DNA測(cè)序-概述發(fā)展史原理

1、DNA測(cè)序-概述發(fā)展史，原理，方法，常見問題分析DNA測(cè)序技術(shù)-發(fā)展歷史 1.70年代末，WalterGilbert發(fā)明化學(xué)法、FrederickSanger發(fā)明雙脫氧終止法手動(dòng)測(cè)序，同位素標(biāo)記2.80年代中期，出現(xiàn)自動(dòng)測(cè)序儀（應(yīng)用雙脫氧終止法原理）、熒光代替同位素，計(jì)算機(jī)圖象識(shí)別3.90年代中期，測(cè)序儀重大改進(jìn)、集束化的毛細(xì)管電泳代替凝膠電泳4.2001年完成人類基因組框架圖DNA測(cè)序技術(shù)-測(cè)序原理1.化學(xué)修飾法測(cè)序原理2. Sanger法測(cè)序的原理化學(xué)修飾法測(cè)序原理 化學(xué)試劑處理末段DNA片段，造成堿基的特異性切割，產(chǎn)生一組具有各種不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳分離?；瘜W(xué)切割反

2、應(yīng)：包括堿基的修飾修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去在失去堿基的糖環(huán)處 DNA斷裂。 Sanger法測(cè)序的原理 就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。 終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核

3、苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。 DNA測(cè)序技術(shù)-方法概述 生成互相獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點(diǎn)，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個(gè)堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會(huì)均等，因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長(zhǎng)度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。在可以區(qū)分長(zhǎng)度僅差一個(gè)核苷酸的不同DNA分子的條件下，對(duì)各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測(cè)序凝膠中若干個(gè)相鄰的泳道上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序

4、。DNA測(cè)序技術(shù)-常見問題分析測(cè)序無信號(hào) 處理辦法：測(cè)序無信號(hào)的原因有很多，其中最大的可能性是引物與模板沒有結(jié)合，這種情況下要先檢查模板上是否有引物的位點(diǎn)，建議更換引物或者模板。質(zhì)粒雙克隆 處理辦法：雙克隆的現(xiàn)象主要發(fā)生在質(zhì)粒測(cè)序中，載體序列的峰型比較單一，插入片段開始出現(xiàn)雜峰；PCR測(cè)序也可能出現(xiàn)這種情況，主要是因?yàn)橛袃蓚€(gè)以上大小相差不多的片段引起的。對(duì)于質(zhì)粒，出現(xiàn)這種情況有兩種可能，一是挑克隆時(shí)不小心挑了兩個(gè)以上的克隆，另外一個(gè)原因就是有兩個(gè)片段同時(shí)插入同一個(gè)載體，對(duì)于前一種情況，重新挑克隆即可，后一種情況，一方面可以重新挑克隆，另外也可以將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后再挑單克隆，可能會(huì)改善。對(duì)于PCR 產(chǎn)

5、物，由于大小相差不多，無法用Agarose的方式分離，只有進(jìn)行克隆后測(cè)序 PCR雙克隆 POLY 結(jié)構(gòu) polyT poly C 處理辦法：我們?cè)跍y(cè)序結(jié)果中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)連續(xù)的poly G.C.A.T之后有的中斷，有的會(huì)出現(xiàn)峰型比較雜亂的情況，無可用序列。這種情況下只有從反向進(jìn)行測(cè)序。 引物不純或者發(fā)生降解 處理辦法：測(cè)序?qū)σ镆蟊容^嚴(yán)格，要求純度要達(dá)到99以上，如果引物不純或者發(fā)生降解，測(cè)序峰圖會(huì)比較雜亂，無可用序列，這種情況下只有更換引物引物與模板有多結(jié)合位點(diǎn) 處理辦法：如果引物與模板有兩個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)，就會(huì)出現(xiàn)峰型雜亂無章，無可用序列的現(xiàn)象，這種情況只有更換測(cè)序引物，如果是質(zhì)粒，使用的是通

6、用引物測(cè)序，可用換另外的引物或者請(qǐng)客戶提供插入片段的引物進(jìn)行測(cè)序，如果是PCR測(cè)序，只有用反向引物測(cè)序，或者建議客戶克隆后用通用引物進(jìn)行測(cè)序重復(fù)序列 處理辦法：樣品中出現(xiàn)重復(fù)序列，目前來說沒有好的辦法，只有從反向測(cè)序，如果PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)重復(fù)序列，裝到載體里要比PCR產(chǎn)物直接測(cè)序要好一些，但對(duì)于較長(zhǎng)的重復(fù)序列，測(cè)序還是一個(gè)難題，沒有什么好的辦法模板不純 處理辦法：主要發(fā)生在PCR產(chǎn)物上，一方面可能是產(chǎn)物沒有純化，另外就是純化效果不好，一般情況下，我們建議客戶對(duì)PCR產(chǎn)物盡量進(jìn)行割膠純化，如果片段相差不大，最好克隆后測(cè)序。 堿基發(fā)生缺失 缺失一個(gè)堿基 缺失兩個(gè)堿基 處理辦法：堿基缺失，主要發(fā)生在PCR產(chǎn)物測(cè)序中，遇到這種情況，克隆后測(cè)序會(huì)是一個(gè)比較好的解決方法。 測(cè)序發(fā)生中斷 處理辦法：這種情況通常是由于樣品中存在特殊結(jié)構(gòu)，DNA雙鏈無法打開，PCR