術增加多肽和蛋白藥物分子量或改變與受體的親和性等原理延長藥物半 衰期。人血清白蛋白（HSA）是現有天然載體蛋白 之一，并且是血液中含量最高的單一蛋白（達40g/L）,是人體血漿的主要成分，在體內有維持 血液滲透壓，運輸營養(yǎng)和其它重要生物物質的作 用，具有無免疫原性，人體相容性好，分子量大 （約為66kDa）,半衰期長（達兩周）等穩(wěn)定劑和多肽運載蛋白的必需性質，它已成功地在哺乳動物 細胞和酵母中實現高效表達。日本Green Cross公司酵母表達的hsa已完成m期臨床實驗和規(guī) ?；a的準備，臨床實驗證明酵母表達的HSA 與天然的HSA在效果和安全性方面完全一致。1990年英國delta公司首先將白蛋白用于基因融合提