抗體的制備方法與原理

1、抗體的制備方法與原理一、抗血清的制備有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價高）的抗體。（一）用于免疫的動物作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適 齡，健壯，無感染性疾患，最好為 /雄性，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在 免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以23kg為宜。

2、（二）免疫途徑免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或 背部多點皮內(nèi)注射，每點注射 0.1ml 左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、 毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。（三）佐劑由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在 注射抗原的同時，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐 劑。佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用

3、，從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是福氏佐劑（ Freund adjuvant ）,其成分通常是羊毛脂 1 份、石臘油 5 份，羊毛脂與石臘 油的比例，視需要可調(diào)整為 1 : 29 （V/V ），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入120mg卡介苗就成為完全佐劑。配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4 'C下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐 劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗34mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰

4、水上 510min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液， 另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢 查合格后即以其中一注射器作注射用。（四）免疫方法抗原劑量，首次劑量為 300500gg,加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每23周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml ，加強(qiáng)免疫時不必注射百日咳疫苗。在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取23ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達(dá)到 預(yù)期效價，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時為止（圖 2-3 ）。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放

5、血制備 抗血清。圖 2-3 抗體反應(yīng)（五）抗血清的采集與保存家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動物， 因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、 動脈取血， 鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也 可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人 捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓， 30s 后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面 剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集3040ml。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次

6、放血。頸動脈放血時，將兔仰臥， 固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。收集的血液置于室溫下 1h左右，凝固后，置 4°C下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心， 4000rpm,1 0min。在無菌條件，吸出血清，分裝（ 0.050.2ml ），貯于-40 C以下冰箱，或凍干后貯存于 4。C冰箱 保存。（六）抗血清質(zhì)量的評價在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都 可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價 后，才可使用所取得的抗血清。1

7、 效價抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測定。 前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。（ 1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育 24h 后，測定其結(jié)合率。通常 以結(jié)合率為 50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為 50%時的稀釋度為 1：15000 ，則該血清的 效價就是 1 ：15000 ?？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所 用稀釋液的成分及其 pH 等因素的影響，在工作中必須引起注意。（

8、測定方法見第 8 章 ）（2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判 斷抗血清中是否有抗體及其濃度。球脂板的制備： 100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到 15g 的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全 溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65 'C左右時，加入疊氮鈉（NaN3 ），使其在溶液中的濃度為 0.1%。 用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約 3mm 厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔（圖 2-4）。 中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50gl，周圍各孔內(nèi)分別加入 50gl 1 : 2、1: 4、1: 8、1: 16、1 : 3

9、2及不稀釋的抗血清， 37C 下孵育 24h ，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖 2-5）。圖 2-4 雙向擴(kuò)散模型圖 2-5 免疫擴(kuò)散試驗2特異性測定抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗 血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近 似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0 ），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。S=y/ZX100%S :交叉反應(yīng)率，y: IC50時抗

10、原濃度，Z : IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。如某抗原的 IC50 濃度為 90Pg/ 管，而一些近似抗原物質(zhì) IC50 濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清 與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。3親合力在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié) 合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol ）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)， K=1/H，H

11、是最小檢 出量，通常，K的范圍在1081012L/mol之間，也有高達(dá) 1014L/mol的。計算親合常數(shù)的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。七）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。（1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動物的數(shù)量。（2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子 的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。（3） 制備的免疫原是否符合要求， 可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮, 并加以改進(jìn)。（4）所用的佐劑是否

12、合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。（5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。（6）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求， 動物的健康情況是否良好等。二、單克隆抗體的制備1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成 的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血 清學(xué)的研究進(jìn)入了一個高度精確的新紀(jì)元。免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用

13、它免疫動物將產(chǎn)生對各個決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個產(chǎn)生 抗體的細(xì)胞與一個骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫 球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆 抗體（McAb ）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。表2 3單克隆抗體（McAb ）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較項目常規(guī)免疫血清抗體McAb抗體產(chǎn)生細(xì)胞多克隆性單克隆性抗體的結(jié)合力特異性識別多種抗原決定簇特異性識別單一抗原決定簇免疫球蛋白類別及亞類不均一性，質(zhì)地混雜同一類屬，質(zhì)地純一特異性與親合力批與批之間不同特異性高，抗體均一

14、有效抗體含量0.01 0.1mg/ml （小鼠腹水）0.55.0mg/ml（小鼠腹水）0.510.0 gg/ml （培養(yǎng)物上清液）用于常規(guī)免疫學(xué)實驗可用單抗組合應(yīng)用抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu)（沉淀反應(yīng)）容易形成一般難形成抗原抗體反應(yīng)抗體混雜，形成 2分子反應(yīng)困難，不可逆可形成2分子反應(yīng)，可逆單克隆抗體的制備方法如下。（一）動物的選擇與免疫1 動物的選擇 純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。2 免疫方案選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要般在融合前

15、兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏 完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫 抗原150川加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般 0.81ml,0.2ml/點）J 3周后第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip （腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml ）J 3周后第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip （57天后采血測其效價）J 2 3 周加強(qiáng)免疫，劑量50500g為宜，ip或iv （靜脈內(nèi)注射）J 3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免

16、疫方案也不斷有所更新，如：將可溶性抗原顆粒 化或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基 礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對抗原 的反應(yīng)性。（2）顆粒抗原免疫性強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量 為12X107個細(xì)胞。初次免疫 lxi07/0.5ml ipJ 2 3周后第二次免疫 lxi07/0.5ml ipJ 3周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）ixi07/0.5ml ip或ivJ取脾融合（二）細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合前準(zhǔn)備（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物

17、屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種 雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。表2-4用于融合試驗的主要骨髓瘤細(xì)胞系名稱來源耐受藥物Ig鏈H LP3/X63-Ag8(X63)BALB/C骨髓瘤MOPC-218-氮鳥嘌吟r1KP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鳥嘌吟P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88-氮鳥嘌吟K （不分泌型）P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)（X63X BALB/C 脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌吟SP2/0-Ag14(SP2/0)（X63X BALB/C 脾細(xì)胞）雜交

18、瘤8-氮鳥嘌吟F0BALB/C骨髓瘤8-氮鳥嘌吟S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脫氧尿嘧啶核苷MPC11-45.6TG1.7BALB/C骨髓瘤MPC-116-巰鳥嘌吟r2b K210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鳥嘌吟KGM15006TG-A12人骨髓瘤 GM15006-巰鳥嘌吟r1KU-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鳥嘌吟£入骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640 , DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在 10%20%，細(xì)胞濃度以1045X105/ml為宜，最大濃度不得超過 106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時

19、，可按 1 : 31 : 10的比例傳代。每35天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用 8-氮鳥嘌吟進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞 有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2X104或105

20、細(xì)胞/孔。2.細(xì)胞融合的步驟（1 ）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，610周拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，35min用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜J用無菌注射器注入56ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）J反復(fù)沖洗，吸出沖洗液J沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5 6minJlxi05/ml用 20% 小牛血清（ NCS ）或胎牛血清（ FCS ）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至J加入96孔板，1001/孔J放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)（ 2 ）制備免疫脾細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫 3 天后小鼠拉頸處死J無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次J脾臟研碎

21、，過不銹鋼篩網(wǎng)J離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗 2 次計數(shù)J取 108 脾淋巴細(xì)胞懸液備用（3）制備骨髓瘤細(xì)胞取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心J用無血清培養(yǎng)液洗 2 次J計數(shù)，取得X 107細(xì)胞備用（4）融合 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按 1 ：1 0或1 ：5的比例混合在一起，在 50ml 離心管中用無血清不完全培養(yǎng) 液洗 1 次，離心， 1200rpm,8min; 棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（ PEG ）濃度。輕輕 彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。 90s內(nèi)加入37 C預(yù)溫的1ml 45%PEG （分子量4000 ）溶液，邊加邊輕微搖動。37 C水浴作用90s < 加37。C預(yù)溫的不完全培

22、養(yǎng)液以終止 PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 和 6ml 。 離心， 800rpm, 6min 。 充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。 將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100gL 一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。 將培養(yǎng)板置37'C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測1 HAT 選擇雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng) PEG 處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。 在 HAT 選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時， 由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激 酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶， 故不

23、能生長繁殖， 而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶， 在 HAT 選擇培養(yǎng)液可 以生長繁殖。在用HAT選擇培養(yǎng)12天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，34天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持710天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間， 雜交瘤細(xì)胞布滿孔底 1/10 面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng) 期間，一般每23天換一半培養(yǎng)液。2抗體的檢測檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞 McAb的

24、檢測。（2）酶聯(lián)免疫 吸附試驗（ ELISA ）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等 McAb 的檢測。（ 3）免疫熒光試驗適合于細(xì)胞表面 抗原的 McAb 的檢測。（ 4）其它如間接血凝試驗、細(xì)胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。（四）雜交瘤的克隆化雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。 因為經(jīng)過 HAT 篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔 內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì) 胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要 克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否

25、則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體 非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會 使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染 色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』姆椒ê芏啵畛Ｓ玫氖怯邢尴♂尫ê蛙洯傊桨宸?。1 有限稀釋法克?。?1 ）克隆前 1 天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。（3）調(diào)整細(xì)胞為310個細(xì)胞/ml。（4） 取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100gU孵育于37 C、5%CO2孵箱 中。(5) 在第7天換液，以后每23天

26、換液1次(6) 89天可見 細(xì)胞克隆形成，及時檢測抗體活性。( 7 )將陽性孔的細(xì)胞移至 24 孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。( 8 )每個克隆應(yīng)盡快凍存。2 軟瓊脂培養(yǎng)法克隆( 1 )軟瓊脂的配制：含有 20%NCS (小牛血清)的 2 倍濃縮的 RPMI1640 。 1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42 'C預(yù)熱。 0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42 C保 溫。(2) 用上述 0.5% 瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞) 15ml 傾注于直徑為 9cm 的平皿中，在室溫中待凝固后作 為基底層備用。(3) 按 100/ml， 500/ml 或 5000/m

27、l 等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。(4) 1ml 0.5%瓊脂液(42 C預(yù)熱)在室溫中分別與 1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。(5) 混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min ，使其凝固，孵育于 37C 、5%CO2 孵箱中。(6) 45天 后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。( 7 )檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。(五) 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1 雜交瘤細(xì)胞的凍存及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗 體能力的喪失等等

28、。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1X106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變， 在 24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)， 當(dāng)長滿孔底時， 一孔就可以裝一 支安瓿凍存。細(xì)胞凍存液： 50%小牛血清； 40%不完全培養(yǎng)液； 10%DMSO (二甲基亞砜)凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0C后放入-70 'C超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。 也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。 凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇， 檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性， 在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。2 .細(xì)胞復(fù)蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37 C水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37C 、 5%CO2 孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時，檢測抗體活性。（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：（1 ）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為1060g/ml,如果大量生產(chǎn)，費用較高。（2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。 實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按 13X107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共24 點。待腫