人參皂苷Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制討論0001

1、人參皂音Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力 的影響及機(jī)制討論我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，聯(lián)合化療和生物治 療有助于提高患者的5年生存率，然而，其藥物本身的毒副作用 極大限制了其應(yīng)用范圍。隨著傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的復(fù)興，越來(lái)越多的中藥 以及中藥單體被應(yīng)用于臨床科學(xué)試驗(yàn)。人參皂音Rh2是人參中分離提純的一種單體，具在各種腫瘤的相關(guān)研究中有著較為顯著的 作用，研究表明：Rh2能有效抑制人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721人結(jié)腸 癌細(xì)胞Caco-2和HT-29、小鼠宮頸癌細(xì)胞 U14人食管癌細(xì)胞 Eca-109、馬立克氏病腫瘤細(xì)胞系 MSB4人白血病多藥耐藥(MDR) 細(xì)胞K562/VCR的增殖，提高機(jī)體免疫力

2、，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo) 致腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。然而，針對(duì)人參皂音Rh2對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究，目前尚無(wú)研究報(bào)道。目前，體外研究腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力主要采用Transwell實(shí)驗(yàn)。Transwell實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)體外腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力來(lái)判 斷腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的高低。本研究擬采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人參皂音Rh2對(duì)體外結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響， 并初步探討其分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1 細(xì)胞和試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo株由香港科技大學(xué)贈(zèng)送；Rh2購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司(CatNo.A0241 ,純度大于982.6mg/g),溶于 二甲基亞碉（DMSO中配成10

3、mmol/L母液分裝凍存?zhèn)溆茫凰募谆?氮嚏鹽（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、液體培養(yǎng)基 RPMI-1640和細(xì)胞培養(yǎng)用2.5g/L胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；膠原預(yù) 包被的 Transwell（CatNo.3422） 購(gòu)自美國(guó) Corning 公司；兔抗人 -Tubulin（BM1453）、-catenin（BA0426） 、CD44（BA0321）基質(zhì)金 屬蛋白酶 MMP2（BA3716）基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑J TIMP2（BA0576-2） 和E-Cadherin（BA0475-2）抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公 司。1.2 主要儀器BoxunSW-CJ-2F型雙人雙面凈

4、化工作臺(tái)（中國(guó)上海博迅實(shí)業(yè)有 限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;ThermoFisherScientific 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó) 賽默飛世爾科技公司）;MoticAE2000倒置顯微鏡（中國(guó)麥克奧迪實(shí) 業(yè)集團(tuán)有限公司）;IX71 熒光顯微鏡（日本 Olympus公 司）;iMark680 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Bio-Rad 電泳轉(zhuǎn)膜儀 （美國(guó)Bio-Rad公司）等。1.3 MTT法測(cè)定不同濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響5103/孔LoVo細(xì)胞接種 于96孔板內(nèi)，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，加入 0、5、10、20、40、 60mol/LRh2分別處理24、48、72h,每個(gè)濃度做6個(gè)平行孔，采 用酶

5、聯(lián)免疫檢測(cè)儀于 490nm處測(cè)取每孔的吸光度（D）值。1.4 Rh2 對(duì) LoVo細(xì)胞遷移的影響將細(xì)胞密度為5105個(gè)/mL的LoVo細(xì)胞鋪于 24孔板（每孔500L）上，加入含體積分?jǐn)?shù)10%臺(tái)牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)1624h,使形成單層細(xì)胞，換成無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜；用200L移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈一字劃痕，用磷酸 鹽緩沖液（PBS）清洗3次；加入5、10、20、40、60mol/L無(wú)血清培 養(yǎng)基配制Rh2溶液，平行2個(gè)樣本，孵育24h,在倒置熒光顯微鏡 下觀察并拍照。最后通過(guò)計(jì)數(shù)爬入一字劃痕空白區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù) 來(lái)反映細(xì)胞的遷移能力。1.5 Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影

6、響待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用PBS和無(wú)血清培養(yǎng)基先后洗滌1次；用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為 2105/mL,在24孔板（下室）加入600L含體積分?jǐn)?shù)15燦清的培養(yǎng) 基;上室用70L無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)箱孵育 3min,吸棄培養(yǎng)基后加入 經(jīng)過(guò)不同濃度的人參皂音 Rh2處理的100L細(xì)胞懸液；繼續(xù)在孵箱 培養(yǎng)24h,用鏡子小心取出chamber,吸干上室液體，移到預(yù)先加 入約800L甲醇的孔中；室溫固定30min,取出chamber,吸干上室 固定液，移到預(yù)先加入約800LGiemsa染液的孔中；室溫染色30min, 輕輕用PBS沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber,吸去上室液體，

7、用濕棉 棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，用小鏡子小心揭下膜，底 面朝上晾干；移至載玻片上，顯微鏡下隨機(jī)取9個(gè)大小一致的視野 計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。最后通過(guò)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能 力。1.6 Westernblot 檢測(cè)CD44 MMP2TIMP2、ECadherin 和-catenin 表達(dá)具體方法參 見(jiàn)文獻(xiàn)，對(duì)Rh2處理后的細(xì)胞進(jìn)行裂解提取蛋白，經(jīng)十二烷基硫 酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印好的聚偏 二氟乙烯（PVDF）膜封閉后依次加入相應(yīng)一抗和二抗，膜入發(fā)光液中孵育后，用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行掃描，最后對(duì)蛋 白條帶進(jìn)行灰度值分析。1.7 統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用S

8、PSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 差(xs)表示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)法分析；多組間的比較采 用單因數(shù)方差分析法分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)法分析。 按=0.05水平，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1 Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞活性的影響為了排除藥物的細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖作用對(duì)遷移和轉(zhuǎn)移功能 的影響，首先采用MTT法檢測(cè)不同濃度 Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的影 響。表1結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，采用濃度為5、10、20、40mol/LRh2處理LoVo細(xì)胞24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制， 差異無(wú) 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)Rh2濃度mol/L處理24h、濃度 mol

9、/L處理48h、 濃度mol/L處理72h時(shí)，LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01),提示人參皂音 Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞活力 的影響有時(shí)間和濃度依賴性。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，把 Rh2作用濃 度控制在40mol/L以內(nèi)，作用時(shí)間為24h進(jìn)行研究。2.2 Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果顯示：560mol/L濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移的影響結(jié)果， 隨著藥物濃度增加對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制增強(qiáng)，20mol/L以上濃度的Rh2處理LoVo細(xì)胞24h,與空白對(duì)照組比較有顯著抑制作用 (P0.05)。2.3 Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能的影響結(jié)果顯示：560mol/L

10、濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，隨著藥物濃度增加對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制增強(qiáng)，20mol/L以上濃度的Rh2處理LoVo細(xì)胞24h,與空白對(duì)照組比較有顯著抑制作用 (P0.05),結(jié)果與抑制遷移能力一致。2.4 Rh2 對(duì) CD44 MMP-2TIMP-2、E-Cadherin、-catenin 蛋白表達(dá)的影響560mol/L的Rh2對(duì)各蛋白表達(dá)的影響，隨著Rh2藥物濃度的 升高，與空白對(duì)照組比較，CD44 MMP清白表達(dá)水平顯著下降(P0.05) , TIMP2、E-Cadherin、-catenin 蛋白表達(dá)水平顯著上升 (P0.05)。3討論結(jié)腸癌是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，晚期治療效果不

11、佳，惡 性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是最終導(dǎo)致患者死亡的主要原因。人參皂 音Rh2單體能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，逆轉(zhuǎn)其異常分化， 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移能力，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能提高療效、減少副作 用。本研究結(jié)果顯示：一定濃度的人參皂音Rh2能顯著抑制LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，且抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)， 結(jié)果與陶麗華、樸麗花、Kim和姚興軍等關(guān)于人參皂音 Rh2能顯著 抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力的報(bào)道相一致。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 能力與腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)的某些分子密切相關(guān)。-catenin 和E-Cadherin基因介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附，與細(xì)胞黏附分子 CD44相互作用，它們的低表達(dá)有助于腫瘤

12、細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移 18-20。而細(xì)胞基底膜的降解是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，基質(zhì) 金屬蛋白酶(MMPs舊組織抑制因子(TIMP)的平衡對(duì)維持細(xì)胞基底膜的完整具有重要作用。上調(diào) -catenin、E-Cadherin基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞黏附，下調(diào) MMP并同時(shí)上調(diào)TIMP2基因表達(dá)，阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并進(jìn)而降低與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移黏附分子 CD44基因的 表達(dá)，可以起到抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性之一就是腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，惡 性腫瘤從原位增殖性病變發(fā)展到侵襲、轉(zhuǎn)移等復(fù)雜過(guò)程，其與降 解酶類、黏附分子、癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力及其受體等多種原因都分不 開(kāi)，細(xì)胞外基質(zhì)的降解、基底膜完整性的破壞

13、，是腫瘤細(xì)胞完成 浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的先決條件。阻止腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)擴(kuò)散的天然屏障是基底 膜，正常基底膜是由IV型膠原等成分構(gòu)成的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，固有 細(xì)胞不能正常通過(guò)。細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要由蛋白水解酶來(lái)完成， 基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP是一類鋅離子依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，能夠降解基底膜，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPS舌性的主要調(diào)節(jié)因子是組織金屬蛋白酶抑制劑 （TIMPs） , TIMPs能夠與激活 狀態(tài)的 MMPs即TIMP2與MMP2吉合，從而能夠抑制 MMPS勺產(chǎn)生 及其活性，是腫瘤發(fā)生惡變與轉(zhuǎn)移的阻抑因素。陳磊峰等研究證 實(shí)在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中降低 MMP的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞侵襲和 遷移。王文祥等

14、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 TMIP2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌伴淋 巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，即伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中TMIP2的表達(dá)減弱。盧錦娥等研究說(shuō)明在宮頸癌演變過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)TIMP2表達(dá)水平的上調(diào)從而起到抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移特性。本研究 結(jié)果表明：隨著Rh2藥物濃度的升高，MMP21白表達(dá)水平下降， TIMP2蛋白表達(dá)水平上升，二者維持在一個(gè)相對(duì)平衡穩(wěn)定的狀態(tài)， 阻止了細(xì)胞外基質(zhì)的降解， 從而抑制了人結(jié)腸癌細(xì)胞 LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。E-Cadherin是廣泛存在于各類上皮細(xì)胞中的鈣依賴性跨膜糖 蛋白，主要介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，除具有調(diào)節(jié)胚胎組織的 發(fā)育、組織形成、參與細(xì)胞與細(xì)胞間信息傳遞交流

15、等作用外，對(duì) 促進(jìn)細(xì)胞的黏附聚集、維持上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性、維持細(xì)胞極性 和參與分化調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。E-Cadherin在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)缺失使細(xì)胞間的同質(zhì)黏附力下降，導(dǎo)致腫瘤易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。包俊 杰等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從正常乳腺組織發(fā)展到乳腺癌組織再到腋窩 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織的過(guò)程中，E-Cadherin表達(dá)逐漸減少。翁密霞等 也通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ECadherin的下調(diào)與缺失和非小細(xì)胞型肺癌 的進(jìn)展、分化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。吳繼鋒等的研究結(jié)果顯示， E-Cadherin表達(dá)與腫瘤的類型及分化有關(guān)，惡性程度越高、分化 越差的腫瘤其E-Cadherin喪失越明顯。本研究結(jié)果表明：E-Cadherin蛋白表達(dá)

16、水平與 Rh2藥物濃度呈正相關(guān)，也證明了 Rh2 在抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞 LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移方面的作用。-catenin主要位于細(xì)胞膜，主要功能為介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和參 與基因的表達(dá)。李進(jìn)展等研究發(fā)現(xiàn)，-catenin 在胃癌組織中的低表達(dá)率提示其與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，而E-Cadherin與-catenin的正相關(guān)表達(dá)與協(xié)同作用提示了它們?cè)谀[瘤惡性轉(zhuǎn)移中的意義。本研究結(jié)果中，隨著Rh2藥物濃度的升高，E-Cadherin與-catenin 的表達(dá)也呈正相關(guān)性的增長(zhǎng)， 為Rh2抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷 移和轉(zhuǎn)移提示重要意義。CD44分子作為一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白的黏附分子，分布十 分廣泛。其主

17、要參與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的特異性粘連過(guò)程，在細(xì)胞的黏附、血管的形成和腫瘤的浸潤(rùn)和增殖中發(fā)揮重要作用姚杰等通過(guò)對(duì)肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中CD44的表達(dá)狀態(tài)的研究,發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶CD44表達(dá)與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié) CD44表達(dá)呈正相關(guān)，提示患者 肺癌病灶中的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物 CD44表達(dá)越高，其發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移 的風(fēng)險(xiǎn)也就越高。本研究結(jié)果中，CD44蛋白表達(dá)水平隨著 Rh2藥物濃度的升高而下降，再次驗(yàn)證了Rh2在抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞 LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移方面的作用。近年來(lái)，不止一種中藥成方或中藥單體被用于研究其對(duì)人結(jié) 腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移能力的影響，例如安昌勇等研究證實(shí)了柳皮素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞 LoVo細(xì)胞處理48h后，LoVo細(xì)胞增殖、 侵襲能力受到明顯抑制，其半數(shù)