醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指引

1、醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南（2010版）無(wú)菌檢驗(yàn)是無(wú)菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過(guò)程中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 具檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn) 結(jié)果判定及檢驗(yàn)人員業(yè)務(wù)能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。 作為無(wú)菌醫(yī)療器械生 產(chǎn)企業(yè)，其無(wú)菌檢驗(yàn)工作應(yīng)由本企業(yè)獨(dú)立完成。本指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員增強(qiáng)對(duì)無(wú)菌檢驗(yàn)相關(guān)知識(shí)的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)和規(guī)范全市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員對(duì)醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)過(guò)程控制水平的監(jiān) 督檢查工作，同時(shí)，為醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)（以下簡(jiǎn)稱生產(chǎn)企業(yè)）在無(wú)菌檢驗(yàn)的過(guò)程管理 要求提供參考和依據(jù)。當(dāng)國(guó)家相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、檢查要求發(fā)生變化時(shí)，應(yīng)重新修訂本指南。一、適用范圍本指南適用于北京市藥品監(jiān)督管理局組織、實(shí)施

2、的醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證核 發(fā)、變更、換證等現(xiàn)場(chǎng)檢查、醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系考核、醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范 檢查、醫(yī)療器械生產(chǎn)日常監(jiān)督等各項(xiàng)涉無(wú)菌檢驗(yàn)的檢查。二、檢查內(nèi)容檢查人員應(yīng)在充分了解生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)活動(dòng)的情況下，對(duì)其無(wú)菌檢驗(yàn)過(guò)程的控 制水平進(jìn)行客觀的檢查和評(píng)價(jià)。一般情況下，檢查人員可按照以下順序開(kāi)展檢查工作，并適時(shí)做好相關(guān)記錄：1、了解產(chǎn)品特性及生產(chǎn)企業(yè)選擇的無(wú)菌檢驗(yàn)方法。 常見(jiàn)的產(chǎn)品無(wú)菌檢查法包括直 接接種法和薄膜過(guò)濾法。當(dāng)建立產(chǎn)品的無(wú)菌檢查方法時(shí)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證， 以證明所采用的方法能夠給出正確的結(jié)果。若該產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)， 檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)按

3、供試品無(wú)菌檢查的規(guī)定及有關(guān)要求進(jìn)行操作。 對(duì)藥 典規(guī)定的每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。2、了解檢驗(yàn)人員的專業(yè)背景、培訓(xùn)情況及工作經(jīng)歷?？赏ㄟ^(guò)查看學(xué)歷證書(shū)、培訓(xùn) 證書(shū)或當(dāng)面詢問(wèn)檢驗(yàn)人員的方式，檢查無(wú)菌檢驗(yàn)人員是否具備微生物專業(yè)知識(shí)， 并經(jīng)過(guò) 無(wú)菌技術(shù)的培訓(xùn)。3、現(xiàn)場(chǎng)察看無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室。無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10000級(jí)下的局部潔凈度100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)（如在萬(wàn)級(jí)潔凈間內(nèi)配置超凈工作臺(tái)等） 中進(jìn)行，其全過(guò)程必須 嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期監(jiān)測(cè)。4、現(xiàn)場(chǎng)察看無(wú)菌試驗(yàn)所需的設(shè)備和器具。其中，主要設(shè)備包括：恒溫培養(yǎng)箱（真

4、菌、細(xì)菌）、恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器、電熱 干燥箱、電子天平、光學(xué)顯微鏡、集菌儀、過(guò)濾裝置（無(wú)油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、 微孔濾膜、夾子）等；（從試驗(yàn)安全性考慮，建議陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)使用生物安全柜）主要器具有：試管及試管架、酒精燈、75%乙醇棉、滅菌刻度吸管（1ml）、滅菌平 皿（9cm）、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、銀子等。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)采用可靠方法對(duì)與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓力蒸汽滅菌器 內(nèi)121c 30分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi)160c 2小時(shí)。器具滅菌后必須做好標(biāo)識(shí)，標(biāo)明滅 菌的時(shí)間和使用有效期。器皿在滅菌后，最多1周即用完。檢查時(shí)還應(yīng)注意清點(diǎn)培養(yǎng)皿 的個(gè)數(shù)，與試驗(yàn)記錄中反映的培養(yǎng)基

5、個(gè)數(shù)是否一致。5、對(duì)照生產(chǎn)企業(yè)有關(guān)無(wú)菌試驗(yàn)的管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件，要求檢驗(yàn) 人員當(dāng)場(chǎng)操作或口述無(wú)菌檢驗(yàn)的過(guò)程。（1）培養(yǎng)基制備生產(chǎn)企業(yè)可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水 培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2c25C、 避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般 可在1年內(nèi)使用。無(wú)菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無(wú)菌性 檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn) 行。（2）供試品的無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法

6、。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾 法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒 性。無(wú)菌操作時(shí)，對(duì)供試品容器表面應(yīng)用適宜的消毒液進(jìn)行徹底消毒，如果供試品容器 內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無(wú)菌器材（如帶有除菌過(guò)濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)入無(wú) 菌空氣，再按無(wú)菌操作起開(kāi)容器取出內(nèi)容物。（3）培養(yǎng)及觀察含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生 長(zhǎng)。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng) 14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種

7、至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色， 鏡檢，判斷是否有菌。在觀察試驗(yàn)結(jié)果的過(guò)程中，還應(yīng)考慮假陰性的影響。其中影響假陰性發(fā)生的因素有： 培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長(zhǎng)（促生長(zhǎng)試驗(yàn)）；在無(wú)菌試驗(yàn)中，產(chǎn)品中釋放出了殺菌 或微生物電解的物質(zhì)（消除抑菌物質(zhì)）；從滅菌處理到培養(yǎng)有一定的時(shí)間問(wèn)隔（確定滅 菌后產(chǎn)品的儲(chǔ)存條件及儲(chǔ)存時(shí)間）。（4）結(jié)果判斷生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供 試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn) 結(jié)果無(wú)效，

8、即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有 菌生長(zhǎng)，否則試驗(yàn)無(wú)效。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效：無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及 環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求； 回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引 起微生物污染的因素；供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后， 確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使 用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無(wú)菌生長(zhǎng)， 判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。6、查閱試驗(yàn)記錄。完整的試驗(yàn)記錄應(yīng)明確包含下列幾類信息：（1）樣品記錄，至少應(yīng)包括：取樣日期、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣

9、品批號(hào)、取樣 地點(diǎn)、取樣方式、取樣人、原始試驗(yàn)記錄序號(hào)。（2）滅菌物品制作記錄培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基批號(hào)、培養(yǎng)基用量（g）、蒸儲(chǔ)水用量（ml）、培養(yǎng) 基分裝數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、滅菌時(shí)間、制作人、培養(yǎng)基存放地點(diǎn) 和有效期等。器具：器具名稱、器具數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、滅菌時(shí)間、制 作人、器具存放地點(diǎn)、有效期等。（3）原始試驗(yàn)記錄，至少應(yīng)包括：記錄名稱、記錄序號(hào)、樣品名稱、樣品唯一性 標(biāo)識(shí)（例如：樣品號(hào)）、樣品規(guī)格、樣品批號(hào)、滅菌批號(hào)、樣品數(shù)量、取樣日期、檢驗(yàn)日期、檢驗(yàn)依據(jù)、主要試驗(yàn)設(shè)備及器具、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)環(huán)境條件、試驗(yàn)結(jié)果（每日觀 察的結(jié)果）、試驗(yàn)結(jié)論、檢測(cè)

10、人、復(fù)核人等。（4）廢棄物處理記錄，至少應(yīng)包括：廢棄物形態(tài)（固體、液體）、廢棄物數(shù)量、滅 菌時(shí)間和壓力、經(jīng)辦人、處理日期等。三、其它應(yīng)注意的問(wèn)題1、生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性：試驗(yàn)樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過(guò)程 和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機(jī)的。試驗(yàn)樣品的選擇和處理技術(shù)應(yīng)明確， 以免對(duì)樣 品上所含的微生物的數(shù)量和種類造成污染和改變。試驗(yàn)樣品可以選擇制造過(guò)程中的不合 格產(chǎn)品，它們應(yīng)該代表這個(gè)生產(chǎn)批的加工程序和條件。 用于試驗(yàn)的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會(huì)影 響無(wú)菌測(cè)試的有效性。2、生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過(guò)程要采取防止污染措施，確保試驗(yàn)結(jié)果的 可靠性。選取制作供試品的試驗(yàn)樣品時(shí)，樣品包裝須完好

11、無(wú)損，尤其是只有一層包裝的 樣品。進(jìn)入無(wú)菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或 緩沖問(wèn)）拆除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。3、無(wú)菌檢驗(yàn)中接觸供試品的試驗(yàn)用具溫度不能過(guò)高以防可能存在的菌被燙死。對(duì) 不同種類和不同批次的產(chǎn)品，在拆包裝及夾取樣品時(shí)，應(yīng)更換試驗(yàn)用具（如：剪刀、鑲 子）。4、進(jìn)入無(wú)菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應(yīng)采用適用的方法進(jìn)行消毒 處理（如：紫外燈照射不少于30分鐘），以避免將外包裝污染的微生物帶入無(wú)菌檢驗(yàn)室。 出具試驗(yàn)結(jié)果后，所有培養(yǎng)物須經(jīng)121c高壓滅菌30分鐘的處理。5、由于無(wú)菌檢驗(yàn)時(shí)間跨度較長(zhǎng)，因此過(guò)程的記錄應(yīng)能夠完整體現(xiàn)試驗(yàn)的全過(guò)程， 對(duì)于在試驗(yàn)過(guò)程

12、中出現(xiàn)的各種情況，均應(yīng)在記錄中客觀反映。參考資料一：常見(jiàn)的名詞解釋1、滅菌：殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過(guò)程。目前國(guó)際上規(guī)定，滅 菌過(guò)程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。2、微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實(shí)體，包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒。3、無(wú)菌技術(shù)：是指在微生物試驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾 的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無(wú)菌環(huán)境設(shè)施、無(wú)菌試驗(yàn)器材以及無(wú)菌操作。4、無(wú)菌操作：是指在無(wú)菌環(huán)境條件下，在對(duì)無(wú)菌制品或無(wú)菌器械進(jìn)行檢驗(yàn)的過(guò)程 中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。5、培養(yǎng)條件：用于促進(jìn)微生物發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基

13、和培養(yǎng)方式的組合。6、需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。7、厭氧菌：在代謝中，沒(méi)有氧的條件下才能生存的微生物。8、抑細(xì)菌/抑霉菌試驗(yàn)：用選定的微生物來(lái)演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生 物的繁殖。9、促生長(zhǎng)試驗(yàn)：用于證明生長(zhǎng)培養(yǎng)基能夠支持微生物生長(zhǎng)的技術(shù)操作。10、假陰性：實(shí)際陽(yáng)性的無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陰性。11、假陽(yáng)性：實(shí)際陰性的無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陽(yáng)性。12、生物指示物：對(duì)特定滅菌工藝有確定的抗力，可供使用的微生物檢驗(yàn)器材。13、化學(xué)指示物：根據(jù)暴露于某種滅菌工藝所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化，在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定工藝參數(shù)上顯示變化的指示器材。14、無(wú)菌保證水平（SAD :滅菌后產(chǎn)品上存在

14、單個(gè)活微生物的概率。參考資料二：無(wú)菌室空氣中菌落數(shù)的檢查無(wú)菌室在消毒處理完畢后，應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)。方法如下：取直徑約90mn©養(yǎng)皿，無(wú)菌操作注入融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約 20mL在30 C35c培養(yǎng)48小時(shí)證明無(wú) 菌后，取3只培養(yǎng)皿在無(wú)菌室操作臺(tái)或超凈工作臺(tái)平均位置打開(kāi)上蓋，暴露 30分鐘后 蓋好，置30 C35c培養(yǎng)48小時(shí)后取出檢查，3只雙碟上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均不得超過(guò) 1個(gè)。無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法同上。在試驗(yàn)開(kāi)始進(jìn)行時(shí)打開(kāi)平皿 蓋，至試驗(yàn)結(jié)束蓋好照上法培養(yǎng)，應(yīng)符合上述要求。參考資料三：供試品數(shù)量的選擇檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定

15、外，出廠產(chǎn)品按藥典附錄Xin B中表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3 中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的供試品用量。一般情況下，供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過(guò)濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加 供試品1支（或瓶）作陽(yáng)性對(duì)照用。執(zhí)行GB/T14233.2的供試品數(shù)量應(yīng)滿足同一批號(hào)3 11個(gè)單位供試品。檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接 種的供試品量按表2、表3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基， 則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直

16、接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò) 濾。表1批出廠產(chǎn)品最少量檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個(gè)）每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量注射劑<10010%£ 4個(gè)（取較多者）100V N< 50010個(gè)5002M 20個(gè)（取較少者）大體積注射劑（ 100ml）2M10個(gè)（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品<2005M 2個(gè)（取較多者）20010個(gè)桶裝固體原料<4每個(gè)容器4V N< 5020%£ 4個(gè)容器（取較多者）>502M10個(gè)容器（取較多者）醫(yī)療器具10< 10010%£ 4件（取較多者）100V N< 5

17、0010件5002M20件（取較少者）注:若每個(gè)容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍表2上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品量V每支樣品接入每管培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量(ml)的最少樣品量（瓶或支）<1全量201<V< 5105<V<202ml1020< V< 505ml1050< V< 10010ml1050<V< 100（靜脈給藥）10100< V< 5006V> 500500ml6每種培養(yǎng)基各接種10支供試品.表3上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量M（瓶或支）每支樣品接入每

18、管培養(yǎng)基的最少樣品量最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）M< 50mg全量2050mg M< 300mg10300mg M< 5g150mg10M> 5g500mg10一次性使用含藥產(chǎn)品整個(gè)產(chǎn)品10每種培養(yǎng)基各接種10支供試品桶裝固體原料的最少檢驗(yàn)數(shù)量為 4個(gè)包裝參考資料四:培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)應(yīng)注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3035c 14天；改良馬丁培養(yǎng)基2328c 14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、制造方法、潛在的微生物 污染來(lái)源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進(jìn)行分裝、 滅菌。1、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酪陳（胰酶水解）15.0g、酵母浸出

19、粉5.0g、葡萄糖5.0g、氯化鈉2.5g、L-胱氨 酸0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液1.0 ml、硫乙醇酸鈉0.5g（或硫乙醇酸0.3ml）、 瓊脂 0.75g、水 1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸， 濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié) pH值使滅菌后為7.1 ±0.2。分裝至適 宜的容器中，具裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/2 o滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過(guò)培養(yǎng)基深 度的1/5 ,否則，須經(jīng)100 C水浴加熱至粉紅色消失（不超過(guò)20分鐘），迅速冷卻

20、， 只限加熱一次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置 30 C35 c培養(yǎng)。2、改良馬丁培養(yǎng)基陳5.0g、磷酸氫二鉀1.0g、酵母浸出粉2.0g、硫酸鎂0.5g、葡萄糖20.0g、水 1000 ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH值約為6.8,煮沸，加入葡萄 糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié) pH值使滅菌后為6.4 ±0.2,分裝，滅菌。改良馬丁培養(yǎng)基置 23 c28c培養(yǎng)。3、選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗(yàn)證試驗(yàn)。4、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基陳10.0g、氯化鈉5.0g、牛肉

21、浸出粉3.0g、水1000 ml取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié) pH值使滅菌后為7.2 ±0.2，分裝，滅菌加入14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.25、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法,±0.2 ,分裝，滅菌。6、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，加入 14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4 土 0.2 ,分裝，滅菌。培養(yǎng)基 的適用性檢查1、無(wú)菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于 5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。2、靈敏度檢查菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò) 5代(從菌種保存中心獲得 的冷

22、凍干燥菌種為第0代)，試驗(yàn)用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保存技術(shù)進(jìn)行保存， 以保證試 驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10 104枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis )CMCC B) 63 501生抱梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64 941白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98 001黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98 0033、菌液制備

23、接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中， 30c35c培養(yǎng)18小時(shí)24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328c培養(yǎng)2448小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液 制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu (菌落形成單位)的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328c培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05 % (v/v)聚山梨酯80白0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用 適宜的方法吸出抱子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含 0.05

24、% (v/v)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯 化鈉溶液制成每1ml含抱子數(shù)小于100cfu的抱子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28 c可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲 霉抱子懸液可保存在28C,在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。4、培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡 萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、生抱梭菌各 2支，另1支不接種作為空白對(duì)照， 培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、 黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。5、結(jié)果判定空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加

25、菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合 規(guī)定。方法驗(yàn)證試驗(yàn)1、菌種及菌液制備除大腸埃希菌(Escherichia coli ) CMCC(B) 4 4102外，金黃色葡萄球菌、枯 草芽抱桿菌、生抱梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液 制備同金黃色葡萄球菌。2、薄膜過(guò)濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗 液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬 丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn) 菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)35天，各試驗(yàn)菌同法操作。3、

26、直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌、生抱梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基 4管，分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑 曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量，另1管作為對(duì)照，按置規(guī)定的 溫度培養(yǎng)35天。4、結(jié)果判斷與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好， 則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn) 量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn) 行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則說(shuō)明供試品的該

27、檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的 用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn) 行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。供試品處理及接種培養(yǎng)基直接接種法：每個(gè)供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬 丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積 不得大于培養(yǎng)基體積的10%同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于 15ml,改良 馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。薄膜過(guò)濾法：將供試液混勻，過(guò)濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑， 須用適量 的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過(guò)濾器，分別

28、將 100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如采用一般薄膜過(guò)濾器，取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬 丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份做陽(yáng)性對(duì)照用。薄膜過(guò)濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過(guò)濾器， 也可使用一般薄膜過(guò)濾器。無(wú)菌檢查用 的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45仙01直徑約為50mm根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材 質(zhì)?？股毓┰嚻窇?yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅 菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。參考資料八：對(duì)照試驗(yàn)1、陽(yáng)性對(duì)照：一般情況下，供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過(guò)濾法，應(yīng)增加 1/2的最 小檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)性對(duì)

29、照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無(wú)菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容 器接種的樣品量作陽(yáng)性對(duì)照用。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：無(wú)抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供 試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌； 抗厭氧菌的供試品，以生抱梭菌為對(duì)照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)，加菌量小于100cfu ,供試品用量同供試品無(wú)菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)4872小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。2、陰性對(duì)照：供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作 為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。3 、稀釋液、沖洗液

30、及其制備方法稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。(1) 0.1%蛋白陳水溶液 取蛋白陳1.0g,加水1000ml,微溫溶解，濾清，調(diào)節(jié)pH 值至7.1 ±0.2 ,分裝，滅菌。(2) pH7.0氯化鈉-蛋白凍緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g ,磷酸氫二鈉7.23g,氯化 鈉4.30g,蛋白陳1.0g,加水1000ml,微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。(3) 根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。 如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。參考資料九：參考標(biāo)準(zhǔn) 中華人民共和國(guó)藥典GB/T14233.2醫(yī)用輸液、輸血、注

31、射器具檢驗(yàn)方法第2部分生物學(xué)試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB50346生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范GB/T1629如16294醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法ISO11737-2醫(yī)療器械的滅菌 微生物方法 第2部分：滅菌過(guò)程定義、驗(yàn)證和保持 中的無(wú)菌檢測(cè)世界很大，風(fēng)景很美；人生苦短，不要讓自己在陰影里蜷縮和爬行。應(yīng)該淡然鎮(zhèn)定，用心靈的陽(yáng)光驅(qū)散迷霧，走出陰影，微笑 而行，勇敢地走出自己人生的風(fēng)景！人們?cè)诔砷L(zhǎng)與成功的路途中，往往由于心理的陰影，導(dǎo)致兩種不同的結(jié)果：有些人可能會(huì)因生活的不順暢怨天尤人，煩惱重重，精神萎靡不振，人生黯淡無(wú)光；有人可能會(huì)在逆境中頑強(qiáng)的拼

32、搏和成長(zhǎng)，歷練出若谷的胸懷，搏取到驕人的成就。只有在磨難中成長(zhǎng)和成功的人們，才更懂得生活，才更能體味出世態(tài)的炎涼甘苦，才更能闖出精彩的人生。陰影是人生的一部分。在人生的陽(yáng)光背后，有陰影不一定都是壞事。我們應(yīng)該感激傷害過(guò)自己的人，是他們讓你的人生與眾不同；感激為難你的人，是他們磨煉了你的心志；感激絆倒你的人，是他們強(qiáng)化了你的雙腿；感激欺騙你的人，是他們?cè)鰪?qiáng)了你的智慧；感激蔑視你的人，是他們警醒了你的自尊；感激遺棄你的人，是他們教會(huì)了你該獨(dú)立。人生若要走向成功，有好多的陰影需要消除。必須消除自卑的陰影：自卑，是人生的一大陰影。我們要以一種平和的心態(tài)對(duì)待自己。不要總把注意力始終停留在自己的短處上，你

33、停留的時(shí)間越長(zhǎng)，自卑心就越重，灰色的陰影就越多、越濃。必須消除受挫的陰影：真正的強(qiáng)者，不但要學(xué)會(huì)在順境中穩(wěn)步前行，更重要的是學(xué)會(huì)消除逆境中的陰影。真正的強(qiáng)者，不會(huì)因幸運(yùn)而沾沾自喜，固步自封，也不會(huì)因厄運(yùn)而一蹶不振，昏昏庸庸，而應(yīng)該從逆境中找到光亮，時(shí)時(shí)校準(zhǔn)自己前進(jìn)的目標(biāo)和方向，一往直前，從從容容。必須消除貪婪的陰影：知足者常樂(lè)，不知足者能進(jìn)取，知足與不知足都蘊(yùn)涵著辯證法的哲理。貪婪的人永不知足，寡欲的人一身輕松。人世間，凡事都想求全，但凡事不可能求全；凡事都應(yīng)知足，因?yàn)橹挥兄?，才能開(kāi)開(kāi)心心，才能掙脫貪婪的韁繩。假如過(guò)于貪婪，只會(huì)加重人們的心理負(fù)擔(dān)，使自己永遠(yuǎn)處于無(wú)盡的煩惱之中！必須消除無(wú)事生

34、非的陰影：本來(lái)已經(jīng)身家百萬(wàn)，你卻奢求千萬(wàn)；本來(lái)已經(jīng)兒女雙全，你卻奢求千金一對(duì)，成雙兒男；本來(lái)已經(jīng)事業(yè)有成，你還依然好高鷲遠(yuǎn)。你貪欲無(wú)盡，你奢求無(wú)限；本是眾人眼中的佼佼者，你卻憂郁連連；本來(lái)圓圓滿滿，你卻無(wú)事生非，庸人自擾，畫(huà)牢自鉆圈。你為何不能快快樂(lè)樂(lè)，陽(yáng)光一點(diǎn)？ ！四季更替，不可改變；花開(kāi)花落，順其自然；月缺月圓，規(guī)律使然。若遇人生之陰影，要勇敢面對(duì)，積極消除。擁抱陽(yáng)光，微笑向暖，你一定會(huì)快樂(lè)無(wú)限！著名專欄作家哈理斯和朋友在報(bào)攤上買(mǎi)報(bào)紙，朋友禮貌地對(duì)報(bào)販說(shuō)了聲“謝謝”，但報(bào)販卻冷口冷臉，沒(méi)發(fā)一言。這家伙態(tài)度很差，是不是？他們繼續(xù)前行時(shí)，哈理斯問(wèn)道。他每天都是這樣的?！迸笥颜f(shuō)?！澳敲茨銥槭裁催€是對(duì)他那么客氣？”哈理斯問(wèn)。朋友答：“為什么我要讓他決定我的行為？每個(gè)人心中都有把“快樂(lè)的鑰匙”，但我們卻常在不知不覺(jué)中把它交給別人掌管。一位女士抱怨道："我活得很不快樂(lè)，因?yàn)橄壬３霾畈辉诩摇！彼芽鞓?lè)的鑰匙放在先生手里。一位媽媽說(shuō)：“我的孩子不聽(tīng)話，讓我很生氣！”她把鑰匙交在孩子手中。男人可能說(shuō)：”上司不賞識(shí)我，所以我情緒低落?！边@把快樂(lè)鑰匙又被塞在老板手里。婆婆說(shuō)：“我的媳婦不孝順，我真命苦!這些人都做了相同的決定，就是讓別人來(lái)控制自己的心情。當(dāng)我們?nèi)菰S別人掌控我們的情緒時(shí)，我們便